Summary
Protokollet beskriver hornhinnans micropocket analys såsom utvecklats i möss.
Abstract
Musen hornhinnan micropocket analysen är en robust och kvantitativ analys in vivo för utvärdering angiogenes. Genom att använda standardiserade långsam frisättning pellets innehållande specifika tillväxtfaktorer som utlöser blodkärlstillväxt i hela naturligt avaskulära hornhinnan, kan angiogenes mätas och kvantifieras. I denna analys det angiogena svaret alstras under loppet av flera dagar, beroende på typen och dosen av tillväxtfaktorn användas. Induktionen av neovaskularisation utlöses vanligtvis genom antingen basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) eller vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Genom att kombinera dessa tillväxtfaktorer med sukralfat och hydron (poly-HEMA (poly (2-hydroxietylmetakrylat))) och gjutning av blandningen till pellets kan de inopererade i musen ögat. Dessa enhetliga pellets långsamt frigöra tillväxtfaktorer under fem eller sex dagar (bFGF eller VEGF respektive) som möjliggör tillräcklig angiogen respons som krävs för fartygets område quantification användning av en spaltlampa. Denna analys kan användas för olika tillämpningar, inklusive en utvärdering av angiogena modulator läkemedel eller behandlingar samt jämförelse mellan olika genetisk bakgrund påverkar angiogenes. En skicklig utredare efter praktisera denna analys kan implantera en pellet på mindre än 5 minuter per öga.
Introduction
Processen för angiogenes, nybildning av blodkärl bildas redan existerande sådana, är mycket komplex och regleras av flera endogena faktorer som styr olika stegen i fartygets groning och morfogenes. Angiogenes utlöses på grund av en förskjutning i jämvikten mellan pro-och anti-angiogena faktorer, en balans som normalt bibehåller vaskulaturen i ett vilotillstånd. Angiogenes hos vuxna förekommer i vissa fysiologiska förhållanden såsom under den kvinnliga äggstock cykeln eller i reparationsprocesser såsom sårläkning och vävnadsregenerering. Men det är också ett kännetecken för flera sjukdomar, inklusive maligniteter, autoimmuna sjukdomar och inflammatoriska sjukdomar. Medverkan av angiogenes i dessa fysiologiska och patologiska tillstånd är det ett viktigt ämne för forskning och ett attraktivt mål för behandling.
På grund av komplexiteten av angiogenes och medverkan av flera cells och faktorer i processen, bland annat endotelceller, pericyter, cirkulerande celler och stromaceller, in vitro-modellerna fortfarande är begränsade och inte kan rekapitulera den unika in vivo mikromiljö. Huvud in vitro-analyser av angiogenes är till stor del inriktad på att observera direkta effekter på endotelceller och mäta vissa steg i angiogen process under kontrollerade förhållanden. Dessa analyser innefattar kvantifiering av endotelcellproliferation 1, migration 2, nätverksbildning 3, rörbildning 4 och groning från sfäroider 5. Ex vivo-modeller, till skillnad från de som in vitro, är mer komplicerade och inkorporera multipla typer vävnad cell, varvid ett exempel är aortaringanalys 6. Icke desto mindre, i likhet med andra system, kan det inte fånga bidraget av cirkulerande celler och den naturliga stroma av endotelceller som existerar in vivo. Försökatt studera angiogenes i flödet för att efterlikna den miljö i vivo utförs med mikroflödessystem 7, men till och med dessa analyser, även om mycket förbättrats, fortfarande inte kan redogöra för alla fack befintliga in vivo.
På grund av begränsningar i in vitro och ex vivo angiogenesmodeller in vivo-modeller förblir de mer tillförlitliga val för angiogenesstudier. Exempel på dessa modeller inkluderar implantation av transparenta kammare, "fönster", som tillåter visualisering av växande blodkärl under mikroskop 8, injicerbara subkutana implantat såsom matrigel och kärlbildning i normala vävnader såsom mus öron och kyckling korioallantoinmembranet (CAM ). Men en av de mest acceptabla och kvantitativa in vivo angiogenes modellerna är hornhinnans micropocket kärlnybildning analys som beskrivs här, som utnyttjar naturligt avaskulärahornhinnan som en "skärm" för att visualisera och utvärdera nya angiogenes tillväxt 9.
Här beskriver vi hornhinnans micropocket analys såsom utvecklats i möss. Initialt modellen användes för att mäta ospecifika angiogena stimuli i kaninhornhinnor. Detta gjordes genom att tumör bitar i kammarvattnet i främre kammaren i kaninögon och uppmätt tumörinducerad kärlnybildning 11.
Dock analysen senare utvecklats för att studera effekter av specifika tillväxtfaktorer 10 att bättre specificera och standardisera den angiogena effekten. För att frigöra den tillväxtfaktor i ögat, har långsam frisättning pellets innehållande kända kvantiteter av angiogena tillväxtfaktorer användes istället för vävnader. Tillgången på renade rekombinanta angiogena proteiner såsom bFGF eller VEGF aktiverat deras användning som specifika mål för angiogenes modulaters 12. Initialt var analysentill stor del används i kaniner, som är lättare att arbeta med på grund av sin storlek men senare modellen översattes till möss; en mindre och billigare djurmodell. Övergången från kanin till möss gav en viktig fördel av att kunna använda genmanipulerade djur och därigenom skapa ett nytt område för forskning om genetiska komponenter som påverkar angiogenes 13. Förutom den mer acceptabel användning av kornea-analysen i att studera angiogenes, kan andra biologiska processer, undersöks också med användning av modifierade analyser. Till exempel har studier av lymfangiogenes möjliggjorts genom implantation av låg dos bFGF pellets som gjorde visualiseringen av lymfkärlen genom specifika molekylära markörer 14. Dessutom har denna analys tillhandahålls ett medel för att utvärdera effekterna av strålning på angiogenes 15.
I summering, är hornhinnans micropocket angiogenes analysen en kvantitativ, reproducible, flexibel bedömning av angiogenes in vivo. En stor fördel med denna analys är att mätningen av bakgrundsfartyg är onödigt eftersom fartygen växer på ett naturligt avaskulär vävnad. Vi beskriver här protokollet för denna analys i detalj och diskutera olika scenarier som kan uppstå. Analysen består av tre diskreta segment. Här kommer vi att beskriva framställningen av tillväxtfaktorfattande pellets, den efterföljande kirurgisk implantation och slutligen den metod som används för att kvantifiera den resulte neovaskulär tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som handlar om djuren anmäls till och godkänns av Institutional Animal Care och användning kommittén vid barnsjukhuset Boston och bedrivs i enlighet med rekommendationerna från Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC). Se till att använda sterilt instrument och aseptisk techniqure, under hela proceduren.
1 Beredning av pellets
- Väg upp 10 mg sukralfat och 60 mg hydron med sterila unbent spatel. Placera i separata mikrocentrifugrör.
- Placera en 1 cm fyrkantig bit mesh i en steril 10 cm skål. Invertera så mesh vilar på grunt lock. Ställ åt sidan.
- Tillsätt 500 l etanol till hydron och skaka i minst 10 min.
- Tillsätt en lämplig mängd tillväxtfaktor (standard: 20 mikrogram för bFGF, 50 mikrogram för VEGF) till sukralfat och skaka snabbt. Butiks tillväxtfaktor i en-80 ° C frys i en koncentration av 1 mg / ml. Flytande volymerna bör vara minst 20 l för att säkerställa att sukralfat är helt fuktad men bör inte överstiga 50 l. Större volym gör avdunstningen av vätskan i nästa steg svårt.
- Placera sukralfat blandningen i centrifugalindunstare inställd på låg tills blandningen är helt torr, normalt 30-50 min beroende på volymen av vätska som används.
- Kontrollera blandningen för kvarvarande fukt med den avsmalnande änden av en steril spatel. Blandningen ska kännas "krispigt".
- Använd den avsmalnande änden av en spatel för att bryta upp sukralfat blandningen i röret.
- Lägg 10 ìl av hydron till sukralfat.
- På grund av den viskösa natur hydron, skära av änden från en 200 l pipett och sedan dra och släpp de 10 ul innan pipettering upp igen och lägga till sukralfat.
- Snabbt använda böjda musselyngelula att blanda hydron och sukralfat och ta bort från röret.
- Samla blandningen längs den nedre sidan av spetsen av den böjda spatel och rotera sedan röret samtidigt dra spateln ut längs väggen av röret. Blandningen torkar snabbt så detta steg måste göras effektivt.
- Bred ut blandningen på den förberedda mesh med pincett för att hålla den på plats. Blandningen bör vara ett jämnt skikt och fylla i hålen av maskan.
- Doppa den böjda spatel i röret innehållande Hydron och använda den belägga båda sidor av maskan.
- Placera den belagda mesh lutar sig på sidan mot kanten av skålen och låt torka vid rumstemperatur under 30-45 min.
- Placera mask i -20 ° C frys eller gå vidare direkt till nästa steg. Håll mesh inuti skålen.
- Placera 35 mm skålen inne i större petriskål, lock av. Använd pincett för att försiktigt dra fibrerna i nät från varandra över 35 mm skålen. Utspridda pellets cen samlas in från den större skålen i slutet.
- Kolla pellets för enhetlighet i omfattning. Processen ger ca 250 pellets alltså standarddosen per pellet för bFGF och VEGF är 80 ng och 200 ng, respektive.
- Förvara pellets i 35 mm skålen i -20 ° C frys i upp till 3 månader.
2 Kirurgisk implantation av pellets
- Inrätta en kirurgisk området under operationsmikroskop.
- Bedöva musen med avertin (400-500 mg / kg, intraperitonealt) och placera musen under mikroskop så ögonen syns. Utför tå nypa för att säkerställa tillräcklig nivå av anestesi.
- Bedöva musen ögat genom att placera en droppe proparakain lösning ovanpå ögongloben. Vänta 20-30 sekunder och badda med en kompress.
- Proptose musen ögat med den avtrubbade # 1 juvelerare pincett vara säker på att lämna huden mellan pincett och ögon. Det är viktigt att bedöma det tryck som appliceras på rätt sätt.60; Avloppsvatten ögat för hårt kommer att orsaka att den blir röd och irriterad, medan för lös tag kommer att tillåta ögat att röra sig under kirurgi.
- Använd 30 ° microknife att göra ett snitt i hornhinnan ungefär 1 mm från limbus. Snittet bör vara 1-2 mm i längd. Incision bör vara tillräckligt djup för att penetrera bortom epitelskiktet in midstroma men inte så djupt att brista ögat.
- Använd von Graef kniv för att göra en ficka i rät vinkel mot snittet.
- Skjut kniven under hornhinnan lagret vid snittet platsen och försiktigt arbeta kniv i och flytta den utmed snittet för större utrymme, och utgör därmed fickan. Det hjälper till att flytta musen samt att kunna arbeta med krökningen av ögat. Var noga med att inte trycka nedåt med spetsen för att undvika bristning ögat.
- Blöt # 5 juvelerare pincett med proparakain och plocka en pellet upp ur skålen. Placera en pellet på ögat. Fukta von Graef kniv med proparakain och överföra en del av vätska på pellets för att göra den seg och smidig. Ta bort överflödig fukt med kompress eller bomullstuss.
- Sätt pelleten i fickan med hjälp av von Graef kniven för att driva det inne under hornhinnan lagret. När hela pellets är inne, kör den platta sidan av von Graef kniv över platsen för att kontrollera att pellets är säker.
- Coat ögat med trippel antibiotisk salva.
- Vänd på musen och upprepa operation i motsatt ögat.
3 Kvantifiering av hornhinneneovaskularisering.
Låt djuren att utveckla fartyg under en viss tidsperiod. Dagen Fartygets gradering beroende tillväxtfaktor som används. Grade bFGF på dag 5 och den svagare VEGF på dag 6 Dagen för implantation är dag 0.
- Bedöva musen med Avertin (400-500 mg / kg, intraperitonealt).
- Använd spaltlampa mikroskop för grading. En okulär har en retikulära, linjer inom okularet används som stödmätnings att kvantifiera fartygslängd och avstånd runt ögat omkrets att fartygen har grott.
- Håll musen framför räckvidd, placera musen så ögat ses i okulär med pellets direkt framåt. Stabilisera huvudet mellan tummen och pekfingret så huden dras åt på ansikte och ögon är något proptosed.
- Placera y-axeln i retikulära längs limbus fartyget direkt under pellet. Mät längden på fartyg förgrenade uppåt mot pellets. Spela denna mätning i tiondels millimeter och utse fartygets längd (VL) (Figur 1A).
- Vrid på musen eller hårkors så att avståndet runt ögat att dessa fartyg har grott blir klart. Det är lättast att tänka på ögat som en urtavla med intervaller på 1 till 12 Utse detta antal klocktimme (CH) (Figur 1B). Det kan vara ett heltal eller fraktioner av 0,25 (t.ex., 2, 2,25, 2,5 eller 2,75). OBS: CH är subjektiv. Till exempel kan några mäta avståndet runt ögat för att inkludera alla fartyg grodda från limbus medan andra kan stoppa mätning vid den punkt där fartygslängd är halv maximal. Den viktigaste faktorn är att vara konsekvent med hur man väljer att klass.
Figur 1 Kvantifiering av hornhinneneovaskularisering. (A) 80 ng bFGF pelleten implanteras i C57BL / 6J mus visar spaltlampa retikulära orienterad för att mäta fartygets längd. VL = 0,9 mm. (B) Samma ögon visar spaltlampa retikulära roteras för att mäta klocktimme. CH = 3,25. Beräknat kärl area = 1,84 mm 2. Dessa bilder digitalt ha förhöjts för att möjliggöra tillägg av retikulära schema. Klicka här för att se en större bild.
- Beräkna fartygets området (VA) enligt formeln nedan, som bygger på området för en oval (Obs, är det bra att ha detta i åtanke vid klassning.) Express VA i millimeter i kvadrat. Formeln är som följer:
Vessel längd x Klocka timme x 0,2 π = Vessel område
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska resultat för bFGF och VEGF pellets i de normala låga angiogena C57BL / 6J möss visas i Figur 2A och B, respektive. Figur 2E visar normalfördelningen fartygsområde (VA) i C57BL / 6J stam med varierande doser av dessa tillväxt faktorer. 80 ng bFGF pellets normalt resultera i en VA på ca 2,0 mm 2, även om värden i ett intervall av 1,8-2,4 mm 2 är acceptabla. 200 ng VEGF pellets orsakar oftast ett svar på ca 0,7 mm 2, med ett utbud av godtagbara värden på 0,6-0,9 mm 2. För experiment där man misstänker en anti-angiogen effekt, större fartygs områden är önskvärda för att kunna visualisera en minskning. Figur 3 visar effekten av den anti-angiogena läkemedel talidomid på bFGF driven neovaskularisation. Behandlingen resulterade i 38% hämning av kärltillväxt. I experiment där en ökning kanförväntas är det bäst att använda lägre doser som standard pellets orsakar en nära maximal respons. Pellets består av 10-40 ng bFGF skulle vara lämpligare (figur 2C).
Stammar kända för att ha en hög-angiogen svar på en särskild tillväxtfaktor kan ha en VA mer än dubbelt så stor som en typisk låg-angiogen stammen. Figur 2D visar svaret på en 129S1 / SvImJ mus till en 20 ng FGF pellet. För jämförelse är samma dosering pelleten visas i en C57BL / 6J i figur 2C. En omfattande tabell över den angiogena potential olika stammar till både bFGF- och VEGF-inducerad kärlnybildning har tidigare publicerats av vårt laboratorium 13.
Vissa stammar eller pigmenteringar kan uppvisa tillväxt eller läckage av iris fartyg som svar på en pellet. Detta kan ske i en eller båda ögonen för en enskild mus och kan eller inte kan vara förenligt över entire grupp, i vilken analysen utförs. Detta fenomen kan leda till bristningar i iris fartyg orsakar blod för att fylla den främre kammaren (hyphema). Hyphemas kan göra gradera hornhinneneovaskularisation svår eller omöjlig. Figur 4 illustrerar en mild (4A) och allvarlig (4B) formen av denna förekomst.
Figur 2. Exempel på tillväxtfaktor-inducerad korneal neovaskularisering. (A) 80 ng bFGF pelleten implanteras i en låg angiogen C57BL / 6J mus, vilket resulterar i ett kärl område lika med 2,0 mm 2. Det är mycket vanligt att denna dos för att orsaka fartygen att nå pelleten och växa in i den. (B) 20 ng bFGF pellet implanteras i enC57BL / 6J mus, vilket resulterar i ett kärl område lika med 1,04 mm 2. (C) 200 ng VEGF pellets implanteras i en C57BL / 6J mus, vilket resulterar i ett kärl ryta 0,71 mm 2. (D) 20 ng bFGF pelleten i det höga angiogena 129S1 / SvImJ stammen. Jämfört med (C), också en 20 ng FGF pellets, har denna stam en angiogen potential större än dubbelt så stor som C57BL / 6J möss. (E) Hornhinnan neovaskulär område (medelvärde ± SD, n = 10) i C57BL / 6J möss inducerade av ökande doser av antingen VEGF eller bFGF. Klicka här för att se en större bild.
Figur 3 Hämning av bFGF-inducerad vessel tillväxt genom antiangiogena medel. (A) Styr vehikelbehandlad C57BL / 6J mus. Implantation av 80 ng bFGF pellet som resulterar i en gruppkärl område lika med 2,0 mm 2. (B) Talidomid behandlad mus (200 mg / kg, oralt i 5 dagar). Grupp kärl området lika 1,25 mm 2 och reflekterar 38% minskning av kärltillväxt. Klicka här för att se en större bild.
Figur 4 tillväxtfaktor inducerade hyphemas i murina iris. (A) Mild hyphema i en C57BL / 6J-TyrC-2J / J. Denna stam uppvisar samma hornhinneneovaskularisation som sina pigmente motsvarigheter men är mer prone Iris blödning. (B) Storskalig hyphema i en 129P3 / J mus. Hela ögat har en rödaktig nyans och mer uttalade pölar av blod närmare botten av iris. Klicka här för att se en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga steg i att utföra en framgångsrik hornhinnan analys. Det första är att göra enhetliga pellets kan vara implantat och stimulerande fartyg. De viktigaste delarna av pellets förbehandlingen 1) med hjälp av bärare fritt tillväxtfaktor; 2) säkerställa en god blandning av tillväxtfaktor med sukralfat och hydron och 3) att flytta den slutliga blandningen snabbt men försiktigt från Eppendorf-rör till det nät där pelletsen gjuts. Det rekommenderas att "dummy" pelletar göras utan tillväxtfaktor att öva tekniken. Pellets ska visas vitt och kalkhaltig och vara ungefär kvadratisk till formen. Eventuella pellets som innehåller tydliga områden bör uteslutas eftersom dessa områden innehåller sannolikt bara hydron. Det bör också noteras att pelletsen är bildade med etanol och att bFGF och VEGF stabiliseras genom införlivandet av sukralfat, som härmar heparinbindning. Sukralfat tjänar också till att ge en långsam frisättning platform för tillväxtfaktorer. Om andra stimulatorer eller inhibitorer läggs till pellets, bör dessa faktorer testas först för att bestämma stabilitet i etanol. Det rekommenderas att "dummy" pelletar göras utan tillväxtfaktor att initialt öva tekniken. "Dummy" eller sken pellets innehåller endast sukralfat och hydron med PBS ersätta volymen av tillväxtfaktor eller förening som testas. Dessa pellets inte stimulerar kärltillväxt eller limbus inflammation. Sham pellets tjäna som en lämplig kontroll i experiment där en agent misstänks vara pro-angiogena och testas utan tillsats av tillväxtfaktorn till pelleten. Föreningar och tillväxtfaktor kan kombineras i pellets för fall där en interaktion undersöks, i vilket fall pellets av tillväxtfaktorn enbart skulle vara en lämplig kontroll.
Kirurgisk implantation är den mest utmanande delen av analysen.0; Det är till en början väldigt svårt att bedöma lämpligt djup för snittet. För djupt ett snitt orsakar jordklotet att brista och ögat blir obrukbar. Detta är en dramatisk effekt och därmed en snabbt lär sig att inte "pop" i ögat. Det tar betydligt längre tid att konsekvent göra ett snitt tillräckligt djup för att tillåta fickbildning. När snittet är för grunt, är det översta skiktet av hornhinnan skadas lätt eller rippat med von Graef kniv som den sätts in för att göra fickan. Det sista steget för att kvantifiera det nya fartyget tillväxt kräver konsekvent på samma sätt som betygssättning. Fartygslängd är en enkel mätning medan klocktimme värdet visar tillväxt runt omkretsen av ögat är mer subjektiv. Den metod som används bör vara samma från mus till mus och mellan experiment.
En annan kritisk komponent i analysen är valet av anestesi, vilket kan haen inverkan på den lätthet och framgång för det kirurgiska förfarandet. Injicerbart avertin är den minst komplicerade eftersom det möjliggör enkel hantering av musen till skillnad från förångad anestesi levereras via noskon. Det är tillrådligt att undvika kombinationen av ketamin och xylazin samt på grund av sin koppling till hornhinnan lesioner i gnagare 16,17.
Det är viktigt att notera någon förändring av vikten på möss under experimentet. Viktminskning kan vara ett tecken på dåliga boendeförhållanden eller sjukdom och dessa kan negativt påverka en mus förmåga att växa fartyg i ögat. Vikter bör tas på dagar av pellets implantation och kärl gradering för att bestämma den procentuella vikt förlorade, om något. Förlust av 5% eller mindre är acceptabelt och kan bero på stress att hantera mössen, speciellt under behandlingsförsök med frekvent dosering. Mer än 5% viktminskning är oroande och kommer ospecifikttrycka kärltillväxt. Således resultat från sådana försök bör betraktas som ogiltigt.
För att ta hänsyn till inneboende experimentella avvikelser från förfarande Teknik och effekten av variabler studeras, bör ett minsta antal möss användas för att uppnå giltiga resultat. Enligt vår erfarenhet rekommenderar vi inte mindre än 5 möss per grupp som ger ett n på 10 ögon.
Trots de många fördelarna med hornhinnans micropocket analysen, det finns också några begränsningar. Den huvudsakliga nackdelen är behovet av en relativt lång träningsperiod för att behärska tekniken. En person utan tidigare teknisk erfarenhet av att arbeta i musen ögat skulle kräva ungefär fyra månaders praktik innan experiment 20-25 möss kunde betraktas som tillförlitliga. Dessutom finns det vissa variationer mellan olika personer som utför analysen, vilket begränsar möjligheten att jämföra mellan experiment som utförsi olika tider med olika människor. En annan begränsning hos denna modell är att experiment är relativt kort (5-6 dagar) och begränsas av frisättningen av bFGF eller VEGF från pelleten. Därför är mycket lämplig för behandlingar som har en snabb respons in vivo denna analys, även om detta kan delvis kompenseras genom förbehandling av möss för önskad tidslängd före förfarandet. Standarddrogtester analyser börjar vanligtvis administration på dagen för pellets implantation (dag 0) fortsätter fram till dagen för betygssättning (dag 5 eller 6).
Betydelsen av denna teknik är att det är en av de mest tillförlitliga kvantitativa angiogenesanalyser. Ett alternativ i möss är matrigel plug-analysen, men denna analys är mer kvalitativ och är mindre specifika för en viss tillväxtfaktor på grund av en omfattande cellinfiltration som uppstår i kontakten. Flexibiliteten hos hornhinnans analysen möjliggör en att skräddarsy mängdenav angiogenes genereras och för att välja en specifik stimulator. Det är möjligt att ersätta de vanliga tillväxtfaktorer med andra kända eller misstänkta angiogena faktorer. Dessutom är det möjligt att kombinera standard tillväxtfaktorer och möjliga hämmare inom samma pelleten för att utvärdera antiangiogen aktivitet utan systemisk leverans. Slutligen ger denna analys en att stimulera angiogenes på olika genetisk bakgrund, som kan vara användbara för att kartlägga genetiska effekter och om de resultat av en viss gen på angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Kristin Johnson för den grafiska arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
