Summary
Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.
Abstract
Il mouse corneale MICROPOCKET test è un test robusto e quantitativa in vivo per valutare l'angiogenesi. Utilizzando pellet a lento rilascio standardizzate, contenenti fattori di crescita specifici che innescano la crescita dei vasi sanguigni in tutta la cornea naturalmente avascolare, angiogenesi può essere misurato e quantificato. In questo test la risposta angiogenica è generato nel corso di diversi giorni, a seconda del tipo e della dose di fattore di crescita utilizzato. L'induzione di neovascolarizzazione è comunemente attivata tramite fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) o fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Combinando questi fattori di crescita con sucralfato e hydron (poly-HEMA (poli (metacrilato di 2-idrossietil))) e colare il composto in pellet, possono essere impiantati chirurgicamente nell'occhio topo. Questi pellet uniformi lentamente rilasciano i fattori di crescita nell'arco di cinque o sei giorni (bFGF o VEGF, rispettivamente) consentendo risposta angiogenica sufficiente richiesta per zona nave quantification utilizzando una lampada a fessura. Questo test può essere utilizzato per diverse applicazioni, tra cui la valutazione dei farmaci modulatori angiogenici o trattamenti così come il confronto tra diversi background genetici che influenzano l'angiogenesi. Un investigatore esperto dopo aver praticato questo test può impiantare una pallina in meno di 5 minuti per occhio.
Introduction
Il processo di angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni formano quelle preesistenti, è molto complesso ed è regolato da diversi fattori endogeni che controllano le diverse fasi di germinazione nave e morfogenesi. L'angiogenesi è attivato a causa di un cambiamento di equilibrio tra fattori pro e anti-angiogenici, un equilibrio che mantiene normalmente la vascolarizzazione in stato di quiescenza. Angiogenesi negli adulti si verifica in determinate condizioni fisiologiche, come durante il ciclo ovarico femminile o nei processi di riparazione come la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. Tuttavia, è anche una caratteristica di molte patologie tra cui tumori, malattie autoimmuni e malattie infiammatorie. Il coinvolgimento di angiogenesi in queste condizioni fisiologiche e patologiche rende un tema importante per la ricerca e un bersaglio attraente per la terapia.
A causa della complessità di angiogenesi e il coinvolgimento di vari ceLLS e fattori nel processo, comprese le cellule endoteliali, periciti, cellule circolanti e cellule stromali, in vitro modelli restano limitate e non possono ricapitolare il microambiente unico in vivo. Il principale test in vitro di angiogenesi sono in gran parte concentrati sull'osservazione effetti diretti sulle cellule endoteliali e misurare alcuni passi nel processo angiogenetico in condizioni controllate. Questi test includono la quantificazione della proliferazione delle cellule endoteliali 1, 2 migrazione, formazione rete 3, la formazione del tubo 4 e germinazione da sferoidi 5. Ex vivo i modelli, a differenza di quelli in vitro, sono più complessi e integrare più tipi di cellule dei tessuti, un esempio è il test dell'anello aortico 6. Tuttavia, come altri sistemi, non può catturare il contributo delle cellule circolanti e lo stroma naturale delle cellule endoteliali come esiste in vivo. Tentatividi studiare l'angiogenesi in condizioni di flusso per imitare l'impostazione in vivo vengono eseguite con sistemi microfluidici 7, tuttavia anche questi test, anche se molto migliorata, sono ancora in grado di spiegare tutti i comparti esistenti in vivo.
A causa delle limitazioni del ex vivo in modelli angiogenesi in vitro e in vivo modelli rimangono le scelte più affidabili per Studi angiogenesi. Esempi di questi modelli includono l'impianto di camere trasparenti, "finestre", che consentono la visualizzazione di crescita dei vasi sanguigni sotto il microscopio 8, impianti sottocutanei iniettabili come matrigel e vaso formazione nei tessuti normali come mouse orecchio e la membrana corioallantoidea pollo (CAM ). Tuttavia, uno dei modelli di angiogenesi più accettabili e quantitativi in vivo è il test MICROPOCKET neovascolarizzazione corneale qui descritta, che sfrutta la natura avascolarecornea come "schermo" per visualizzare e valutare la nuova crescita angiogenico 9.
Qui si descrive il test MICROPOCKET corneale come sviluppato nei topi. Inizialmente il modello è stato utilizzato per misurare non specifici stimoli angiogenici in cornee di coniglio. Ciò è stato fatto introducendo pezzi tumorali nell'umore acqueo della camera anteriore dell'occhio di coniglio e misurato neoplastica neovascolarizzazione 11.
Tuttavia, il test è stato successivamente evoluto per studiare gli effetti di specifici fattori di crescita 10 per specificare e standardizzare l'effetto angiogenico meglio. Al fine di rilasciare il fattore di crescita nell'occhio, pellet lento rilascio contenenti quantità note di fattori di crescita angiogenici sono stati usati al posto dei tessuti. La disponibilità di proteine purificate ricombinanti angiogenici come il bFGF e VEGF attivato il loro uso come obiettivi specifici di modulaters angiogenesi 12. Inizialmente, il test è statoin gran parte utilizzato nei conigli, che sono più facili da lavorare con causa delle loro dimensioni, ma in seguito il modello è stato tradotto in topi; un modello animale più piccolo e meno costoso. Il passaggio da coniglio topi fornito un importante vantaggio di poter utilizzare animali geneticamente manipolati, creando così una nuova area di ricerca sulle componenti genetiche che influenzano l'angiogenesi 13. Oltre all'utilizzo più accettabile di dosaggio cornea nello studio angiogenesi, altri processi biologici possono anche indagati mediante saggi modificati. Ad esempio, gli studi di linfoangiogenesi sono stati resi possibili attraverso l'impianto di pellet a basso dosaggio bFGF che hanno permesso la visualizzazione dei vasi linfatici attraverso marcatori molecolari specifici 14. Inoltre, questo test ha fornito un mezzo per valutare gli effetti delle radiazioni sulla angiogenesi 15.
In somma, la corneale test MICROPOCKET angiogenesi è una quantitativa, rappresentanteroducible, la valutazione flessibile di angiogenesi in vivo. Uno dei principali vantaggi di questo test è che la misurazione delle navi di fondo è inutile perché i vasi crescono su un tessuto avascolare naturalmente. Descriviamo qui il protocollo di questo saggio nei dettagli e discutere diversi scenari che possono verificarsi. Il test consiste di 3 segmenti discreti. Qui descriveremo la preparazione di crescita pellet fattore-inclusive, il successivo impianto chirurgico e, infine, il metodo utilizzato per quantificare la crescita neovascolare risultante.
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Protocol
Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali sono presentati ed approvati dalla Care and Use Committee Animal Istituzionale presso il Children Hospital di Boston e sono condotte in conformità con le raccomandazioni della Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care (AAALAC). Assicurarsi di utilizzare la strumentazione sterile e techniqure asettica durante l'esecuzione della procedura.
1 Preparazione di Pellet
- Pesare 10 mg di sucralfato e 60 mg di hydron con la spatola unbent sterile. Mettere in provette da microcentrifuga separati.
- Posizionare un 1 centimetro quadrato di maglia in un piatto sterile 10 cm. Inverti così maglia poggia sul coperchio superficiale. Mettere da parte.
- Aggiungere 500 ml di etanolo al hydron e vortex per almeno 10 min.
- Aggiungere la quantità appropriata di fattore di crescita (standard: 20 mg per bFGF, 50 mg di VEGF) per il sucralfato e vortice brevemente. Fattore di crescita Conservare in un-80 ° C congelatore ad una concentrazione di 1 mg / ml. Volumi di liquidi aggiunti dovrebbero essere un minimo di 20 microlitri per assicurare il sucralfato è completamente inumidito, ma non dovrebbe superare i 50 ml. Maggiore il volume rende l'evaporazione del liquido nel passaggio successivo difficile.
- Mettere il composto sucralfato nell'evaporatore centrifuga inserita bassa finchè il composto è completamente asciutta, normalmente 30-50 min a seconda del volume di liquido utilizzato.
- Controllare la miscela per umidità residua con l'estremità rastremata di una spatola sterile. La miscela deve sentirsi "croccante".
- Utilizzare l'estremità rastremata della spatola per rompere la miscela sucralfato all'interno del tubo.
- Aggiungere 10 ml di hydron al sucralfato.
- A causa della natura viscosa di Hydron, tagliare l'estremità da una punta di pipetta 200 microlitri e quindi disegnare e rilasciare i 10 ml prima di pipettare di nuovo e aggiungere al sucralfato.
- Utilizzare rapidamente battibecco piegatoUla per mescolare il hydron e sucralfato e togliere dal tubo.
- Raccogliere il composto lungo il lato inferiore della punta della spatola piegata e poi ruotare il tubo mentre si disegna la spatola lungo la parete del tubo. La miscela si asciuga rapidamente in modo che questo passo deve essere fatto in modo efficiente.
- Stendere il composto su la maglia preparata con pinze per tenerlo in posizione. La miscela deve essere uno strato uniforme e riempire nei fori della mesh.
- Immergere la spatola piegata nella hydron provetta contenente e usarlo cappotto entrambi i lati della maglia.
- Posizionare la maglia rivestito appoggiata sul fianco contro bordo del piatto e permettere l'essiccazione a temperatura ambiente per 30-45 min.
- Mettere le maglie di -20 ° C congelatore o procedere immediatamente alla fase successiva. Tenere maglia all'interno piatto.
- Porre la capsula 35 millimetri all'interno della capsula di Petri grande, coperchio. Utilizzare la coppia di pinze per tirare attentamente le fibre della maglia a parte sopra il piatto da 35 mm. Pellets Stray cun essere raccolti dal piatto più grande alla fine.
- Controllare pellet per uniformità nel campo di applicazione. Il processo produce circa 250 pellet così la dose standard per pastiglia per bFGF e VEGF è di 80 ng e 200 ng rispettivamente.
- Conservare pellets in piastra da 35 mm a -20 ° C freezer per un massimo di 3 mesi.
2. impianto chirurgico di Pellet
- Impostare una zona chirurgica sotto microscopio operatorio.
- Anestetizzare il mouse con avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneale) e posizionare il mouse sotto il microscopio in modo occhio è visibile. Eseguire pizzico punta a garantire sufficiente livello di anestesia.
- Anestetizzare l'occhio del mouse mettendo 1 goccia di soluzione proparacaina cima bulbo oculare. Attendere 20-30 secondi e tamponare con un tampone di garza.
- Proptose l'occhio mouse con il # 1 offuscato gioiellerie pinza essendo certo di lasciare la pelle tra le pinze e gli occhi. E 'importante per giudicare la pressione applicata correttamente.60; Tenendo l'occhio troppo saldamente farà a diventare rossa e irritata, mentre anche perdere una presa permetterà all'occhio di muoversi durante la chirurgia.
- Utilizzare la 30 ° microknife a fare un'incisione nella cornea ca. 1 mm dal limbus. L'incisione deve essere di 1-2 mm di lunghezza. Incisione dovrebbe essere profondo abbastanza per penetrare oltre lo strato epiteliale in midstroma ma non così profondo alla rottura l'occhio.
- Utilizzare il coltello von Graef per fare una tasca perpendicolare alla incisione.
- Far scorrere il coltello sotto lo strato corneo al sito di incisione e lavorare delicatamente coltello e spostarlo lungo l'incisione per allargare lo spazio, formando così la tasca. Aiuta a spostare il mouse così da poter lavorare con la curvatura dell'occhio. Fare attenzione a non spingere verso il basso con la punta per evitare la rottura all'occhio.
- Bagnare pinza del # 5 del gioielliere con proparacaina e prendere una pallina da fuori di piatto. Mettere una pallina sull'occhio. Inumidire il coltello von Graef con proparacaina e trasferire alcuni di liquido sul pellet per renderla gommosa e flessibile. Rimuovere l'umidità in eccesso con un tampone di garza o un batuffolo di cotone.
- Inserire il pellet nella tasca con il coltello von Graef a spingere dentro sotto lo strato di cornea. Una volta che tutto il pellet è all'interno, eseguire la parte piatta di von Graef coltello sul sito per controllare che il pellet è sicuro.
- Cappotto l'occhio con tripla pomata antibiotica.
- Capovolgere il mouse e ripetere chirurgia nell'occhio opposto.
3 Quantificazione di neovascolarizzazione corneale.
Lasciare gli animali a sviluppare le navi per un periodo di tempo. Il giorno di vascello classificazione dipende dal fattore di crescita utilizzato. BFGF Grade il giorno 5 e il VEGF più debole il giorno 6 Il giorno di impianto è il giorno 0.
- Anestetizzare il mouse con avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneale).
- Usate il microscopio lampada a fessura per grading. Un oculare ha un reticolo, linee all'interno dell'oculare usato come un aiuto di misura per quantificare la lunghezza nave e distanza intorno circonferenza dell'occhio che le navi hanno germogliato.
- Tenere il mouse davanti a portata, posizionare il mouse in modo occhio è visto in oculare con pellet direttamente avanti. Stabilizzare la testa tra il pollice e l'indice così la pelle è stretta sul viso e degli occhi è leggermente proptosed.
- Inserire l'asse y del reticolo lungo il vaso limbare direttamente sotto pellet. Misurare la lunghezza delle navi ramificazione verso l'alto verso pellet. Annotare questa misura in decimi di millimetro e designa lunghezza della nave (VL) (Figura 1A).
- Girare il mouse o il reticolo in modo che la distanza intorno all'occhio che queste navi hanno germogliato diventa chiaro. E 'più facile pensare l'occhio come un orologio con intervalli di 1 a 12 Designa quest'ora numero orologio (CH) (Figura 1B). Può essere un numero intero o frazioni di 0,25 (ad esempio, 2, 2.25, 2.5 o 2.75). Nota: CH è soggettiva. Ad esempio, alcuni possono misurare la distanza intorno all'occhio per includere tutte le navi germogliati dal limbus, mentre altri possono smettere di misurare nel punto in cui la lunghezza della nave è la metà massimale. Il fattore importante è essere coerenti con il modo si sceglie di grado.
Figura 1 Quantificazione della neovascolarizzazione corneale. (A) 80 ng bFGF pellet impiantato nel topo C57BL / 6J mostrando lampada a fessura reticolo orientato a misurare la lunghezza della nave. VL = 0,9 mm. (B) stesso occhio mostrando lampada a fessura reticolo ruotato per misurare ora d'orologio. CH = 3.25. Zona della nave calcolata = 1.84 mm 2. Queste immagini sono state digitalmente migliorato per consentire l'aggiunta di schema reticolo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
- Calcolare l'area vaso (VA) utilizzando la seguente formula, che si basa sulla superficie di un ovale (nota, è utile tenere questo in mente quando classificazione.) VA espresso in millimetri quadrati. La formula è la seguente:
Lunghezza Vessel x Orologio ora x 0,2 π = area Vessel
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Representative Results
Risultati tipici per bFGF e VEGF pellet nelle normali basse angiogenici C57BL / 6J sono mostrati in Figura 2A e B, rispettivamente. Figura 2E mostra la distribuzione normale di zona della nave (VA) nel C57BL / ceppo 6J con diverse dosi di questi crescita fattori. 80 ng pellet bFGF normalmente producono un VA di circa 2,0 mm 2, se i valori in un intervallo di 1,8-2,4 mm 2 sono accettabili. 200 ng pellet VEGF in genere causano una risposta di circa 0,7 mm 2, con un intervallo di valori accettabili di ,6-0,9 mm 2. Per gli esperimenti in cui si sospetti un effetto anti-angiogenico, aree navi più grandi sono desiderabili per essere in grado di visualizzare una diminuzione. Figura 3 mostra l'effetto del talidomide anti-angiogenico farmaco sulla neovascolarizzazione bFGF-driven. Il trattamento ha provocato 38% di inibizione della crescita dei vasi. In esperimenti in cui un aumento puòprevedibile è meglio usare dosi più basse come il pellet di serie provoca una risposta massima vicino. Pellet, comprensivi di 10-40 ng bFGF sarebbe più appropriato (Figura 2C).
I ceppi noti per avere una risposta ad alta angiogenica ad un particolare fattore di crescita può avere un VA più di due volte quella di un tipico ceppo basso-angiogenico. Figura 2D mostra la risposta di un mouse 129S1 / SvImJ ad un FGF pellet 20 ng. Per confronto, la stessa pellet dosaggio è mostrato in una C57BL / 6J nella Figura 2C. Un ampio prospetto di dettaglio della potenziale angiogenico di vari ceppi sia per bFGF- e neovascolarizzazione VEGF-indotta è stato precedentemente pubblicato dal nostro laboratorio 13.
Alcuni ceppi o pigmentazioni possono mostrare una crescita o perdita dei vasi dell'iride in risposta ad un pellet. Questo può verificarsi in uno o entrambi gli occhi di un individuo mouse e può o non può essere coerente sul entgruppo ire in cui viene eseguito il test. Questo fenomeno può causare la rottura dei vasi dell'iride causando sangue per riempire la camera anteriore (ifema). Hyphemas può rendere la classificazione neovascolarizzazione corneale difficile o impossibile. Figura 4 illustra una lieve (4A) e forma grave (4B) di questo evento.
Figura 2 Esempi di fattori di crescita indotta neovascolarizzazione corneale. (A) 80 ng bFGF pellet impiantato in una bassa angiogenica topo C57BL / 6J, risultante in una zona recipiente pari a 2,0 mm 2. E 'molto comune per questa dose di causare navi per raggiungere il pellet e crescere in esso. (B) 20 ng pellet bFGF impiantato in unC57BL / 6J topo, risultante in una zona recipiente pari a 1,04 mm 2. (C) 200 ng VEGF pellet impiantato in un topo C57BL / 6J, risultante in una zona recipiente pari a 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF pellet in alta angiogenico ceppo 129S1 / SvImJ. Rispetto a (C), anche un FGF pellet 20 ng, questa varietà ha un potenziale angiogenico superiore a due volte quella di C57BL / 6J. (E) Area neovascolare corneale (media ± SD, n = 10) in C57BL / 6J indotte da dosi crescenti di VEGF sia o bFGF. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3 Inibizione di Vess bFGF-indottael crescita da agente anti-angiogenico. veicolo (A) di controllo trattati C57BL mouse / 6J. L'impianto di 80 ng pellet bFGF risultante in una zona vaso gruppo pari a 2,0 mm 2. (B) Talidomide trattata topo (200 mg / kg, per via orale per 5 giorni). Gruppo zona della nave è uguale a 1,25 mm 2 e riflette 38% di diminuzione nella crescita dei vasi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4 Crescita hyphemas fattore-indotta nell'iride murini. (A) ifema lieve in un C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Questa varietà presenta lo stesso neovascolarizzazione corneale come le loro controparti pigmentate, ma è più prone a Iris sanguinamento. (B) ifema su vasta scala in un mouse 129P3 / J. L'intero occhio ha una sfumatura rossastra, nonché piscine più pronunciati di sangue più vicino al fondo di iris. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi critici in esecuzione di un test corneale successo. Il primo è fare pellet uniformi in grado di essere impiantati e stimolando i vasi. Le parti più importanti di preparazione pellet sono 1) con fattore di crescita senza vettore; 2) garantire una buona miscela di fattore di crescita con il sucralfato e hydron e 3) spostando la miscela finale rapidamente ma con cura dal tubo eppendorf alla maglia in cui sono espressi i pellet. Si consiglia di pellet "virtuali" essere fatte senza fattore di crescita per praticare la tecnica. Pellet dovrebbero apparire bianco e farinoso ed essere più o meno di forma quadrata. Eventuali pellet che comprendono le aree chiare dovrebbero essere esclusi in quanto queste aree probabilmente contengono solo hydron. Va inoltre notato che i pellet sono formati con etanolo e che bFGF e VEGF vengono stabilizzati mediante l'inclusione di sucralfato, che imita l'eparina vincolante. Sucralfato serve anche a fornire un pl lenta cessioneatform per i fattori di crescita. Se altri stimolatori o inibitori vengono aggiunti ai pellet, questi fattori dovrebbero essere testati prima di determinare la stabilità in etanolo. Si consiglia di pellet "virtuali" essere fatte senza fattore di crescita per praticare inizialmente la tecnica. "Dummy" o pellet sham contengono solo sucralfato e hydron con PBS sostituito per il volume del fattore di crescita o composti in fase di test. Questi pellet non stimolano la crescita dei vasi o infiammazione limbare. Pellet Sham servono come controllo appropriato in esperimenti in cui un agente è sospettato di essere pro-angiogenica ed è testato senza l'aggiunta di fattore di crescita per il pellet. Composti e fattore di crescita possono essere combinati in pellet per casi in cui l'interazione è indagato, nel qual caso pellets del fattore di crescita da sola sarebbe il controllo appropriato.
Impianto chirurgico è la parte più impegnativa del saggio.0; È inizialmente molto difficile misurare la profondità appropriata per l'incisione. Troppo profondo un'incisione fa sì che il mondo alla rottura e l'occhio diventa inutilizzabile. Questo è un effetto drammatico e quindi si impara rapidamente a non "pop" l'occhio. Ci vuole molto più tempo per fare in modo coerente un'incisione abbastanza profondo da permettere la formazione della tasca. Quando l'incisione è troppo poco profondo, lo strato superiore della cornea è facilmente danneggiato o strappato via con il coltello von Graef in quanto è inserito per rendere la tasca. La fase finale di quantificare la crescita di nuovi vasi richiede coerenza nel modo di classificazione. Lunghezza Mezzo è una misura lineare, mentre il valore ora di orologio raffigurante la crescita intorno alla circonferenza dell'occhio è più personale. Il metodo utilizzato deve essere lo stesso da mouse per mouse e tra esperimenti.
Un altro componente critico del test è la scelta di anestesia, che può avereun impatto sulla facilità e successo della procedura chirurgica. Avertin iniettabile è il meno complicato in quanto consente una facile manipolazione del mouse in contrasto con anestesia vaporizzato distribuito mediante cono. Si consiglia di evitare la combinazione di ketamina e xilazina, nonché a causa della sua associazione con lesioni corneali nei roditori 16,17.
È importante notare alcun cambiamento nel peso dei topi durante l'esperimento. La perdita di peso può essere indicativo di condizioni abitative disagiate o malattia e questi possono influenzare negativamente la capacità di un mouse per crescere i vasi negli occhi. I pesi dovrebbero essere prese nei giorni di pellet impianto e vaso di classificazione per determinare la percentuale di peso perso, se presente. Perdita del 5% o meno è accettabile e può derivare da stress di gestire i topi, soprattutto durante gli esperimenti di trattamento con dosaggio frequenti. Superiore al 5% la perdita di peso è preoccupante e la volontà non specificosopprimere la crescita dei vasi. Così i risultati di tali esperimenti devono essere considerati non validi.
Per tenere conto di variazioni inerenti sperimentali tecnica procedura e l'efficacia delle variabili studiate, un numero minimo di topi dovrebbe essere utilizzato per ottenere risultati validi. Nella nostra esperienza vi consigliamo di non meno di 5 topi per gruppo che producono un n di 10 occhi.
Nonostante i numerosi vantaggi del saggio MICROPOCKET corneale, ci sono anche alcune limitazioni. Lo svantaggio principale è la necessità di un periodo relativamente lungo di formazione per apprendere la tecnica. Un individuo con nessuna esperienza tecnica preventiva lavorare negli occhi topo avrebbe richiesto circa quattro mesi di pratica prima di esperimenti di 20-25 topi potevano essere considerati affidabili. Inoltre, ci sono alcune differenze tra le diverse persone che svolgono il test, limitando così la possibilità di confrontare tra esperimenti che vengono eseguitein tempi diversi da persone diverse. Un altro limite di questo modello è che gli esperimenti sono relativamente brevi (5-6 giorni) e sono limitati dal rilascio del bFGF o VEGF dal pellet. Pertanto, questo test è molto adatto per le terapie che hanno una risposta veloce in vivo, anche se questo può essere parzialmente compensata con il pretrattamento dei topi di tempo desiderato prima procedura. Standard test droga test iniziano tipicamente amministrazione del giorno di pellet impianto (Giorno 0) proseguendo fino al giorno di classificazione (giorno 5 o 6).
L'importanza di questa tecnica è che è uno dei più affidabili saggi di angiogenesi quantitative. Un'alternativa nei topi è saggio spina matrigel, tuttavia questo saggio è più qualitativa e meno specifici di un certo fattore di crescita a causa di una vasta infiltrazione di cellule che si verifica nella spina. La flessibilità del dosaggio corneale permette di adattare la quantitàdell'angiogenesi generato e di scegliere uno stimolatore specifico. È possibile sostituire i fattori di crescita standard con altri fattori angiogenici noti o sospetti. Inoltre, è possibile combinare i fattori di crescita standard e possibili inibitori entro lo stesso pellet per valutare l'attività anti-angiogenica senza rilascio sistemico. Infine, questo test permette di stimolare l'angiogenesi su diversi background genetici, che possono essere utili nella mappatura effetti genetici e stabilire l'impatto di un particolare gene sul angiogenesi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Kristin Johnson per il lavoro grafico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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