Summary
Protokollen beskriver corneal micropocket assay udviklet i mus.
Abstract
Musen hornhinde micropocket analysen er en robust og kvantitativ in vivo-assay til evaluering af angiogenese. Ved hjælp af standardiserede langsom frigivelse pellets indeholdende specifikke vækstfaktorer, der udløser blodkarvækst hele naturligt avaskulære hornhinde, kan måles og kvantificeres angiogenese. I dette assay den angiogene respons genereres i løbet af flere dage, afhængigt af den type og dosis af vækstfaktor anvendes. Induktionen af neovaskularisering er almindeligt udløst af enten basisk fibroblast-vækstfaktor (bFGF) eller vaskulær endotelial vækstfaktor (VEGF). Ved at kombinere disse vækstfaktorer med sucralfat og Hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) og støbning af blandingen til pellets, kan de implanteres kirurgisk i musen øjet. Disse ensartede piller langsomt frigive vækstfaktorerne over fem eller seks dage (bFGF eller VEGF henholdsvis), der muliggør tilstrækkelig angiogen respons kræves for fartøjets område quantification hjælp af en spaltelampe. Denne analyse kan bruges til forskellige applikationer, herunder evaluering af angiogene modulator lægemidler eller behandlinger samt sammenligning mellem forskellige genetiske baggrunde påvirker angiogenese. En dygtig investigator efter udførelse af denne analyse kan implantere en pellet på mindre end 5 minutter pr øje.
Introduction
Processen med angiogenese, dannelsen af nye blodkar dannes allerede eksisterende dem, er meget kompleks og reguleres af flere endogene faktorer, der styrer forskellige trin i fartøjets spiring og morfogenese. Angiogenese er udløst på grund af en ændring i balancen mellem pro- og antiangiogene faktorer, en balance, der normalt fastholder vaskulaturen i en hvilende tilstand. Angiogenese i voksne forekommer i visse fysiologiske betingelser, såsom under den kvindelige ovariecyklus eller reparation processer såsom sårheling og vævsregenerering. Men det er også et kendetegn for flere patologier, herunder maligniteter, autoimmune sygdomme og inflammatoriske sygdomme. Inddragelsen af angiogenese i disse fysiologiske og patologiske tilstande gør det et vigtigt emne for forskning og et attraktivt mål for terapi.
På grund af kompleksiteten af angiogenese og inddragelse af flere ceLLS og faktorer i processen, herunder endotelceller, pericytter cirkulerende celler og stromale celler, in vitro-modeller fortsat er begrænsede og kan ikke rekapitulere unikke in vivo mikromiljø. Den vigtigste in vitro assays for angiogenese er i høj grad fokuseret på at observere direkte virkninger på endotelceller og måle visse skridt i angiogene proces under kontrollerede forhold. Disse assays omfatter kvantificering af endotelcelleproliferation 1 migration 2, dannelse 3 netværk, rør dannelse 4 og spiring fra sfæroider 5. Ex vivo-modeller, i modsætning til in vitro dem, er mere komplekse og indarbejde flere væv celletyper, idet et eksempel er aorta ring assay 6. Men ligesom andre systemer, kan det ikke fange bidrag cirkulerende celler og naturlige stroma endotelceller som findes in vivo. Forsøgat studere angiogenese under flow til at efterligne in vivo-indstillingen udføres ved hjælp af mikrofluide systemer 7, men selv disse analyser, selv om meget bedre, stadig ikke kan redegøre for alle rummene eksisterende in vivo.
På grund af begrænsningerne af in vitro og ex vivo angiogenese modeller in vivo modeller forbliver mere pålidelige valg for angiogenese studier. Eksempler på disse modeller omfatter implantation af gennemsigtige kamre, "vinduer", der tillader visualisering af voksende blodkar under mikroskop 8, injicerbare subkutane implantater såsom matrigel og fartøj dannelse i normale væv, såsom mus øre og hønen chorioallantoiske membran (CAM ). Men en af de mest acceptable og kvantitative in vivo angiogenese modeller er corneal micropocket neovaskularisering assayet beskrevet her, som udnytter naturligt avaskulærehornhinde som en "skærm" til at visualisere og vurdere ny angiogen 9 vækst.
Her beskriver vi corneal micropocket assay udviklet i mus. Oprindeligt blev modellen anvendt til at måle uspecifikke angiogene stimuli i kanin hornhinder. Dette blev gjort ved at indføre tumorstykker i kammervandet i det forreste kammer i kaninøjne og måles tumorinduceret neovaskularisering 11.
Imidlertid blev analysen senere udviklet sig til at studere virkningerne af specifikke vækstfaktorer for 10 til bedre at specificere og standardisere den angiogene virkning. For at frigive vækstfaktoren i øjet, blev langsom frigivelse pellets indeholdende kendte mængder af angiogene vækstfaktorer anvendes i stedet for væv. Tilgængeligheden af oprensede rekombinante angiogene proteiner såsom bFGF eller VEGF aktiveret deres anvendelse som specifikke mål for angiogenese modulaters 12. Oprindeligt var assayeti vid udstrækning anvendes i kaniner, som er lettere at arbejde med på grund af deres størrelse, men senere modellen blev oversat i mus; en mindre og billigere dyremodel. Skift fra kanin til mus gav en vigtig fordel ved at være i stand til at bruge genetisk manipulerede dyr og dermed skabe et nyt forskningsområde i de genetiske komponenter påvirker angiogenese 13. Ud over de mere acceptabel anvendelse af analyse af hornhinden i at studere angiogenese, kan andre biologiske processer også undersøgt ved hjælp af modificerede assays. For eksempel blev undersøgelser af lymphangiogenesis muliggjort gennem implantation af lav dosis bFGF pellets, der er tilladt visualisering af lymfekar gennem specifikke molekylære markører 14. Desuden har dette assay tilvejebragt et middel til at vurdere virkningerne af stråling på angiogenese 15.
I summering, corneal micropocket angiogenese assayet er et kvantitativt, reproducible, fleksibel vurdering af angiogenese in vivo. En stor fordel ved dette assay er, at måling af baggrundsniveauet fartøjer er unødvendig, fordi beholderne vokse på et naturligt avaskulært væv. Vi beskriver her protokollen af denne analyse i detaljer og diskutere forskellige scenarier, der kan opstå. Assayet består af 3 diskrete segmenter. Her vil vi beskrive fremstillingen af vækstfaktor inklusive pellets den efterfølgende kirurgisk implantation og endelig den anvendte metode til at kvantificere den resulterende neovaskulær vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller, der involverer dyr præsenteres for og godkendes af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Børnehospital Boston og gennemføres i overensstemmelse med anbefalingerne fra Foreningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC). Vær sikker på at bruge sterilt instrumentering og aseptisk techniqure mens du udfører arbejdet.
1. Fremstilling af pellets
- Der afvejes 10 mg sucralfat og 60 mg Hydron med den sterile unbent spatel. Placer i separate mikrocentrifugerør.
- Placer en 1 cm firkantet stykke mesh i en steril 10 cm skål. Invert så mesh hviler på lavvandede låg. Braklægning.
- Tilsæt 500 pi ethanol til Hydron og vortex i mindst 10 minutter.
- Tilsæt passende mængde vækstfaktor (standard: 20 ug til bFGF, 50 ug til VEGF) til sucralfat og vortex kortvarigt. Opbevar vækstfaktor i en-80 ° C fryser i en koncentration på 1 mg / ml. Flydende tilsatte rumfang skal være mindst 20 pi at sikre sucralfat er fuldstændigt fugtet men bør ikke overstige 50 pi. Større volumen gør afdampningen af væsken i det næste trin vanskelig.
- Placer sucralfat blandingen i centrifugal fordamperen på lav, indtil blandingen er helt tørt, normalt 30-50 minutter afhængigt af mængden af væske, der anvendes.
- Kontroller blandingen restfugtighed med den tilspidsede ende af en steril spatel. Blandingen skal føle sig "sprød".
- Brug tilspidset ende af spatel til at bryde op sucralfat blanding inden i røret.
- Tilsæt 10 ul af Hydron til sucralfat.
- På grund af den tyktflydende karakter Hydron, skære enden fra en 200 ul pipettespids og derefter tegne og frigive de 10 pi inden pipettering op igen og tilføje til sucralfat.
- Hurtigt bruge bøjet spyttedeula at blande Hydron og sucralfat og fjerne fra røret.
- Saml blandingen langs den nederste side af spidsen af den bøjede spatel og derefter dreje røret samtidig trække spatel ud langs væggen af røret. Blandingen vil tørre hurtigt, så dette trin skal udføres effektivt.
- Fordel blandingen på den forberedte maske med pincet til at holde det på plads. Blandingen skal være et jævnt lag og fylde i hullerne i masken.
- Fordyb bøjet spatel ind i rør, der indeholder Hydron og bruge det frakke begge sider af maske.
- Placer overtrukne net hælder på side mod kanten af skålen og lad tørre ved stuetemperatur i 30-45 min.
- Placer maskerne i -20 ° C fryseren eller øjeblikkeligt går til næste trin. Hold mesh inde skålen.
- Placer 35 mm skål indersiden af større petriskål, låget. Brug tang til forsigtigt at trække fibrene i masken fra hinanden i løbet af 35 mm skål. Herreløse pellets cen skal indsamles fra den større fad i slutningen.
- Tjek piller for ensartethed under anvendelsesområdet. Processen giver cirka 250 piller således standard dosis pr pille for bFGF og VEGF er 80 ng og 200 ng hhv.
- Opbevar træpiller i 35 mm skål i -20 ° C fryseren i op til 3 måneder.
2. kirurgisk implantation af pellets
- Opsæt et kirurgisk område under operationsmikroskop.
- Bedøver mus med avertin (400-500 mg / kg, intraperitonealt) og placer mus under mikroskop, så øjet er synligt. Udfør tå knivspids for at sikre tilstrækkelig anæstesi.
- Bedøver musen øjet ved at placere 1 dråbe proparacain løsning oven øjeæblet. Vent 20-30 sek og dup med et stykke gaze.
- Proptose musen øje med den sløvet # 1 guldsmede pincet være sikker på at efterlade huden mellem pincet og øje. Det er vigtigt at bedømme det tryk, der påføres rigtigt.60; Hold øje for hårdt, vil få det til at blive rød og irriteret, mens for løs fat tillader øjet at bevæge sig under operationen.
- Brug 30 ° microknife at lave et snit i hornhinden ca. 1 mm fra limbus. Snittet skal være 1-2 mm i længden. Incision skal være dyb nok til at trænge igennem epithellaget i midstroma men ikke så dybe at briste øjet.
- Brug von Graef kniv til at lave en lomme vinkelret på snittet.
- Skub kniv under hornhindens lag ved incisionsstedet og forsigtigt arbejde kniv i og bevæge det langs snittet for at forstørre rum, som danner lommen. Det hjælper til at bevæge musen samt at være i stand til at arbejde med krumning af øjet. Pas på ikke at skubbe nedad med spidsen for at undgå brud på øjet.
- Fugt # 5 guldsmedens pincet med proparacain og pluk en pille op af skålen. Placer en pille på øjet. Fugt von Graef kniv med proparacain og overføre nogle af væske på pillen for at gøre det gummibelagte og bøjelig. Fjern overskydende fugt med gaze eller en vatpind.
- Sæt pillen i lommen ved hjælp af von Graef kniv til at skubbe det ind under hornhinden lag. Når hele pellet er inde, skal du køre den flade side af von Graef kniv over websted for at kontrollere, at pillen er sikker.
- Coat øjet med tredobbelt antibiotisk salve.
- Vend musen og gentag operationen i den modsatte øje.
3. Kvantificering af hornhindeneovaskularisering.
Lad dyrene til at udvikle skibe over en fastsat periode. Dagen for fartøjets klassificering afhænger vækstfaktor anvendes. Grade bFGF på dag 5 og svagere VEGF på dag 6. dag for implantation er dag 0.
- Bedøver mus med avertin (400-500 mg / kg, intraperitonealt).
- Brug spaltelampe mikroskop til grading. Et okular har en Reticule, linjer inden okularet bruges som en hjælp måling at kvantificere fartøj længde og afstand omkring øjets omkreds, at fartøjerne er skudt.
- Hold musen foran omfang, positionering mus så øje ses i okular med pellet direkte forude. Stabiliser hoved mellem tommel-og pegefinger, så huden strammes på ansigt og øjne er let proptosed.
- Placer y-aksen af trådkorset langs limbale fartøj direkte under pellet. Mål længden af skibe forgrening opad mod pellets. Optag denne måling i tiendedele millimeter og udpege fartøjets længde (VL) (figur 1A).
- Drej enten musen eller trådkorset så afstanden omkring øjet, at disse fartøjer er spiret bliver klar. Det er lettest at tænke på øjet som en urskive med intervaller på 1 til 12. Titelblad dette nummer klokketime (CH) (Figur 1B). Det kan være et helt tal eller fraktioner 0,25 (f.eks, 2, 2,25, 2,5 eller 2,75). Bemærk: CH er subjektive. For eksempel kan nogle måle afstanden omkring øjet til at omfatte alle fartøjer spirede fra limbus mens andre kan stoppe målingen på det punkt, hvor fartøjets længde er halvmaksimal. Den vigtigste faktor er at være i overensstemmelse med, hvordan man vælger at lønklasse.
Figur 1. Kvantificering af hornhindeneovaskularisering. (A) 80 ng bFGF pellets implanteret i C57BL / 6J mus viser spaltelampe netvasrk orienteret til at måle fartøjets længde. VL = 0,9 mm. (B) Samme øje viser spaltelampe netvasrk drejet for at måle klokketime. CH = 3.25. Beregnet fartøj område = 1,84 mm2. Disse billeder er blevet digitalt forbedret for at tillade tilsætning af netvasrk skematiske. Klik her for at se et større billede.
- Beregn skibet området (VA) ved hjælp af nedenstående formel, som er baseret på arealet af en oval (Bemærk, det er nyttigt at holde dette i tankerne, når klassificering.) Express VA i millimeter potens. Formlen er som følger:
Fartøjets længde x klokketime x 0,2 π = Vessel område
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater for bFGF og VEGF træpiller i de normale lave angiogene C57BL / 6J mus er vist i figur 2A og B, henholdsvis. Figur 2E viser den normale fordeling af fartøjets område (VA) i C57BL / 6J stamme med varierende doser af disse vækst faktorer. 80 ng bFGF piller normalt resultere i en VA på ca 2,0 mm 2, selv om værdier i en række 1,8-2,4 mm 2 er acceptable. 200 ng VEGF piller indebærer typisk en respons på omtrent 0,7 mm 2, med et interval af acceptable værdier på 0,6-0,9 mm 2. Til forsøg, hvor der er mistanke om en antiangiogen virkning større fartøj områder er ønskeligt at være i stand til at visualisere et fald. Figur 3 viser virkningen af anti-angiogene lægemiddel thalidomid på bFGF-drevne neovaskularisering. Behandlingen resulterede i 38% hæmning af væksten fartøj. I forsøg, hvor en stigning kanforventes det er bedst at bruge lavere doser som standard pille forårsager en nær maksimal respons. Piller, der består af 10-40 ng bFGF ville være mere passende (figur 2C).
Stammer, der vides at have en høj-angiogen reaktion på en særlig vækstfaktor kan have en VA mere end det dobbelte af en typisk lav-angiogen stamme. Figur 2D viser responset af en 129S1 / SvImJ mus til et 20 ng FGF pellet. Til sammenligning er den samme dosis pelleten vist i en C57BL / 6J i figur 2C. En omfattende tabel beskriver den angiogene potentiale for forskellige stammer til både bFGF- og VEGF-induceret neovaskularisering er tidligere blevet offentliggjort af vores laboratorium 13.
Visse stammer eller pigmentations kan udvise vækst eller lækage af iris fartøjer som reaktion på en pille. Dette kan ske på et eller begge øjne en individuel mus og måske eller måske ikke være konsekvent over entire gruppe, hvor analysen udføres. Dette fænomen kan medføre sprængning af iris fartøjer forårsager blod til at fylde det forreste kammer (hyphema). Hyphemas kan gøre klassificering corneal neovaskularisering vanskelig eller umulig. Figur 4 illustrerer en mild (4A) og alvorlig (4B) form for denne begivenhed.
Figur 2. Eksempler på vækstfaktor-induceret hornhindeneovaskularisering. (A) 80 ng bFGF pellets implanteret i en lav angiogen C57BL / 6J mus, hvilket resulterer i en beholder areal svarende til 2,0 mm2. Det er meget almindeligt for denne dosis til at forårsage fartøjer at nå pellet og vokse ind i det. (B) 20 ng bFGF pellet implanteret i enC57BL / 6J mus, hvilket resulterer i en beholder areal svarende til 1,04 mm2. (C) 200 ng VEGF pellet implanteret i en C57BL / 6J mus, hvilket resulterer i en beholder areal svarende til 0,71 mm2. (D) 20 ng bFGF pellet i høj angiogene 129S1 / SvImJ stamme. I forhold til (C), også en 20 ng FGF pellet denne stamme har en angiogen potentiale større end det dobbelte af C57BL / 6J mus. (E) Corneal neovaskulær område (middel ± standardafvigelse, n = 10) i C57BL / 6J mus induceret af stigende doser af enten VEGF eller bFGF. Klik her for at se et større billede.
Figur 3. Inhibering af bFGF-induceret Vessel vækst ved antiangiogent middel. (a) Kontrollen køretøj behandlede C57BL / 6J mus. Implantation af 80 ng bFGF pellet resulterer i en gruppe fartøj areal svarende til 2,0 mm2. (B) Thalidomid behandlede mus (200 mg / kg oralt i 5 dage). Gruppe fartøj område er lig med 1,25 mm 2 og afspejler 38% fald i væksten fartøj. Klik her for at se et større billede.
Figur 4. Vækstfaktor-induceret hyphemas i murine iris. (A): Mild hyphema i en C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Denne stamme udviser den samme hornhindeneovaskularisering som deres pigmenterede modstykker, men er mere prone Iris blødning. (B) Storskala hyphema i en 129P3 / J mus. Hele øje har et rødligt skær samt mere udtalte pøl af blod tættere på bunden af iris. Klik her for at se et større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin i at udføre et vellykket hornhinde analyse. Den første gør ensartede pellets stand til at blive implanteret og stimulerende fartøjer. De vigtigste dele af pellet præparat 1) med bærerfri vækstfaktor; 2) at sikre en god blanding af vækstfaktor med sucralfat og Hydron og 3) at bevæge den endelige blanding hurtigt, men omhyggeligt fra eppendorfrør til masken, hvor pillerne er støbt. Det anbefales, at "dummy" pellets ske uden vækstfaktor at praktisere teknikken. Pellets skal vises hvide og kalkholdig og være nogenlunde kvadratisk form. Eventuelle piller, der indeholder klare områder bør udelukkes, da disse områder sandsynligvis kun indeholde Hydron. Det skal også bemærkes, at pillerne er dannet med ethanol, og at bFGF og VEGF er stabiliseret ved inkorporering af sucralfat, som efterligner heparin binding. Sucralfat også tjener til at tilvejebringe en langsom frigivelse platform for vækstfaktorer. Hvis der tilsættes andre stimulatorer eller-inhibitorer til pellets, bør disse faktorer først testes for at bestemme stabilitet i ethanol. Det anbefales, at "dummy" pellets foretages uden vækstfaktor indledningsvis at praktisere teknikken. "Dummy" eller fingeret piller indeholder kun sucralfat og Hydron med PBS i stedet for mængden af vækstfaktor eller forbindelse, der testes. Disse piller ikke stimulere væksten fartøj eller limbale betændelse. Sham piller tjene som en passende kontrol i forsøg, hvor der er mistænkt for at være pro-angiogene en agent og testes uden tilsætning af vækstfaktor til pillen. Forbindelser og vækstfaktor kan kombineres i piller til tilfælde, hvor en interaktion bliver undersøgt, i hvilket tilfælde pellets af vækstfaktoren alene ville være en passende kontrol.
Kirurgisk implantation er den mest udfordrende del af assayet.0; Det er oprindeligt meget vanskeligt at måle den korrekte dybde for snittet. For dybt et snit får kloden til at briste og øjet bliver ubrugeligt. Dette er en dramatisk effekt, og derfor lærer man hurtigt ikke at "pop" øjet. Det tager betydeligt længere tid at konsekvent lave et snit dybt nok til at tillade lomme formation. Når snittet er for lavt, er det øverste lag af hornhinden let beskadiget eller flået med von Graef kniv, som det er indsat for at gøre lomme. Det sidste trin kvantificere den nye vækst fartøj kræver konsekvens i den måde, sortering. Fartøjets længde er en simpel måling, mens uret time værdi afbilder væksten rundt om omkredsen af øjet er mere subjektive. Den metode, der skal være den samme fra mus til mus og mellem forsøg.
En anden vigtig komponent af assayet er valget af anæstesi, som kan haveen indvirkning på den lethed og succes af den kirurgiske procedure. Injektion avertin er den mindst komplicerede, da det giver mulighed for nem manipulation af musen i modsætning til fordampet anæstesi leveret via næse kegle. Det er tilrådeligt at undgå en kombination af ketamin og xylazin så godt på grund af sin tilknytning til cornealæsioner i gnavere 16,17.
Det er vigtigt at bemærke ændringer i vægten af mus under eksperimentet. Vægttab kan være tegn på dårlige boligforhold eller sygdom, og disse kan have en negativ indflydelse på en mus, evne til at vokse fartøjer i øjet. Vægte skal tages på dage med træpiller implantation og fartøj sortering til at bestemme den procentdel af vægten tabt, hvis nogen. Tab af 5% eller mindre er acceptabelt og kan resultere fra stress af at håndtere musene, især under behandling eksperimenter med hyppig dosering. Større end 5% vægttab er bekymrende og vil uspecifiktundertrykke karvækst. Således bør betragtes resultaterne fra disse forsøg ugyldige.
At redegøre for iboende eksperimentelle afvigelser fra proceduren teknik og effekten af variable undersøgt, bør et minimum antal mus bruges til at opnå gyldige resultater. I vores erfaring anbefaler vi ikke færre end 5 mus per gruppe hvilket giver en n 10 øjne.
Trods de mange fordele ved den hornhinde micropocket assay er der også nogle begrænsninger. Den største ulempe er behovet for en forholdsvis lang uddannelse periode for at beherske teknikken. En person uden forudgående teknisk erfaring med at arbejde i musen øjet ville kræve cirka fire måneder af praksis, før eksperimenter på 20-25 mus kunne betragtes som pålidelig. Desuden er der visse forskelle mellem de forskellige folk, der udfører analysen, hvilket begrænser muligheden for at sammenligne mellem eksperimenter, der udføresi forskellige tidspunkter af forskellige personer. En anden begrænsning ved denne model er, at forsøg er forholdsvis korte (5-6 dage) og er begrænset af frigivelsen af bFGF eller VEGF fra pillen. Derfor er dette assay meget velegnet til behandlinger, der har en hurtig respons in vivo, selv om dette delvis kan kompenseres for ved at forbehandle mus ønskede tidsrum forud for proceduren. Standard stof forsøgsanalyser begynder typisk administration på dagen for træpiller implantation (dag 0) fortsætter, indtil datoen for klassificering (dag 5 eller 6).
Betydningen af denne teknik er, at det er en af de mest pålidelige kvantitative angiogenese assays. Et alternativ i mus er Matrigel plug assay imidlertid dette assay er mere kvalitativ og er mindre specifikke for en bestemt vækstfaktor skyldes en omfattende celleinfiltration, der forekommer i proppen. Fleksibiliteten i hornhinden analyse gør det muligt at skræddersy mængdenaf angiogenese produceres, og til at vælge en specifik stimulator. Det er muligt at erstatte faste vækstfaktorer med andre kendte eller formodede angiogene faktorer. Derudover er det muligt at kombinere faste vækstfaktorer og mulige inhibitorer inden for samme pillen evaluere antiangiogen aktivitet uden systemisk levering. Endelig er denne analyse gør det muligt at stimulere angiogenese på forskellige genetiske baggrunde, som kan være nyttige i at kortlægge genetiske virkninger og i udarbejdelsen af virkningen af et bestemt gen på angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kristin Johnson til den grafiske arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
