Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Роговицы Micropocket Анализ: Модель ангиогенеза в Mouse глаз

Published: August 16, 2014 doi: 10.3791/51375
* These authors contributed equally

Summary

Протокол описывает роговицы micropocket определение, как разработанный на мышах.

Abstract

Мышь роговицы micropocket анализ является надежным и количественный анализ в естественных условиях для оценки ангиогенеза. С помощью стандартных медленным высвобождением гранулы, содержащие специфические факторы роста, которые вызывают рост кровеносных сосудов в течение всего естественно, лишенной сосудов роговицы, ангиогенез может быть измерено и количественно. В этом анализе ангиогенный ответ генерируется в течение нескольких дней, в зависимости от типа и дозы фактора роста используется. Индукция неоваскуляризации обычно вызваны либо основного фактора роста фибробластов (bFGF) или фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Комбинируя эти факторы роста с сукральфат и Hydron (поли-НЕМА (поли (2-гидроксиэтил метакрилат))) и отливки смеси в гранулы, они могут быть хирургически имплантированы в глаз мыши. Эти единые гранулы медленно-релиз факторы роста в течение пяти или шести дней (bFGF или VEGF соответственно) позволяет достаточно ангиогенную реакцию, необходимую для области судно дuantification помощью щелевой лампы. Этот анализ может быть использован для различных применений, в том числе оценки ангиогенных модулятора лекарств или лечения, а также сравнения разных генетических фонов, влияющих на ангиогенез. Квалифицированный следователь после практики этого анализа можно имплантировать гранул менее чем 5 мин на глаза.

Introduction

Процесс ангиогенеза, образование новых кровеносных сосудов образуют уже существующие те, в высшей степени сложным и регулируется с помощью нескольких эндогенных факторов, которые контролируют различные этапы прорастания сосудов и морфогенеза. Ангиогенез срабатывает за счет смещения в балансе между про-и анти-ангиогенеза факторов, баланса, что обычно ведет сосудистую в состоянии покоя. Ангиогенез у взрослых происходит в определенных физиологических условиях, таких как в женской яичников цикла или в репаративных процессов, таких как заживление ран и регенерации тканей. Тем не менее, это также отличительным признаком нескольких патологий в том числе злокачественных опухолей, аутоиммунных состояний и воспалительных заболеваний. Участие ангиогенеза в этих физиологических и патологических условиях делает его важным объектом для исследований и привлекательной мишенью для терапии.

В связи со сложностью ангиогенеза и привлечением нескольких сезаполняет и факторы в процессе, в том числе эндотелиальных клеток, перицитами, циркулирующих клеток и стромальных клеток, в пробирке модели остаются ограниченными и не могут резюмировать уникальную микросреду в естественных условиях. Основной в анализах пробирке ангиогенеза в значительной степени сосредоточены на наблюдении прямое воздействие на эндотелиальные клетки и измерение определенные шаги в процессе ангиогенеза в контролируемых условиях. Эти анализы включают количественную оценку пролиферации эндотелиальных клеток 1, миграции 2, формирование сети 3, формирование трубки 4 и прорастания от сфероидов 5. Экс естественных моделей, в отличие от тех в пробирке, являются более сложными и включать различные типы ткани клеток, примером чему кольца аорты анализ 6. Тем не менее, как и в других системах, он не может захватывать вклад циркулирующих клеток и естественную стромы эндотелиальных клеток, как существует в естественных условиях. Попыткиизучать ангиогенез в потоке, чтобы имитировать настройку в естественных условиях выполняются с помощью микрофлюидных системы 7, однако даже эти анализы, хотя значительно улучшилось, по-прежнему не в состоянии учесть все отсеки, существующих в естественных условиях.

В связи с ограничениями в пробирке и бывших естественных условиях моделей ангиогенеза, в естественных условиях модели остаются более надежные варианты для ангиогенеза исследований. Примерами таких моделей включают имплантацию прозрачных камер, "Windows", которые позволяют визуализировать растущих кровеносных сосудов под микроскопом 8, инъекционные подкожные имплантаты, такие как Матригель и сосудов образования в нормальных тканях, таких как уха мыши и курицы хориоаллантоисной мембране (CAM ). Тем не менее, одним из наиболее приемлемых и количественных моделей ангиогенеза в естественных условиях является роговицы micropocket неоваскуляризация анализ, описанный здесь, в которой использована, естественно, аваскулярныйРоговица как «экран», чтобы отследить и проанализировать новый ангиогенную рост 9.

Здесь мы опишем роговицы micropocket анализа, разработанные на мышах. Изначально модель была использована для измерения неспецифические ангиогенные стимулы в кролика роговицы. Это было сделано путем введения опухолевых части в водянистой влаги из передней камеры глаза кролика и измеряется индуцированного опухолью неоваскуляризацию 11.

Тем не менее, анализ был впоследствии превратилась для изучения последствий конкретного факторов роста 10 для лучшего определения и стандартизации ангиогенную эффект. Для того, чтобы освободить фактор роста в глаза, с медленным высвобождением гранулы, содержащие известные количества ангиогенных факторов роста были использованы вместо тканей. Наличие очищенных рекомбинантных ангиогенными белков, таких как bFGF или VEGF включен их использование в качестве конкретных задач ангиогенеза modulaters 12. Первоначально анализа былашироко используется в кроликов, которые легче работать с в силу своего размера, но позже модель была переведена на мышах; меньше и менее дорогой модели на животных. Переход от кролика мышам условии важное преимущество, которое позволяет использовать генетически манипулировать животных, создавая тем самым новую область исследований в генетических компонентов, влияющих ангиогенез 13. В дополнение к более приемлемым использование роговицы анализа в изучении ангиогенеза, другие биологические процессы также могут быть исследованы с использованием модифицированных анализов. Например, исследования лимфангиогенеза стали возможными благодаря имплантации гранулы с низким доза bFGF, которые позволили визуализацию лимфатических сосудов с помощью специальных молекулярных маркеров 14. Кроме того, это исследование служит средством для оценки воздействия радиации на ангиогенез 15.

В суммирования, роговицы micropocket ангиогенез анализ является количественная, представительroducible, гибкая оценка ангиогенеза в естественных условиях. Основным преимуществом этого анализа является то, что измерение фона сосудов является необходимым, так как сосуды растут на, естественно, лишенной сосудов ткани. Мы описываем здесь протокол этом анализе в деталях и обсудить различные сценарии, которые могут возникнуть. Анализ состоит из 3 отдельных сегментов. Здесь мы опишем приготовление фактор роста включено гранул, последующее хирургическую имплантацию и, наконец, метод, используемый для количественного определения результате неоваскулярную рост.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы с участием животных представлены и одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животных, по крайней Детской больнице Бостона и проводятся в соответствии с рекомендациями ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC). Обязательно используйте стерильную приборов и асептический techniqure при выполнении процедуры.

1 Получение гранул

  1. Взвесить 10 мг сукральфат и 60 мг Hydron с отогнутым стерильной шпателем. Поместите в отдельных микропробирок.
  2. Поместите 1 см квадратный кусок сетки в стерильный 10 см блюдо. INVERT так сетка лежит на мелкой крышкой. Отложите.
  3. Добавить 500 мкл этанола в Hydron и вихря в течение по крайней мере 10 мин.
  4. Добавить соответствующее количество фактора роста (стандарт: 20 мкг bFGF в течение 50 мкг для VEGF) в сукральфат и вихря кратко. Фактор роста Хранить в-80 ° C морозильник при концентрации 1 мг / мл. Объемы жидких добавленные должны быть не менее 20 мкл для обеспечения сукралфат полностью смоченной но не должна превышать 50 мкл. Большой объем составляет испарение жидкости на следующем этапе трудно.
  5. Поместите сукралфат смесь в центробежной испаритель, установленный на низкой, пока смесь полностью не высохнет, обычно 30-50 мин в зависимости от объема жидкости, используемой.
    1. Проверьте смесь для остаточной влажности с коническим концом стерильного шпателя. Смесь должна чувствовать себя "хрустящие".
  6. Используйте конический конец лопаточки, чтобы разбить сукралфат смесь внутри трубки.
  7. Добавить 10 мкл Hydron к сукральфат.
    1. Благодаря вязкой природы Hydron, обрежьте от пипетки наконечник 200 мкл, а затем рисовать и освободить 10 мкл до пипетки вверх снова и добавив к сукральфата.
  8. Быстро использовать согнутую плюнулула смешать Hydron и сукральфат и удалить из трубы.
    1. Собирают смесь вдоль нижней стороне наконечника изогнутой шпателем и затем вращать трубки во время рисования шпателем вдоль стенки трубы. Смесь быстро высушить так что этот шаг необходимо сделать эффективно.
  9. Распределите смесь на подготовленную сетку с помощью щипцов, чтобы держать это в месте. Смесь должна быть равномерным слоем и заполнить в отверстия сетки.
  10. Погрузите изогнутый шпатель в пробирку, содержащую Hydron и использовать его пальто обе стороны сетки.
  11. Поместите покрытием сетки, опираясь на стороне против краю тарелки и позволяют сушки при комнатной температуре в течение 30-45 мин.
  12. Поместите сетку в -20 ° C морозильник или немедленно приступить к следующему шагу. Держите сетку внутри блюдо.
  13. Поместите 35 мм чашку внутри большую чашку Петри, крышку. Используйте пару щипцов осторожно вытяните волокна сетки помимо над 35 мм блюдо. Бродячие гранулы ссобираться из большего блюдо в конце.
    1. Проверьте гранулы для единообразия в области. Процесс производится около 250 гранул, таким образом, стандартную дозу на гранулу для bFGF и VEGF составляет 80 нг и 200 нг, соответственно.
  14. Храните гранулы в 35 мм блюдо в -20 ° C морозильник на срок до 3 месяцев.

2 Хирургическая имплантация пеллет

  1. Настройка хирургическое площадь под операционным микроскопом.
  2. Обезболить мышь авертином (400-500 мг / кг, внутрибрюшинно) и поместите курсор мыши под микроскопом так глаз видна. Выполните ног щепотку, чтобы обеспечить достаточный уровень анестезии.
  3. Обезболить глаз мыши, поместив 1 каплю пропаракаина решения на вершине глазного яблока. Подождите 20-30 сек и промокните марлевым тампоном.
  4. Proptose глаз мыши с заглушается # 1 ювелиров щипцы будучи уверенным, чтобы оставить кожу между щипцами и глаза. Важно, чтобы судить давление, приложенное правильно.60; Держа глаза слишком сильно будет приводить к его красной и раздраженной, а слишком свободно овладеть позволит глаз двигаться во время операции.
  5. Используйте 30 ° microknife надрезать в роговицу около 1 мм от лимба. Разрез должен быть 1-2 мм в длину. Разрез должен быть достаточно глубоким, чтобы проникнуть за эпителиального слоя в midstroma но не настолько глубоко, чтобы разорвать глаз.
  6. Используйте нож фон GRAEF сделать карман перпендикулярно разреза.
    1. Наденьте нож под рогового слоя в месте разреза и осторожно работать нож в и переместить его вдоль разреза, чтобы увеличить пространство, образуя карман. Это помогает перемещать мышь, а чтобы иметь возможность работать с кривизной глаза. Будьте осторожны, чтобы не нажать вниз кончиком, чтобы избежать разрыва глаз.
  7. Намочите щипцов в # 5 ювелирные с пропаракаина и выбрать шарик до из тарелки. Поместите шарик на глаз. Смочите нож фон GRAEF с пропаракаина и передать часть жидкости на гранулы, чтобы сделать его эластичным и податливым. Удалите излишки влаги с марлевым тампоном или ватным тампоном.
  8. Вставьте пулю в кармане, используя нож фон GRAEF чтобы задвинуть внутрь под роговицы слоя. После того, как весь осадок внутри, запустить ее плоской стороной фон Граеф ножом над сайта, чтобы проверить, что осадок является безопасным.
  9. Пальто глаз с тройным мазь с антибиотиком.
  10. Переверните мышь и повторить операцию в обратном глаза.

3 Количественное роговицы неоваскуляризации.

Оставьте животных развивать сосуды в течение установленного периода времени. День классификации судна зависит от фактора роста используемого. Оценка bFGF на 5 день и слабого VEGF на 6 день День имплантации день 0.

  1. Обезболить мышь авертином (400-500 мг / кг, внутрибрюшинно).
  2. Используйте щелевой лампы микроскоп для градинь. Один глазной имеет ридикюль, линий внутри окуляра, используемого в качестве измерительного помощи количественно длину судна и расстояние вокруг окружности глаза, что эти суда проросли.
    1. Держите мышь перед рамки, позиционирование мыши так глаз видел в окуляр с таблеткой прямо вперед. Стабилизировать голову между большим и указательным пальцами так кожа подтягивается на лице и глаза слегка proptosed.
  3. Поместите по оси Y. ридикюль вдоль лимба судна непосредственно под осадку. Измерьте длину сосудов ветвящихся вверх к гранул. Запишите это измерение в десятых долях миллиметра и назначить длина судна (VL) (Рисунок 1А).
  4. Включите мышь или ридикюль так, чтобы расстояние вокруг глаз, что эти суда проросли становится ясно. Легче всего думать глаза как циферблат с интервалом в 1 через 12 назначенным это число часы часовой (CH) (рис 1Б). Это может быть целый ряд или доли 0,25 (например, 2, 2,25, 2,5 или 2,75). Примечание: CH является субъективным. Например, некоторые из них могут измерять расстояние вокруг глаз, чтобы включать в себя все сосуды проросшие от лимба в то время как другие могут остановить измерение в точке, где длина судна составляет половину максимальной. Важным фактором должна быть последовательной с тем, как каждый хочет класса.

Рисунок 1
Рисунок 1 Количественная оценка роговицы неоваскуляризации. (А) 80 нг bFGF осадок имплантированы в C57BL / 6J мыши показывая щелевой лампы ридикюль ориентированный для измерения длины судна. В.Л. = 0,9 мм. (B) То же, глаза, показаны щелевой лампы ридикюль поворачивается измерить тактовую час. CH = 3.25. Рассчитано площадь судно = 1.84 мм 2. Эти изображения были цифровой обработке для обеспечения добавлением ридикюль схеме. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

  1. Вычислить площадь сосудов (VA), используя формулу, приведенную ниже, который основан на площади овала (Примечание, полезно иметь это в виду, оценивая.) Экспресс VA в миллиметрах в квадрате. Формула выглядит следующим образом:
    Судно длина х часов час х 0,2 π = площадь судно

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Типичные результаты для bFGF и VEGF гранул в нормальных низких ангиогенными C57BL / 6J показаны на рисунке 2А и В, соответственно. Фиг.2Е показывает нормальное распределение площади сосуда (VA) в / 6J штамма C57BL с различными дозами этих роста факторы. 80 нг bFGF гранулы обычно приводит к VA приблизительно 2,0 мм 2, при том, что значения в диапазоне 1,8-2,4 мм 2, являются приемлемыми. 200 нг VEGF гранулы обычно вызывают реакцию примерно 0,7 мм 2, с диапазоном допустимых значений 0,6-0,9 мм 2. Для экспериментов, где Антиангиогенный эффект подозревается, большие площади сосудов желательно, чтобы иметь возможность визуализировать снижение. Рисунок 3 показывает влияние антиангиогенному талидомида на bFGF-приводом неоваскуляризации. Лечение привело в 38% ингибированию роста сосудов. В экспериментах, где увеличение можетможно ожидать, что лучше всего использовать более низкие дозы, поскольку стандарт осадок вызывает около максимальный отклик. Пеллеты, состоящие из 10-40 нг bFGF бы более уместно (Рисунок 2C).

Штаммы известно, имеют высокий ангиогенеза ответ на конкретного фактора роста может иметь ВА более чем в два раза, что типичного низкого ангиогенной деформации. Рис 2D показывает ответ мыши 129S1 / SvImJ к 20 нг FGF гранул. Для сравнения, тот же доза осадок показано в C57BL / 6J на фиг.2С. Обширная таблица с подробным ангиогенную потенциал различных штаммов к как bFGF- и VEGF-индуцированной неоваскуляризации была ранее опубликована на нашей лаборатории 13.

Некоторые штаммы или пигментации могут демонстрировать рост или утечки сосудов радужной оболочки глаза в ответ на гранулы. Это может произойти в одном или обоих глазах индивидуальной мыши и может или не может быть последовательным над предприяIRE группу, в которой выполняется анализ. Это явление может привести к разрыву радужной оболочки сосудов, вызывающих кровь, чтобы заполнить переднюю камеру (Гифема). Hyphemas может сделать классификации новых сосудов роговицы трудно или невозможно. 4 иллюстрирует умеренное (4а) и тяжелой (4b) форму этого явления.

Рисунок 2
Рисунок 2 Примеры фактора роста-индуцированного роговичного неоваскуляризации. (А) 80 нг bFGF гранулы имплантировали в низкой ангиогенного C57BL / 6J мыши, в результате чего в зоне сосуда, равной 2,0 мм 2. Очень часто для этого дозы, чтобы вызвать сосуды достичь осадок и расти в него. (B) 20 нг bFGF осадок имплантировали вC57BL / 6J мыши, в результате чего в зоне сосуда, равной 1,04 мм 2. (С) 200 нг VEGF, гранулы имплантировали в C57BL / 6J мыши, в результате чего в зоне сосуда, равной 0,71 мм 2. (D) 20 нг bFGF пеллет в высокой ангиогенной деформации 129S1 / SvImJ. По сравнению с (С), и 20 нг FGF гранул, этот штамм имеет ангиогенный потенциал больше, чем в два раза превышает мышей C57BL / 6J. (E) роговицы неоваскулярная площадь (среднее ± стандартное отклонение, п = 10) в C57BL / 6J, вызванных увеличением дозы либо VEGF или bFGF. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3 Ингибирование bFGF-индуцированного VessРост эль по антиангиогенного средства. автомобиль () управления лечить C57BL / 6J мыши. Имплантация 80 нг bFGF гранул, что приводит к групповой области сосуда, равной 2,0 мм 2. (В) Талидомид обрабатывают мыши (200 мг / кг, полости рта в течение 5 дней). Площадь Группа судно равна 1,25 мм 2 и отражает 38% снижение роста сосудов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4 фактора роста-индуцированной hyphemas в мышиных радужной оболочки. () Мягкая гифема в C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Этот штамм обладает тот же роговицы новых сосудов, как их пигментных коллегами, но более пропе Айрис кровотечение. (B) Крупномасштабное гифема в мыши 129P3 / J. Вся глаз имеет красноватый оттенок, а также более выраженные лужи крови ближе к нижней части радужки. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько важных шагов в выполнении успешную роговицы анализа. Первый заключается в создании единых гранулы, способные быть имплантированы и стимулирования сосуды. Наиболее важные части подготовки гранул являются 1) с помощью носителя без фактора роста; 2) обеспечение хорошую смесь фактора роста с сукральфата и Hydron и 3) в движении, полученное смесь быстро, но тщательно от пробирку Эппендорф к сетке, где гранулы поданы. Рекомендуется "фиктивные" гранулы быть сделаны без фактора роста практиковать технику. Пеллеты должен появиться белый и меловой и быть примерно квадратной формы. Любые гранулы, которые включают четкие зоны должны быть исключены, так как эти районы вероятно содержат только Hydron. Следует также отметить, что гранулы выполнены с этанолом, и что bFGF и VEGF стабилизированы путем включения сукральфат, который имитирует гепаринсвязывающий. Сукральфат также служит, чтобы обеспечить медленное высвобождение плatform для факторов роста. Если другие стимуляторы или ингибиторы добавляют к гранулам, эти факторы должны быть проверены, чтобы определить первую стабильности в этаноле. Рекомендуется "фиктивные" гранулы быть сделаны без фактора роста, чтобы первоначально практиковать эту технику. "Пустышки" или фиктивных гранулы содержат только сукральфат и Hydron с PBS замещена по объему фактор роста или тестируемого соединения. Эти гранулы не стимулируют рост сосудов или лимбальную воспаление. Шам гранулы служить соответствующим контролем в экспериментах, где агент подозревается проангиогенных и проверяется без добавления фактора роста гранул. Соединения и фактор роста могут быть объединены в гранулы для случаев, когда взаимодействие расследуется, и в этом случае гранулы из фактора роста в одиночку было бы надлежащий контроль.

Хирургической имплантации является наиболее сложной частью анализа.0; Это изначально очень трудно оценить соответствующую глубину в разрез. Слишком глубоко разрез вызывает земной шар к разрыву и глаз становится неработоспособным. Это драматический эффект и, следовательно, один быстро учится не "поп" на первый взгляд. Это займет значительно больше времени, чтобы последовательно делать надрез достаточно глубоко, чтобы позволить формирование карманные. Когда разрез слишком мелкий, самый верхний слой роговицы легко повреждены или сорваны с ножом фон Граеф, как он вставлен, чтобы сделать карман. На заключительном этапе количественного роста новых сосудов требует последовательности в порядке, градуировки. Длина судна является простым измерений в то время как значение часа часов, изображающий рост по окружности глаза более субъективным. Используемый метод должен быть таким же, от мыши, мыши и между экспериментами.

Другим важным компонентом анализа является выбор анестезии, которая может иметьвлияние на легкости и успеха хирургической процедуры. Инъекций Авертин является наименее сложным, так как позволяет легко манипулировать мышью в отличие от испаренного анестезии доставляя сырье по носового конуса. Желательно, чтобы избежать комбинацию кетамина и ксилазина а за его связи с роговицы поражений у грызунов 16,17.

Важно отметить, любое изменение в весе мышей в ходе эксперимента. Потеря веса может свидетельствовать о плохих жилищных условиях или болезни, и они могут негативно повлиять на способность мыши расти сосудов в глаза. Массы должны быть приняты в дни пеллет имплантации и сортировки сосуда, чтобы определить процент веса потерял, если таковые имеются. Потеря 5% или менее приемлемо и может привести от стресса обработки мышей, особенно во время лечения экспериментов с частой дозировки. Более 5% потеря веса вызывает беспокойство и будет неспецифическиподавляют рост сосудов. Таким образом результаты таких экспериментов должны считаться недействительными.

Для учета присущих экспериментальных расхождений с техникой процедуры и эффективности переменных учился, минимальное количество мышей должны быть использованы для достижения достоверных результатов. По нашему опыту мы не советуем не менее чем 5 мышей в группе, дающих такое п 10 глазах.

Несмотря на многие преимущества роговицы micropocket анализа, есть также несколько ограничений. Основным недостатком является необходимость в течение относительно длительного периода обучения, чтобы овладеть техникой. Человек без предварительного технического опыта работы в глаза мыши потребует около четырех месяцев практики, прежде чем эксперименты 20-25 мышей может рассматриваться как надежный. Кроме того, есть некоторые различия между разными людьми, которые исполняют анализа, таким образом, ограничивая возможность сравнивать между экспериментами, что выполняютсяв разное время разными людьми. Другим ограничением этой модели является то, что эксперименты относительно короткие (5-6 дней) и ограничены выпуском bFGF или VEGF от осадка. Таким образом, этот анализ в высшей степени пригодны для лечения, которые имеют быстрый отклик в естественных условиях, хотя это может быть частично компенсируется за счет предварительной обработки мышей в течение желаемого промежутка времени перед процедурой. Стандартные наркологической анализы обычно начинаются администрацию в день пеллет имплантации (день 0) продолжается до дня аттестации (День 5 или 6).

Значимость этого метода является то, что он является одним из самых надежных количественных ангиогенеза анализов. В качестве альтернативы у мышей является Матригель вилка анализа, однако этот анализ более качественный и менее специфическими для определенного фактора роста в связи с обширной инфильтрации клеток, которое происходит в плунжер. Гибкость роговицы анализа позволяет адаптировать количествоангиогенеза генерируется и выбрать конкретный стимулятор. Можно заменить стандартные факторы роста с другими известными или подозреваемых ангиогенных факторов. Кроме того, можно объединить стандартные факторы роста и возможных ингибиторов в пределах того же гранулу, чтобы оценить антиангиогенной активностью без системной доставки. Наконец, этот анализ позволяет стимулировать ангиогенез на разных генетических фонов, которые могут быть полезны при отображении генетические эффекты и в установлении влияния конкретного гена на ангиогенез.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Кристин Джонсон для графических работ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1: Pellet preparation
Sucralfate Sigma #S0652
Hydron (aka Poly(2-Hema)) Sigma #P3932-10G
Ethanol Pharmco Products Inc #111000200CSGL
Growth factors: Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))
 Fibroblast growth factor (FGF) PeproTech #AF-100-18B
Vascular endothelial growth factor (VEGF) R D Systems #293-VE-050/CF
35 mm dish Becton-Dickson #353001 Used for storage of pellets
10 cm petri dish VWR #25384-342 Used as work surface for preparing pellets
Mesh Sefar America #03--300/51 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave
Spatulas Fisher Scientific #21-401-10 Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific #05-408-146 One for hydron, one for sucralfate
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2315E Need 2 for pulling mesh apart
Centrifugal evaporator ThermoSavant DNA110 SpeedVac
Section 2: Surgical implantation of pellets
Operating microscope Zeiss
2.5% Avertin General anesthetic
Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% Falcon NDC# 6131401601 Eye anesthetic
Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment Bausch Lomb NDC# 2420878055 Contains neomycin, polymixin and bacitracin
Ophthalmic microknife, 5 mm Surgistar #924501 30 degree angle
von Graef knife Ambler Surgical #3401E
Jewelers forceps, #1 Ambler Surgical #2301E Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2305E For picking up pellets and placing on eye
Small curved scissors Ambler Surgical #5636E For trimming whiskers
Gauze For blotting eye after proparacaine
Section 3: Grading of Corneal Neovascularization
2.5% Avertin General anesthetic
Slit lamp Nikon FS-2 Needs an ocular with a reticule to assist in measuring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
  2. Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
  3. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
  4. Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
  5. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
  6. Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
  7. Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
  8. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
  9. Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
  10. Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
  11. Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
  12. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
  13. Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
  14. Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
  15. Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
  16. Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
  17. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).

Tags

Neuroscience выпуск 90 Angiogensis neovasculatization, модель фактор роста фибробластов фактор роста сосудистого эндотелия
Роговицы Micropocket Анализ: Модель ангиогенеза в Mouse глаз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birsner, A. E., Benny, O., D'Amato,More

Birsner, A. E., Benny, O., D'Amato, R. J. The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (90), e51375, doi:10.3791/51375 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter