Summary
Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.
Abstract
Das Maushornhaut-Mikrotaschen-Assay ist ein robustes und quantitative in vivo-Test zur Bewertung der Angiogenese. Durch die Verwendung von standardisierten Slow-Release-Pellets, die bestimmte Wachstumsfaktoren, die Blutgefäßwachstum in der gesamten Hornhaut natürlich avaskuläre auslösen können Angiogenese gemessen und quantifiziert werden. In diesem Assay wird im Laufe von mehreren Tagen die angiogene Antwort erzeugt, abhängig von der Art und Dosis des Wachstumsfaktor verwendet wird. Die Induktion einer Neovaskularisation wird üblicherweise entweder durch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ausgelöst. Durch die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit Sucralfat und Hydron (Poly-HEMA (Poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) und Gießen der Mischung zu Pellets, können sie operativ in der Maus Auge implantiert werden. Diese einheitlichen Pellets langsam lösen Sie die Wachstumsfaktoren über fünf oder sechs Tage (bFGF oder VEGF beziehungsweise) ermöglicht ausreichend angiogene Antwort für Gefäßfläche q erforderlichuantification mit der Spaltlampe. Dieser Test kann für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Bewertung von angiogenen Modulators Medikamente oder Behandlungen sowie Vergleich zwischen unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu beeinflussen Angiogenese verwendet werden. Ein erfahrener Ermittler nach dem Üben dieses Assays können ein Pellet in weniger als 5 min pro Auge zu implantieren.
Introduction
Der Prozess der Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße zu bilden, auffindbar sind, ist sehr komplex und wird durch verschiedene endogene Faktoren, die verschiedene Schritte des Schiffes Keimen und Morphogenese Steuerung geregelt. Angiogenese aufgrund einer Verschiebung im Gleichgewicht zwischen pro-und anti-angiogene Faktoren, die das Gleichgewicht hält normalerweise das Gefßsystem in einem Ruhezustand ausgelöst. Angiogenese beim Erwachsenen kommt in bestimmten physiologischen Bedingungen wie bei der weiblichen ovariellen Zyklus oder Reparaturprozessen wie der Wundheilung und Geweberegeneration. Es ist jedoch auch ein Markenzeichen von mehreren Krankheiten, einschließlich Malignitäten, Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Die Beteiligung von Angiogenese in diesen physiologischen und pathologischen Bedingungen ist es ein wichtiges Thema für Forschung und ein attraktives Ziel für die Therapie.
Aufgrund der Komplexität der Angiogenese und der Beteiligung mehrerer ceLLS und Faktoren in dem Verfahren, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, zirkulierenden Zellen und Stromazellen in vitro-Modellen beschränkt bleiben und die einzigartige Mikroumgebung in vivo nicht zu wiederholen. Der Haupt in-vitro-Assays der Angiogenese sind weitgehend auf die Beobachtung direkte Auswirkungen auf Endothelzellen und Messen bestimmter Schritte in angiogenen Prozess unter kontrollierten Bedingungen konzentriert. Diese Assays umfassen die Quantifizierung der Endothelzellproliferation 1, Migration 2, Netzwerkbildung 3, 4 und Schlauchbildung Keime aus Sphäroiden. 5 Ex-vivo-Modellen, im Gegensatz zu den in vitro diejenigen, sind komplexer und enthalten mehrere Gewebezelltypen, wobei ein Beispiel die Aorten-Ring-Test 6. Dennoch, wie andere Systeme, kann es nicht den Beitrag von zirkulierenden Zellen und natürliche Stroma von Endothelzellen zu erfassen, wie in vivo existiert. VersucheAngiogenese unter Strömungs untersuchen, um die in vivo-Situation unter Verwendung mikrofluidischer Systeme 7 durchgeführt wird, aber auch diese Assays nachahmen, obwohl viel verbessert, sind noch nicht für alle in vivo vorhandenen Kammern entfallen.
Aufgrund der Einschränkungen der in vitro und ex vivo-Angiogenesemodellen in vivo Modellen bleibt das zuverlässigere Auswahl für Angiogenese-Studien. Beispiele für diese Modelle sind die Implantation von transparenten Kammern, "Fenster", die die Visualisierung von wachsenden Blutgefäße unter dem Mikroskop 8 zu ermöglichen, injizierbare subkutane Implantate wie Matrigel und Gefäßbildung in normalen Geweben wie Mausohr und dem Huhn Chorioallantoismembran (CAM ). Allerdings ist eine der akzeptablen und quantitative in vivo Angiogenese-Modellen die hier beschriebene Hornhautmikrotaschen-Assay Neovaskularisierung, welche das natürlich avaskulären nutztHornhaut als "Bildschirm" zu visualisieren und zu beurteilen, neue angiogene Wachstums 9.
Hier beschreiben wir die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. Zunächst wurde das Modell verwendet werden, um unspezifische Reize angiogenen in Kaninchen-Hornhaut messen. Dies wurde durch die Einführung von Tumorstücke in das Kammerwasser von der Vorderkammer des Auges des Kaninchens durchgeführt und gemessen Tumor-induzierte Neovaskularisierung 11.
Allerdings wurde der Test später entwickelt, um Effekte von spezifischen Wachstumsfaktoren zu untersuchen 10, besser zu spezifizieren und zu standardisieren, die angiogene Wirkung. Um den Wachstumsfaktor in das Auge zu lösen, wurden Pellets mit langsamer Freisetzung, die bekannte Mengen von angiogenen Wachstumsfaktoren anstelle von Geweben verwendet. Die Verfügbarkeit von gereinigten rekombinanten Proteine angiogenen wie bFGF oder VEGF aktiviert ihre Verwendung als spezifische Ziele der Angiogenese modulaters 12. Zunächst wurde der Assayweitgehend in Kaninchen, die einfacher, mit aufgrund ihrer Größe, aber später wurde das Modell in Mäuse setzten Werk verwendet werden; ein kleiner und kostengünstiger Tiermodell. Der Wechsel von Kaninchen, Mäuse vorgesehen einen wichtigen Vorteil in der Lage zu genetisch manipulierten Tieren zu verwenden, wodurch eine neue Ära der Erforschung der genetischen Komponenten beeinflussen die Angiogenese 13 entsteht. Neben der Nutzung von akzeptabler Hornhaut-Test bei der Untersuchung der Angiogenese, andere biologische Prozesse können ebenfalls unter Verwendung von modifizierten Assays untersucht. So wurden beispielsweise Studien von Lymphangiogenese möglich durch die Implantation von niedrig dosiertem bFGF-Pellets, die die Visualisierung von Lymphgefäßen durch spezifische molekulare Marker 14 erlaubt werden. Darüber hinaus hat dieser Test ein Mittel, um die Wirkung der Strahlung auf die Angiogenese zu bewerten 15 vorgesehen.
In Summe ist die Hornhaut-Mikro Angiogenese-Assay eine quantitative, reproducible, flexible Beurteilung der Angiogenese in vivo. Ein großer Vorteil dieses Tests besteht darin, dass die Messung der Hintergrundgefäße unnötig, weil die Behälter wachsen auf einem natürlich avaskulären Gewebe. Wir beschreiben hier das Protokoll dieses Tests in Details und verschiedenen Szenarien, die auftreten können, zu diskutieren. Der Test besteht aus 3 diskrete Segmente. Hier werden wir die Herstellung von Wachstumsfaktor-inclusive-Pellets, die spätere chirurgische Implantation und schließlich die Methode verwendet, um die daraus resultierenden neovaskulären Wachstum zu quantifizieren.
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Protocol
Alle Protokolle mit Tieren sind, die von der Institutional Animal Care und Use Committee im Kinderkrankenhaus Boston vorgestellt und genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC) durchgeführt. Achten Sie darauf, sterile Instrumente und aseptischen techniqure verwenden, während der Durchführung des Verfahrens.
1. Herstellung der Pellets
- Wiegen Sie 10 mg von Sucralfat und 60 mg hydron mit der sterilen ungebeugt Spachtel. In getrennten Mikrozentrifugenröhrchen.
- Setzen Sie eine 1 cm quadratisches Stück von Mesh in eine sterile 10 cm Schüssel. Invertieren, so Netz ruht auf flachen Deckel. Beiseite stellen.
- Fügen Sie 500 ul Ethanol zum hydron und Wirbel für mindestens 10 min.
- Die entsprechende Menge von Wachstumsfaktor-(Standard: 20 ug für bFGF, 50 ug für VEGF) mit dem Sucralfat und kurz vortexen. Shop-Wachstumsfaktor in eine-80 ° C-Tiefkühler bei einer Konzentration von 1 mg / ml. Flüssigkeitsvolumen zugegeben wird, sollte ein Minimum von 20 ul, die Sucralfat vollständig benetzt zu gewährleisten, sollte jedoch 50 ul betragen. Größeres Volumen macht die Verdampfung der Flüssigkeit im nächsten Schritt schwierig.
- Legen Sie die Mischung in die Sucralfat Zentrifugalverdampfer auf niedrig eingestellt, bis die Mischung vollständig trocken ist, normalerweise 30-50 min je nach dem Volumen der Flüssigkeit verwendet.
- Überprüfen Sie die Mischung für Restfeuchte mit der konischen Ende eines sterilen Spatel. Die Mischung sollte "knackig" zu fühlen.
- Verwenden Sie das verjüngte Ende des Spachtel, um in der Röhre brechen die Sucralfat Mischung.
- Werden 10 ul der zu Hydron Sucralfat.
- Aufgrund der Natur der viskosen hydron, schneiden Sie das Ende von einem 200 ul Pipettenspitze und zeichnen Sie dann und lassen Sie die 10 ul vor dem Pipettieren wieder und Ergänzung Sucralfat.
- Verwenden schnell gebogen spuckteula, die hydron und Sucralfat mischen und aus dem Rohr zu entfernen.
- Sammeln Sie die Mischung entlang der Unterseite der Spitze des gebogenen Spatel und dann durch Drehen des Rohres beim Zeichnen der Spatel entlang der Wand des Rohres. Die Mischung wird rasch trocknen, so muss dieser Schritt effizient durchgeführt werden.
- Verbreiten Sie die Mischung auf die vorbereitete Mesh mit einer Pinzette, um sie in Position zu halten. Die Mischung sollte eine gleichmäßige Schicht zu füllen und in die Löcher des Netzes.
- Tauchen Sie den gebogenen Spatel in das Röhrchen mit hydron und verwenden Sie es Mantel beide Seiten des Netzes.
- Das beschichtete Gitter stützte sich auf Seite gegen Rand der Schale und trocknen bei RT für 30-45 min.
- Legen Sie das Netz in -20 ° C Gefrierschrank oder gehen Sie sofort zum nächsten Schritt. Halten Sie Netz-Innenschale.
- Legen Sie die 35-mm-Schale im Inneren der größeren Petrischale, Deckel ab. Verwenden Sie die Zange, um die Fasern des Netzes auseinander über die 35-mm-Schale vorsichtig abziehen. Streu Pellets cein von der größeren Schüssel am Ende gesammelt werden.
- Überprüfen Pellets für Einheitlichkeit unter Rahmen. Das Verfahren ergibt ca. 250 Pellets somit die Standarddosis pro Pellet für bFGF und VEGF 80 ng und 200 ng auf.
- Speicher Pellets in 35 mm-Schale in 20 ° C-Gefrierschrank für 3 Monate.
2. Chirurgische Implantation von Pellets
- Einrichtung eines OP-Bereich unter Operationsmikroskop.
- Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) und positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop, so Auge sichtbar ist. Führen toe Prise ausreichende Anästhesie zu gewährleisten.
- Betäuben die Maus Auge, indem 1 Tropfen Proparacain Lösung oben auf Augapfels. Warten Sie 20-30 Sekunden und tupfen mit einem Gaze-Pad.
- Proptose die Maus mit dem Auge abgestumpft # 1 Juweliere Zange sicher zu sein, um die Haut zwischen Pinzette und Augen verlassen. Es ist wichtig, den Druck korrekt angewendet beurteilen.60; Halten Sie die Augen zu fest wird dazu führen, dass rot und gereizt zu werden, während eine zu locker halten können, um während der Operation Auge zu bewegen.
- Verwenden Sie die 30 ° microknife um einen Einschnitt in die Hornhaut zu etwa 1 mm vom Limbus. Der Schnitt sollte 1-2 mm lang sein. Einschnitt sollte tief genug sein, um über die Epithelschicht in midstroma eindringen, aber nicht so tief, um das Auge, bersten.
- Verwenden Sie die von Graef Messer, um eine Tasche senkrecht zur Schnittführung machen.
- Schieben Sie das Messer unter der Hornhautschicht an der Einschnittstelle und sanft arbeiten Messer in und es entlang der Schnitt, um den Raum zu vergrößern, wodurch die Tasche entsteht. Es hilft, um die Maus zu bewegen und in der Lage sein, um mit der Krümmung des Auges zu arbeiten. Achten Sie darauf, mit der Spitze nach unten zu drücken, um zu vermeiden, Aufbrechen des Auges.
- Befeuchten Sie die Zange # 5 Juwelier mit Proparacain und wählen Sie ein Pellet aus Schale. Legen Sie ein Pellet auf dem Auge. Befeuchten Sie die von Graef Messer mit Proparacain und übertragen einige der Flüssigkeit auf Pellet es gummiartig und biegsam zu machen. Überschüssige Feuchtigkeit mit Gaze oder einem Wattestäbchen.
- Legen Sie die Tablette in die Tasche mit dem von Graef Messer, um es im Inneren der Hornhaut unter Schicht schieben. Sobald die gesamte Pellet drinnen ist, führen Sie die flache Seite von Graef Messer über Website, um zu überprüfen, dass das Pellet sicher ist.
- Mantel das Auge mit Dreifach-antibiotische Salbe.
- Drehen Sie die Maus um und wiederholen Chirurgie in der entgegengesetzten Auge.
3. Quantifizierung der Hornhaut-Neovaskularisation.
Tiere verlassen auf Schiffe über einen festgelegten Zeitraum zu entwickeln. Der Tag des Schiffes Einstufung hängt von Wachstumsfaktor verwendet. Grade bFGF an Tag 5 und dem schwächeren VEGF am Tag 6 Der Tag der Implantation ist Tag 0.
- Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal).
- Verwenden Sie das Spaltlampenmikroskop für grading. Ein Augen hat ein Fadenkreuz, Linien innerhalb des Okulars als Messhilfe verwendet werden, um Gefäßlänge und der Abstand um den Umfang des Auges, die die Gefäße gekeimt quantifizieren.
- Halten Sie die Maus vor der Umfang, die Positionierung der Maus so Auge in Auge mit Pellet direkt vor gesehen. Stabilisieren Sie den Kopf zwischen Daumen und Zeigefinger so Haut auf Gesicht gestrafft und Auge leicht proptosed.
- Platzieren der y-Achse des Fadenkreuzes auf dem Limbus Behälter direkt unterhalb Pellets. Messen Sie die Länge der Schiffe Verzweigung nach oben in Richtung Pellets. Notieren Sie sich diese Messung in Zehntel Millimetern und bezeichnen Gefäßlänge (VL) (Abbildung 1A).
- Schalten Sie entweder die Maus oder die Zielmarke, so dass der Abstand rund um das Auge, dass diese Schiffe haben gekeimt klar wird. Am einfachsten ist es des Auges als Zifferblatt mit Abständen von 1 bis 12 designierten denke diese Zahl vollen Stunde (CH) (Abbildung 1B). Es kann eine ganze Zahl oder Bruchteile von 0,25 (Beispiel 2, 2,25, 2,5 oder 2,75) sein. Hinweis: CH ist subjektiv. Zum Beispiel können einige den Abstand um das Auge zu messen, um alle Schiffe aus dem Limbus gekeimt, während andere möglicherweise nicht messen an dem Punkt, wo Schiffslänge ist die Hälfte der maximalen gehören. Wichtig ist, stimmt mit der man beschließt, Klasse zu sein.
Abbildung 1. Die Quantifizierung der Hornhautgefäßneubildung. (A) 80 ng bFGF-Pellet in C57BL / 6J Maus zeigt Spaltlampe Fadenkreuz ausgerichtet, um Schiffslänge messen implantiert. VL = 0,9 mm. (B) Gleiche Auge zeigt Spaltlampe Fadenkreuz gedreht, um vollen Stunde messen. CH = 3.25. Berechnet Gefäßfläche = 1,84 mm 2. Diese Bilder wurden digital erhöht, um für die Zugabe von Fadenkreuz schematische ermöglichen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
- Berechnen Sie die Gefäßfläche (VA) mit Hilfe der folgenden Formel, die auf dem Gebiet eines ovalen basiert (Anmerkung, ist es hilfreich, dies bei der Einstufung zu halten.) In Millimetern im Quadrat Express VA. Die Formel ist wie folgt:
Schiffslänge x 0,2 x Uhrzeit-π = Fahrzeug-Bereich
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Representative Results
Typische Ergebnisse für bFGF und VEGF-Pellets in den normalen niedrigen angiogenen C57BL / 6J Mäuse werden in 2A und B gezeigt. 2E zeigt die normale Verteilung der Gefäßfläche (VA) in der C57BL / 6J Belastung mit variierenden Dosen von diesen Wachstums Faktoren. 80 ng bFGF Pellets normalerweise in einer VA von etwa 2,0 mm 2 führen, wenn Werte in einem Bereich von 1,8 bis 2,4 mm 2 sind akzeptabel. 200 ng VEGF-Pellets führen typischerweise eine Reaktion von etwa 0,7 mm 2, mit einem Bereich von annehmbaren Werten von 0,6-0,9 mm 2. Für Experimente, bei denen ein Anti-Angiogenese-Wirkung vermutet wird, größer Gefäßbereichen wünschenswert, eine Abnahme zu visualisieren. Abbildung 3 zeigt die Wirkung der anti-angiogene Arzneimittel Thalidomid auf bFGF getriebenen Neovaskularisation. Behandlung führte in 38% ige Hemmung der Gefäßwachstum. In Experimenten, bei denen eine Erhöhung kannerwartet werden es am besten, niedrigere Dosen verwenden, wie die Standard-Pellet bewirkt eine nahezu maximale Antwort. Pellets, bestehend aus 10-40 ng bFGF wäre angemessener (2C) sein.
Stämme bekannt, eine Hoch angiogene Reaktion auf einen bestimmten Wachstumsfaktor haben, kann eine VA mehr als das Doppelte einer typischen Tief angiogenen Stamm. 2D zeigt die Antwort eines 129S1 / SvImJ Maus 20 ng FGF-Pellet. Zum Vergleich wird die gleiche Dosierung Pellets in einer C57BL / 6J in 2C gezeigt. Eine umfangreiche Tabelle mit den angiogenen Potenzial der verschiedenen Stämme, sowohl bFGF- und VEGF-induzierten Gefäßneubildung wurde zuvor von unserem Labor 13 veröffentlicht.
Bestimmte Stämme oder Pigmentierungen kann das Wachstum oder die Leckage der Irisgefäße als Reaktion auf ein Pellet aufweisen. Dies kann in einer oder beiden Augen eines einzelnen Maus und kann oder auch nicht konsistent über die Un seinIRE-Gruppe, in der der Assay durchgeführt. Dieses Phänomen kann in Bruch der Iris Gefäße welches das Blut in der Vorderkammer (hyphema) füllen führen. Hyphemas machen kann Einstufung der Hornhaut-Neovaskularisation schwierig oder unmöglich. Abbildung 4 zeigt ein mild (4A) und schwerer (4B) Form dieses Ereignis.
Figur 2 Beispiele für Wachstumsfaktor-induzierte corneale Neovaskularisierung. (A) 80 ng bFGF-Pellet in eine Nieder angiogenen C57BL / 6J Maus implantiert, was zu einem Gefäßbereich gleich 2,0 mm 2. Es ist sehr häufig für diese Dosis zu verursachen Gefäße, um das Pellet zu erreichen und wachsen hinein. (B) 20 ng bFGF Pellets in eine implantiertC57BL / 6J Maus, was zu einer Gefäßfläche gleich 1,04 mm 2. (C) 200 ng VEGF in ein Pellet C57BL / 6J Maus implantiert, was zu einem Gefäß Fläche gleich 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF-Pellet in der Hoch angiogenen 129S1 / SvImJ Belastung. Im Vergleich zu (C), ebenfalls ein 20 ng FGF-Pellet hat dieser Stamm eine angiogene Potential größer als das Doppelte der C57BL / 6J Mäusen. (E) Hornhaut neovaskulären Bereich (Mittelwert ± SD, n = 10) in C57BL / 6J Mäusen durch steigenden Dosen von entweder VEGF oder bFGF induziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Hemmung der bFGF-induzierten vessEL Wachstum von anti-angiogenen Mittels. (A) Kontrolle Vehikel behandelten C57BL / 6J Maus. Implantation von 80 ng bFGF Pellet was in einer Gruppe Gefäßfläche gleich 2,0 mm 2. (B) behandelten Maus Thalidomid (200 mg / kg, oral 5 Tage). Gruppe Gefäßfläche gleich 1,25 mm 2 und reflektiert 38% ige Abnahme der Gefäßwachstum. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Growth Factor-induzierten hyphemas in den Maus-Iris. (A) Mild hyphema in einer C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Dieser Stamm zeigt die gleiche Hornhautgefäßneubildung als ihre Gegenstücke pigmentiert ist aber prone Iris Blutungen. (B) im großen Maßstab hyphema in einem 129P3 / J-Maus. Das gesamte Auge hat eine rötliche Tönung sowie ausgeprägter Blutlachen näher an Boden der Iris. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Durchführung einer erfolgreichen Hornhauttest. Die erste ist es, einheitliche Pellets geeignet ist, eingepflanzt und anregende Gefäße. Die wichtigsten Teile des Pelletzubereitung sind: 1) unter Verwendung von trägerfreien Wachstumsfaktor; 2) die Sicherstellung einer guten Mischung aus Wachstumsfaktor mit dem Sucralfat und hydron und 3), die sich die endgültige Mischung zügig, aber sorgfältig von der Eppendorf-Röhrchen auf das Netz, wo die Pellets gegossen werden. Es wird empfohlen, "Dummy"-Pellets ohne Wachstumsfaktor, um das Verfahren zu praktizieren. Pellets sollte weiß und kalkhaltigen auftreten und etwa quadratische Form. Pellets, die klaren Bereiche umfassen sollte ausgeschlossen werden, da diese Bereiche nur hydron enthalten wahrscheinlich. Es sollte auch beachtet werden, dass die Pellets mit Ethanol und diesem bFGF und VEGF gebildet werden durch die Inklusion von Sucralfat, die imitiert Heparinbindung stabilisiert werden. Sucralfat dient auch dazu, eine langsame Freisetzung pl bietensic h für die Wachstumsfaktoren. Wenn andere Stimulatoren oder Inhibitoren zu den Pellets zugegeben, sollten diese Faktoren zuerst getestet, um die Stabilität in Ethanol zu bestimmen. Es wird empfohlen, "Dummy"-Pellets ohne Wachstumsfaktor, um die Technik zunächst zu praktizieren. "Dummy" oder Schein-Pellets enthalten nur Sucralfat und Hydron mit PBS für das Volumen der Wachstumsfaktor oder substituierte Verbindung getestet. Diese Pellets nicht stimulieren Gefäßwachstum oder Limbus Entzündung. Sham Pellets dienen als geeignete Steuerung in Experimenten, bei denen ein Agens der pro-angiogene Verdacht und ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren auf die Pellets getestet. Verbindungen und Wachstumsfaktor kann in Pellets für Fälle, in denen eine Wechselwirkung untersucht wird, wobei Pellets der Wachstumsfaktor allein wäre die geeignete Kontrolle kombiniert werden.
Chirurgische Implantation ist der schwierigste Teil des Tests.0; Es ist zunächst sehr schwierig, die geeignete Tiefe für den Schnitt zu messen. Zu tief ein Einschnitt bewirkt, dass die Welt zu Bruch und das Auge nicht mehr betriebsfähig. Dies ist eine dramatische Wirkung und damit man schnell lernt, nicht zu "Pop" das Auge. Es dauert wesentlich länger, um einen Einschnitt tief genug, um Taschenbildung ermöglichen konsequent machen. Wenn der Einschnitt zu flach ist, wird die oberste Schicht der Hornhaut leicht beschädigt oder die von Graef Messer abgerissen, wie es eingesetzt wird, um die Tasche zu bilden. Der letzte Schritt der Quantifizierung des neuen Schiffes Wachstum erfordert Konsistenz in der Art der Sortierung. Fahrzeuglänge ist eine einfache Messung, während der Uhrzeit-Wert darstellt, das Wachstum um den Umfang des Auges ist subjektiv. Die verwendete Methode sollte das gleiche von der Maus zum Maus und zwischen den Experimenten sein.
Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Tests ist die Wahl der Anästhesie, die haben kannEin Einfluss auf die Leichtigkeit und den Erfolg des chirurgischen Eingriffs. Injizierbare avertin ist die am wenigsten kompliziert, wie es ermöglicht eine einfache Handhabung der Maus im Gegensatz zu verdampfenden Anästhesie über Nasenkegel geliefert. Es ist ratsam, um die Kombination von Ketamin und Xylazin sowie vermeiden wegen seiner Vereinigung mit Hornhautläsionen bei Nagern 16,17.
Es ist wichtig, um eine Änderung in dem Gewicht der Mäuse während des Experiments beachten. Gewichtsverlust kann Hinweis auf schlechte Wohnverhältnisse oder Krankheit sein und diese können einer Maus Fähigkeit, Gefäße im Auge wachsen negativ beeinflussen. Gewichte sollten an den Tagen der Pelletimplantation und Sortierbehälter entnommen, um den Prozentsatz an Gewicht verloren, wenn überhaupt zu bestimmen. Verlust von 5% oder weniger akzeptabel ist und von den Belastungen der Behandlung der Mäuse, speziell in der Behandlung Experimente mit häufigen Dosierung führt. Mehr als 5% Gewichtsverlust ist Besorgnis erregend und wird unspezifischGefäßwachstum zu unterdrücken. So ergibt sich aus solchen Experimenten als ungültig betrachtet werden.
Um inhärenten Abweichungen von experimentellen Verfahren und Technik der Wirksamkeit der untersuchten Variablen zu berücksichtigen, eine Mindestzahl von Mäusen verwendet, um gültige Ergebnisse zu erzielen. In unserer Erfahrung raten wir nicht weniger als 5 Mäuse pro Gruppe ergibt ein n von 10 Augen.
Trotz der vielen Vorteile der Hornhaut-Mikrotaschen-Assay gibt es auch einige Einschränkungen. Der größte Nachteil ist die Notwendigkeit für eine relativ lange Einarbeitungszeit, um die Technik zu beherrschen. Ein Individuum ohne technische Erfahrung in der Arbeit in der Maus Auge würde erfordern, etwa vier Monate vor der Praxis Experimente von 20-25 Mäusen könnte als zuverlässig angesehen werden. Darüber hinaus gibt es einige Unterschiede zwischen verschiedenen Personen, die den Test durchzuführen, wodurch die Möglichkeit des Vergleichs zwischen den Experimenten, die durchgeführt werden Begrenzungsin verschiedenen Zeiten von verschiedenen Personen. Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist, dass Experimente sind relativ kurz (5-6 Tage) und werden durch die Freisetzung von bFGF oder VEGF aus dem Pellet beschränkt. Daher ist dieser Test sehr gut für Therapien, die eine schnelle Reaktion in vivo haben, obwohl dies teilweise durch die Vorbehandlung der Mäuse für gewünschte Zeitdauer vor dem Verfahren kompensiert werden. Standard Drogentests Tests beginnen in der Regel Verwaltung am Tag der Implantation Pellet (Tag 0) weiterhin bis zum Tag der Einstufung (Tag 5 oder 6).
Die Bedeutung dieser Technik ist, dass es eine der zuverlässige quantitative Angiogenese-Assays. Eine Alternative bei Mäusen ist die Matrigel-Plug-Assay Dieser Assay ist jedoch eher qualitativ und weniger spezifisch für einen bestimmten Wachstumsfaktor aufgrund eines erheblichen Zellinfiltration, die in den Stecker auftritt. Die Flexibilität der Hornhaut-Assay ermöglicht es, die Menge anzupassenAngiogenese erzeugt und an einen spezifischen Stimulator wählen. Es ist möglich, die Standard-Wachstumsfaktoren mit anderen bekannten oder vermuteten angiogenen Faktoren zu ersetzen. Zusätzlich ist es möglich, Standard-Wachstumsfaktoren und Inhibitoren möglich innerhalb des gleichen Pellets, um anti-angiogener Aktivität zu bewerten, ohne eine systemische Abgabe zu kombinieren. Schließlich ermöglicht dieser Test ein, um die Angiogenese auf unterschiedlichen genetischen Hintergründen, die nützlich bei der Kartierung der genetischen Effekte und in der Ermittlung der Auswirkungen eines bestimmten Gens auf die Angiogenese stimulieren kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Kristin Johnson für die grafische Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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