Summary
הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.
Abstract
Assay micropocket קרנית העכבר הוא assay חזק וכמותיים in vivo להערכת אנגיוגנזה. על ידי שימוש בכדורים בשחרור איטי סטנדרטיים המכילים גורמי גדילה ספציפיים שמעוררים צמיחת כלי דם בכל הקרנית באופן טבעי avascular, אנגיוגנזה ניתן למדוד ולכמת. ב assay זה התגובה angiogenic נוצרה במהלך כמה ימים, תלוי בסוג והמינון של גורם גדילה בשימוש. האינדוקציה של neovascularization מופעלת בדרך כלל על ידי או גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF) או גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF). על ידי שילוב של הגורמים הללו צמיחה עם סוקרלפט וHydron (פולי המו (פולי (methacrylate 2-Hydroxyethyl))) וליהוק התערובת לתוך כדורים, הם יכולים להיות מושתלים בניתוח בעין העכבר. כדורים אחידים אלה לאט-לשחרר גורמי גדילה על פני חמישה או שישה ימים (bFGF או VEGF בהתאמה) המאפשרים תגובת angiogenic מספיקה הנדרשת לq אזור הספינהuantification באמצעות מנורת סדק. assay זה יכול לשמש ליישומים שונים, כוללים ההערכה של תרופות angiogenic מאפנן או טיפולים, כמו גם השוואה בין רקע גנטי שונה המשפיע על היווצרות כלי דם. חוקר מיומן לאחר תרגול assay זה יכול להשתיל גלולה בפחות מ -5 דקות לכל עין.
Introduction
התהליך של אנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים בצורה קודמת נותרים אלה, הוא מורכב מאוד והוא מוסדר על ידי מספר גורמים במשק ששולטים בצעדים שונים של הנבטה הכלי והמורפוגנזה. אנגיוגנזה מופעלת עקב שינוי באיזון בין גורמים בעד ונגד אנגיוגנזה, איזון, כי בדרך כלל שומר על כלי הדם במצב שקט. אנגיוגנזה במבוגרים מתרחשת בתנאים מסוימים פיסיולוגיים כמו במהלך מחזור השחלות הנקבה או בתהליכי תיקון כגון ריפוי פצעים והתחדשות רקמות. עם זאת, זה גם סימן היכר של כמה פתולוגיות הכוללים גידולים ממאירים, מחלות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. המעורבות של אנגיוגנזה בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים אלה הופכת אותו לנושא חשוב למחקר וליעד אטרקטיבי לטיפול.
בשל המורכבות של אנגיוגנזה ומעורבותם של כמה ceLLS וגורמים בתהליך, כוללים תאים אנדותל, pericytes, תאים במחזור ותאי סטרומה, במודלים חוץ גופית יישארו מוגבלים ולא יכולים לשחזר את microenvironment הייחודי in vivo. העיקרי במבחני חוץ גופית של אנגיוגנזה מתמקדים במידה רבה בהתבוננות השפעות ישירות על תאי האנדותל ומדידת צעדים מסוימים בתהליך angiogenic בתנאים מבוקרים. מבחני אלה כוללים את הכימות של תא האנדותל התפשטות 1, הגירה 2, היווצרות רשת 3, היווצרות צינור 4 ומבצבצות spheroids 5. דגמי Ex vivo, שלא כמו במבחנה אלה, הם מורכבים יותר ולשלב סוגים שונים של תאי רקמה, דוגמא ש assay טבעת אב העורקים 6. עם זאת, כמו מערכות אחרות, זה לא יכול ללכוד את תרומתם של תאים במחזור וסטרומה הטבעית של תאי האנדותל כקיים בגוף חי. ניסיונותללמוד אנגיוגנזה תחת זרימה לחקות את הגדרת in vivo מבוצעים באמצעות מערכות microfluidic 7, אפילו אולם מבחני אלה, למרות שהשתפר מאוד, עדיין לא מצליחין להסביר את כל התאים קיימים בגוף חי.
בשל המגבלות של במבחנה ולשעבר מודלים אנגיוגנזה vivo, in vivo מודלים יישארו הבחירות אמינות יותר ללימודי אנגיוגנזה. דוגמאות למודלים אלה כוללים השתלה של תאים שקופים, "חלונות", המאפשרים ההדמיה של כלי דם גדלו תחת מיקרוסקופ 8, CAM שתלים תת עורית בהזרקה כגון היווצרות matrigel וכלי ברקמות נורמליות כמו אוזן עכבר וקרום chorioallantoic העוף ( ). עם זאת, אחד מדגמי אנגיוגנזה in vivo המקובלים וכמותיים ביותר הוא assay קרנית neovascularization micropocket המתואר כאן, המנצל את באופן טבעי avascularקרנית כ" מסך "כדי לחזות ולהעריך צמיחת angiogenic חדשה 9.
כאן אנו מתארים את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים. בתחילה המודל המשמש למדידת גירויי angiogenic ספציפיים בקרניות ארנב. הדבר נעשה על ידי החדרת חתיכות גידול לתוך ההומור המימית של הלשכה הקדמית של העין הארנב ונמדד neovascularization מושרה גידול 11.
עם זאת, assay מאוחר יותר התפתח לחוקר את ההשפעות של גידול ספציפי גורמי 10 לציין טוב יותר ולתקנן את השפעת angiogenic. על מנת לשחרר את גורם הגדילה בעיניים, כדורים בשחרור איטי המכילים כמויות ידועות של גורמי גדילת angiogenic שמשו במקום רקמות. הזמינות של חלבוני angiogenic רקומביננטי מטוהרים כגון bFGF או VEGF אפשרה את השימוש בם כמטרות ספציפיות של modulaters אנגיוגנזה 12. בתחילה, assay היהמשמש בעיקר בארנבות, שהם קלים יותר לעבוד עם בשל גודלם, אך מאוחר יותר המודל תורגם לעכברים; מודל חיה קטן יותר ופחות יקר. עובר מארנב לעכברים סיפק יתרון חשוב של להיות מסוגל להשתמש בבעלי חיים מניפולציות גנטיים, ובכך ליצור תחום חדש של מחקר למרכיבים הגנטיים המשפיעים על היווצרות כלי דם 13. בנוסף לשימוש מקובל יותר של assay קרנית בלימוד אנגיוגנזה, תהליכים ביולוגיים אחרים יכולים גם נחקר באמצעות מבחני שונה. לדוגמא, מחקרים של lymphangiogenesis התאפשרו באמצעות ההשתלה של כדורים במינון bFGF נמוכים שאפשרו להדמיה של כלי הלימפה דרך סמנים מולקולריים ספציפיים 14. בנוסף, assay זה סיפק אמצעי כדי להעריך את ההשפעות של קרינה על אנגיוגנזה 15.
לסיכום, assay אנגיוגנזה micropocket הקרנית הוא כמותי, נציגroducible, הערכה גמישה של אנגיוגנזה in vivo. יתרון עיקרי של assay זה הוא שהמדידה של כלי רקע היא מיותרת, משום שהכולים גדלים על רקמות באופן טבעי avascular. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול של assay זה בפרטים ולדון בתרחישים שונים שיכול להתרחש. Assay כולל 3 מקטעים בדידים. כאן אנו מתארים את ההכנה של כדורי גורם כלול צמיחה, השתלה כירורגית שלאחר מכן ולבסוף שיטה לכמת את צמיחת neovascular וכתוצאה מכך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים מוצגים ולאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון ונערכים בהתאם להמלצותיה של האגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC). הקפד להשתמש מכשור סטרילי וtechniqure ספטית בעת ביצוע ההליך.
1 הכנת פלטות
- לשקול את 10 מ"ג של סוקרלפט ו60 מ"ג של Hydron עם מרית ניע סטרילי. מניחים בmicrocentrifuge צינורות נפרדים.
- מניחים פיסה מרובעת 1 סנטימטר של רשת לתוך צלחת 10 סנטימטר סטרילי. היפוך כל כך רשת נשענת על מכסה רדוד. מניח בצד.
- הוסף 500 μl של אתנול לHydron והמערבולת לפחות 10 דקות.
- הוסף את הכמות המתאימה של גורם גדילה (סטנדרטי: 20 מיקרוגרם לbFGF, 50 מיקרוגרם לVEGF) לסוקרלפט ובקצרה מערבולת. גורם גדילת חנות ב-80 ° C מקפיא בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כרכי נוזל הוסיפו צריכים להיות מינימום של 20 μl כדי להבטיח סוקרלפט היא הרטיבה לגמרי, אבל לא יעלו על 50 μl. נפח גדול יותר הופך את האידוי של הנוזל בשלב הבא קשה.
- מניחים את תערובת סוקרלפט למאייד צנטריפוגלי על החום נמוך עד שהתערובת יבשה לחלוטין, בדרך כלל 30-50 דקות בהתאם לכמות של נוזל המשמשת.
- בדוק את התערובת ללחות שיורית עם הקצה החד של מרית סטרילי. התערובת צריכה להרגיש "פריכה".
- השתמש בקצה החד של המרית כדי לשבור את תערובת סוקרלפט בתוך הצינור.
- הוסף 10 μl של Hydron לסוקרלפט.
- בשל האופי צמיג של Hydron, לחתוך את הקצה מקצה pipet 200 μl ולאחר מכן לצייר ולשחרר את 10 μl לפני pipetting למעלה שוב ומוסיף לסוקרלפט.
- במהירות להשתמש ירק כפוףאולא לערבב Hydron וסוקרלפט ומסירים מצינור.
- אסוף את התערובת בצד התחתון של הקצה של המרית הכפופה ולאחר מכן לסובב את הצינור בעת הציור את המרית לאורך הקיר של הצינור. התערובת תתייבש במהירות כל כך חייב להיעשות צעד זה ביעילות.
- מורחים את התערובת על גבי הרשת מוכנה באמצעות מלקחיים כדי להחזיקו במקום. התערובת צריכה להיות גם שכבה ולמלא לתוך החורים של הרשת.
- לטבול את המרית הכפופה לHydron הצינור המכיל ולהשתמש בו מעיל משני צידי הרשת.
- הנח את הרשת המצופה נשענת על צד נגד קצה הצלחת ולאפשר ייבוש ב RT עבור 30-45 דקות.
- הנח את הרשת במקפיא -20 ° C או פנה מייד לשלב הבא. שמור רשת בתוך צלחת.
- מניחים את צלחת 35 מ"מ בתוך צלחת פטרי הגדולה יותר, המכסה. השתמש בזוג המלקחיים למשוך בזהירות את הסיבים של הרשת בנפרד על צלחת 35 מ"מ. ג כדורים תועיםייגבה מהצלחת הגדולה יותר בסוף.
- בדקו כדורים לאחידות בהיקף. תהליך התשואה של כ 250 כדורים ובכך המינון הסטנדרטי לגלולה לbFGF וVEGF הוא 80 ng ו200 ng, בהתאמה.
- כדורי חנות ב35 צלחת מ"מ במקפיא -20 ° C עד 3 חודשים.
.2 השתלה כירורגית של פלטות
- הגדר את אזור ניתוח תחת מיקרוסקופ.
- להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ"ג / קילוגרם, intraperitoneal) ומקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ כך עין גלויה. בצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח רמה מספקת של הרדמה.
- להרדים את העין העכבר על ידי הצבת 1 טיפה של פתרון proparacaine על גבי גלגל העין. חכה 20-30 שניות ולהספיג עם תחבושת.
- Proptose עין העכבר עם # הקהה להיות בטוח לעזוב את העור בין מלקחיים ועין 1 מלקחיים תכשיטנים. חשוב לשפוט את הלחץ המופעל בצורה נכונה.60; מחזיק את העין בחוזקה מדי יגרום לו להיות אדום ומגורה, ואילו מדי לאבד את האחיזה תאפשר עין לנוע במהלך ניתוח.
- השתמש בmicroknife 30 ° לעשות חתך לתוך הקרנית כ 1 מ"מ מימבוס. החתך צריך להיות 1-2 מ"מ אורך. חתך צריך להיות עמוק מספיק כדי לחדור מעבר לשכבת האפיתל לmidstroma אבל לא כל כך עמוק כדי לקרוע את העין.
- השתמש בסכין פון GRAEF לעשות כיס בניצב לחתך.
- חלק את הסכין מתחת לשכבה הקרנית באתר החתך ובעדינות לעבוד סכין ובהעבר אותו לאורך החתך להגדלת החלל, ובכך ליצור הכיס. זה עוזר להזיז את העכבר, כמו גם להיות מסוגל לעבוד עם העקמומיות של העין. היזהר שלא לדחוף כלפי מטה עם הקצה כדי למנוע פקיעת עין.
- להרטיב המלקחיים של צורף # 5 עם proparacaine לקחת גלולה עד מתוך צלחת. מניחים גלולה על העין. להרטיב את סכין פון GRAEF עם proparacaine ולהעביר חלק מנוזל על גלולה כדי להפוך אותו גומי וגמיש. להסיר לחות עודפת עם תחבושת או מטלית כותנה.
- הכנס את הכדור לתוך הכיס באמצעות סכין פון GRAEF לדחוף אותו פנימה מתחת לשכבת הקרנית. ברגע שכל גלולה היא בפנים, להפעיל את הצד השטוח של סכין פון GRAEF על אתר כדי לבדוק שהגלולה היא מאובטחת.
- מעיל עין עם משחה אנטיביוטית משולשת.
- הפכתי את העכבר ולחזור על ניתוח בעין השנייה.
.3 כימות של הקרנית neovascularization.
השאר בעלי חיים כדי לפתח כלי מעל פרק זמן מוגדר. היום לדירוג כלי תלוי בגורם גדילה בשימוש. הכיתה bFGF ביום 5 וVEGF חלש יותר ביום .6 יום ההשתלה הוא יום 0.
- להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ"ג / קילוגרם, intraperitoneal).
- השתמש במיקרוסקופ מנורת הסדק להגר"אדינג. יש עינית אחת reticule, קווים בתוך העינית משמשת ככולים עזר למדידה לכמת אונייה שאורכה ומרחק סביב ההיקף של העין שהכולים צצו.
- החזק את העכבר מול היקף, מיקום עכבר ולכן העין נראית בעיניים עם גלולה ישירות קדימה. לייצב את הראש בין האגודל לאצבע ולכן העור מתהדק על פנים והעין proptosed מעט.
- הנח את ציר y של reticule לאורך כלי limbal ישירות מתחת גלולה. מדוד את האורך של כלי הסתעפות כלפי מעלה לכיוון כדורים. להקליט מדידה זו בעשירית מילימטרים ולייעד אונייה שאורכה (VL) (איור 1 א).
- הפעל או העכבר או ארנק, כך שהמרחק סביב העין שהכלים האלה צצו מתבהר. זה הכי קל לחשוב על עין כפני שעון במרווחים של 1 עד 12. מיועד שעת שעון מספר זה (CH) (איור 1B). זה יכול להיות מספר או שברים של 0.25 (למשל, 2, 2.25, 2.5 או 2.75) שלמים. הערה: CH הוא סובייקטיבי. לדוגמא, חלקם עשוי למדוד את המרחק סביב העין שיכלול את כל נבטו מימבוס ואילו אחרים עשויים להפסיק מדידה בנקודה שבי האונייה שאורכה הוא מחצית מקסימלי כלי. הגורם החשוב הוא להיות עקבי עם איך אחד בוחר לכיתה.
איור 1 כימות neovascularization קרנית. () 80 ng bFGF גלולה הושתלה בעכבר / 6J C57BL מראה מנורת סדק reticule אוריינטציה למדוד אונייה שאורכה. VL = 0.9 מ"מ. (ב) reticule מנורת הסדק מראה עין אותו מסובב למדוד שעת שעון. CH = 3.25. אזור ספינה מחושב = 1.84 מ"מ 2. תמונות אלה שופרו באופן דיגיטלי על מנת לאפשר לתוספת של סכמטי reticule. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
- לחשב את שטח הכלי (VA) תוך שימוש בנוסחה הבאה, המבוסס על השטח של סגלגל (הערה, זה עוזר לשמור את זה בחשבון בעת דירוג.) אקספרס VA במילימטרים בריבוע. הנוסחה היא כדלקמן:
שעת x 0.2 π = אזור כלי שעון Vessel אורך X
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות אופייניות לכדורי bFGF וVEGF בC57BL / 6J angiogenic הנמוך הנורמלי מוצגות באיור 2 א 'וב', בהתאמה. 2E איור מציג את ההתפלגות הנורמלית של אזור הספינה (VA) בC57BL / מתח 6J עם מינונים שונים של הצמיחה הבאות גורמים. 80 כדורי bFGF ng בדרך כלל לגרום לVA של כ 2.0 2 מ"מ, אם כי ערכים בטווח של 1.8-2.4 2 מ"מ מקובלים. 200 כדורי VEGF ng בדרך כלל לגרום לתגובה של כ 0.7 2 מ"מ, עם מגוון רחב של ערכים המקובלים של 0.6-0.9 מ"מ 2. בניסויים שבו השפעה אנטי אנגיוגנזה חשודה, אזורי כלי גדולים יותר הם רצוי להיות מסוגל לדמיין ירידה. איור 3 מציג את ההשפעה של תלידומיד התרופה אנטי אנגיוגנזה על neovascularization מונע bFGF. הטיפול הביא לעיכוב 38% מצמיחת כלי. בניסויים שבם גידול רשאיניתן היה לצפות שהוא הטוב ביותר לשימוש במינונים נמוכים יותר כגלולה סטנדרטית גורמת לתגובה המרבית ליד. פלטות בהיקף של 10-40 bFGF ng יהיו מתאים יותר (איור 2 ג).
זנים שידועים שיש תגובה גבוהה angiogenic לגורם גדילה מסוים יכולים להיות VA יותר מכפול מזה של מתח נמוך angiogenic טיפוסי. איור 2 ד מציג את התגובה של עכבר 129S1 / SvImJ לגלולת FGF 20 ng. לשם השוואה, באותה גלולה המינון מוצגת בC57BL / 6J באיור 2 ג. שולחן נרחב המפרט את פוטנציאל angiogenic של זנים שונים לשני bFGF- וneovascularization מושרה VEGF כבר פורסם בעבר על ידי המעבדה שלנו 13.
זנים או pigmentations מסוימים עשויים להפגין צמיחה או דליפה של כלי הקשתית בתגובה לגלולה. זה יכול להתרחש באחת או בשני העיניים של עכבר בודד ויכול או לא יכול להיות עקבי לאורך entקבוצת חמה שבו assay מבוצע. תופעה זו עלולה לגרום לקרע של כלי הקשתית גורמים דם כדי למלא את הלשכה הקדמית (hyphema). Hyphemas יכול לעשות לדירוג neovascularization הקרנית קשה או בלתי אפשרי. איור 4 ממחיש קל (4A) וצורה חמורה (4B) להתרחשות זו.
איור 2 דוגמאות לneovascularization קרנית הנגרם על ידי גורם הגדילה. () 80 ng bFGF גלולה מושתל לתוך עכבר C57BL / 6J angiogenic נמוך, וכתוצאה מכך שטח כלי שווה ל2.0 מ"מ 2. זה נפוץ מאוד למינון זה כדי לגרום לכולים להגיע גלולה ולגדול לתוכו. 20 גלולה bFGF ng מושתלת לתוך (ב)C57BL / 6J עכבר, וכתוצאה מכך שטח כלי שווה ל1.04 מ"מ 2. (C) 200 גלולה VEGF ng מושתלת לתוך עכבר / 6J C57BL, וכתוצאה מכך שטח כלי שווה ל0.71 מ"מ 2. (ד) 20 ng bFGF גלולה במתח 129S1 / SvImJ הגבוה אנגיוגנזה. בהשוואה ל( C), גם גלולה FGF 20 ng, זן זה יש angiogenic מאשר פוטנציאל גדול פי שניים מזה של C57BL / 6J. (E) אזור neovascular קרנית (ממוצע ± SD, n = 10) בC57BL / 6J נגרם על ידי הגדלת מינון של או VEGF או bFGF. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
עיכוב איור 3 של Vess המושרה bFGFאל צמיחה על ידי סוכן אנטי אנגיוגנזה. עכבר / 6J רכב () בקרה שטופל C57BL. השרשה של 80 גלולה ng bFGF וכתוצאה מכך באזור ספינת קבוצה שווה ל2.0 מ"מ 2. (ב) תלידומיד טופל עכבר (200 מ"ג / קילוגרם, אוראלי למשך 5 ימים). אזור ספינת קבוצה שווה 1.25 2 מ"מ ומשקף ירידה של 38% בצמיחת כלי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור הצמיחה .4 hyphemas מושרה גורם בקשתית העכברית. () Hyphema מתון בC57BL / 6J-TyrC-י 2 / J. זן זה מציג את אותן neovascularization הקרנית כמו עמיתי פיגמנט שלהם, אבל הוא פרו יותרne לאיריס דימום. hyphema (ב ') בקנה מידה גדול בעכבר 129P3 / J. יש כל עין גוון אדמדם, כמו גם בריכות בולטות יותר של דם קרוב יותר לחלק תחתון של קשתית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים בביצוע assay קרנית מוצלח. הוא עושה הראשון כדורים אחידים אפשר להשתיל ומגרים כלי. החלקים החשובים ביותר של הכנת גלולה הם 1) שימוש בגורם גדילה ללא ספק; 2) להבטיח תערובת טובה של גורם גדילה עם סוקרלפט וHydron ו3) נע התערובת הסופית במהירות אבל בזהירות מצינור Eppendorf לרשת שבו כדורים נוצקו. מומלץ כי כדורים "דמה" נעשים ללא גורם גדילה לתרגל את הטכניקה. פלטות אמורות להופיע לבנה וגיר ולהיות בערך מרובע בצורה. כל כדורים שכוללים אזורים ברורים צריכים להיות שליליים כמו אזורים אלה צפויים לכלול Hydron בלבד. כמו כן יש לציין כי כדורים נוצרים עם אתנול וbFGF ושVEGF הם התייצבו על ידי ההכללה של סוקרלפט, אשר מחקה הפרין מחייבת. סוקרלפט משמש גם כדי לספק pl שחרור איטיatform לגורמי הגדילה. אם גירוי או מעכבים אחרים מתווספים לכדורים, יש לבדוק תחילה הבדלים אלה כדי לקבוע יציבות באתנול. מומלץ כי כדורים "דמה" נעשים ללא גורם גדילה בהתחלה לתרגל את הטכניקה. "סתם" או כדורים מזויפים מכילים רק סוקרלפט וHydron עם PBS להחליף את עוצמת הקול של גורם גדילה או תרכובת הנבדקת. כדורים אלה אינם להמריץ את צמיחת כלי שיט או דלקת limbal. כדורים שאם ישמשו כבקרה נאותה בניסויים שבם סוכן חשוד בהיותו פרו angiogenic ונבדק ללא התוספת של גורם גדילה לגלולה. ניתן לשלב מרכיבים וגורם גדילה בכדורים למקרים שבם אינטראקציה נחקרת, ובמקרה זה כדורים של גורם הגדילה לבד יהיו השליטה המתאימה.
השתלה כירורגית היא החלק המאתגר ביותר של assay.0; זה בהתחלה קשה מאוד לאמוד את העומק המתאים לחתך. מדי עמוק חתך גורם לכדור הארץ לקרע והעין הופכת לבלתי שמישה. זהו אפקט דרמטי, ולכן האדם לומד במהירות שלא "יקפוץ" לעין. זה לוקח הרבה יותר זמן לעשות חתך עמוק מספיק כדי לאפשר היווצרות כיס באופן עקבי. כאשר החתך הוא רדוד מדי, השכבה העליונה של הקרנית נפגעה בקלות או תלשה עם סכין פון GRAEF כפי שהוא הוכנס על מנת להפוך את הכיס. השלב האחרון של כימות צמיחת הכלי החדשה דורש עקביות באופן הדירוג. אורך כלי השיט הוא מדידה פשוטה ואילו ערך שעת השעון המתאר את הצמיחה סביב ההיקף של העין הוא סובייקטיבי יותר. השיטה צריכה להיות זהה מעכבר לעכבר ובין ניסויים.
עוד מרכיב קריטי של assay הוא הבחירה של הרדמה, אשר יכולה להיותהשפעה על הקלות וההצלחה של ההליך כירורגי. Avertin בזריקות הוא מסובך לפחות כפי שהוא מאפשר למניפולציה קלה של העכבר בניגוד להרדמה מתאדה תישלח באמצעות חרטומו. מומלץ להימנע משילוב של קטמין ו xylazine כמו גם בשל הקשר שלה עם נגעים בקרנית במכרסמים 16,17.
חשוב לציין כל שינוי במשקלם של עכברים במהלך ניסוי. ירידה במשקל יכולה להצביע על תנאי דיור ירודים או מחלה ואלה עלולים להשפיע לרעה על יכולתו של עכבר כדי לגדול כלי בעיניים. משקולות יש לנקוט בימים של השתלת גלולה ודירוג כלי כדי לקבוע את אחוז משקל של איבד, אם בכלל. אובדן של 5% או פחות מקובל ויכול לנבוע מהלחץ של טיפול בעכברים, במיוחד בניסויי טיפול במינון תכוף. יותר מ -5% ירידה במשקל היא בעניין וnonspecifically תהיהלדכא צמיחת כלי. כך תוצאות מניסויים כאלה צריכים להיחשב לא חוקיות.
מנת להתייחס להבדלים ניסיוניים טבועים מטכניקת הליך ואת היעילות של משתנים למדה, יש להשתמש במספר מינימאלי של עכברים על מנת להשיג תוצאות תקפות. מניסיוננו אנו ממליצים לא פחות מ 5 עכברים בכל קבוצת מניב n של 10 עיניים.
למרות יתרונות הרבים של assay micropocket הקרנית, יש גם כמה מגבלות. החסרון העיקרי הוא הצורך בתקופת הכשרה ארוכה יחסית כדי לשלוט בטכניקה. פרט ללא ניסיון טכני קודם עובד בעיני העכבר ידרוש כארבעה חודשים של אימון לפני ניסויים של 20-25 עכברים יכולים להיחשב אמין. יתר על כן, יש כמה הבדלים בין אנשים שונים שיבצעו את assay, ובכך להגביל את האפשרות של השוואה בין ניסויים המבוצעותבזמנים שונים על ידי אנשים שונים. מגבלה נוספת של מודל זה היא שהניסויים הם קצרים יחסית (5-6 ימים), והן מוגבלים על ידי שחרורו של bFGF או VEGF מהגלול. לכן, assay זה הוא מתאים ביותר לטיפולים שיש להם תגובה מהירה in vivo, אם כי זה יכול להיות מתוגמל באופן חלקי על ידי מראש בטיפול העכברים לאורך רצוי של זמן לפני ההליך. מבחני בדיקות סמים רגילים בדרך כלל מתחילים ממשל ביום ההשתלה גלולה (יום 0) ממשיכים עד יום לדירוג (יום 5 או 6).
המשמעות של שיטה זו היא שזה אחד ממבחני אנגיוגנזה כמותי אמינות ביותר. חלופה בעכברים היא assay תקע matrigel, לעומת זאת assay זה הוא איכותי יותר ופחות ספציפי לגורם גדילה מסוים בשל חדירת תא נרחבת המתרחשת לתקע. הגמישות של assay הקרנית מאפשרת להתאים את הכמותשל אנגיוגנזה שנוצר ולבחור ממריץ ספציפי. אפשר להחליף את גורמי גדילה סטנדרטיים עם גורמי angiogenic ידועים או חשודים אחרים. בנוסף, ניתן לשלב את גורמי גדילה סטנדרטיים ומעכבים אפשריים בתוך אותה גלולה להערכת פעילות אנטי אנגיוגנזה ללא משלוח מערכתי. לבסוף, assay זה מאפשר לאדם לעורר אנגיוגנזה על רקע גנטי שונה, שיכול להיות שימושי במיפוי השפעות גנטיות ולבסס את השפעתו של גן מסוים באנגיוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לקריסטין ג'ונסון לעבודה הגרפית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
