Introduction
جدار الخلية النباتية يحمل مجموعة كبيرة من المعلومات ضمن مختلف مكوناته: اللجنين، السليلوز، hemicelluloses (الزيلان، glucuronoxylan، xyloglucan، arabinoxylan، الربط المختلطة جلوكان، أو glucomannan)، والبكتين. توفير التقنيات النسيجية الإشارات البصرية الهامة في دراسة الاختلافات داخل جدران الخلايا الثانوية في المستويات التنظيمية والخلوية. تم تطوير تقنيات النسيجية المختلفة ويمكن العثور عليها في الأدب، ولكن يمكن لهذه التقنيات أن يكون تحديا للمبتدئين وتستغرق وقتا طويلا لأن بروتوكولات مفصلة جدا مع تعليمات بسيطة ونادرا ما تكون مرئية إذا كان متوفرا من أي وقت مضى. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لتقنيات تلطيخ النسيجية للحصول على صور عالية الجودة.
باجتزاء الأنسجة الجذعية هي الخطوة الأولى في التصور من جدران الخلايا والأشكال الخلية. على الرغم من المقاطع ومن ناحية القص غير مكلفة وتستغرق وقتا أقل للتحضير، واستخدام vibratome يقدم الاتساق وتعطي صور عالية الجودة. باستخدام vibratome يسمح إنتاج أفضل نوعية البيانات عن طريق توليد أقسام حتى مع نفس السمك، مما يساعد على إنتاج صور حادة ويقلل بشكل ملحوظ من خطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن طريق إعداد عينة سيئة. يمكن باستخدام راتنجات لإصلاح العينات الطازجة يكون تحديا للمبتدئين ويمكن أن تكون لا تزال تستغرق وقتا طويلا حتى بالنسبة للخبراء عندما يحتاج تحليلا ينبغي القيام به بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، يصبح من المستحيل لقياس أي نشاط بيولوجي مع العينة عندما تم تضمين ذلك في الراتنج. أسلوب واحد بسيط هو أن توظف الاغاروز والعفن محلية الصنع هي مفيدة لتضمين الأنسجة الجذعية، ويمكن أيضا أن تستخدم في تطبيقات أخرى تتطلب تشريح الأنسجة الرخوة. بالمقارنة مع تضمين العينات في الراتنج، وهذا الأسلوب له ميزة الحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة والحد من التلاعب العينة. باجتزاء الأنسجة عن طريق vibratome هو دقيق للغاية ويولد homogenأقسام الأوس، والتي، اعتمادا على الهدف من الدراسة، ومن ثم يمكن استخدامها مع العديد من التقنيات تلطيخ مختلفة.
أبسط الطرق لتصور اللجنين والمواد العطرية الأخرى تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. الإثارة من الجزيئات العطرية مقرها من قبل ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي تقنية قديمة، ولكنها لا تزال واحدة من أسرع النهج لرؤية اللجنين. ومع ذلك، والتصور للأشعة فوق البنفسجية هو في الواقع ليست مثالية للكشف عن اللجنين لضوء الأشعة فوق البنفسجية سوف تثير العطرية الأخرى. يتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاث كتل بناء، وmonolignols (الكحول hydroxycinnamyl: الكحول coniferyl والكحول sinapyl، وف coumaryl الكحول) 1-3. يمكن فلوروغلوسين صمة عار توفر أدلة على مدى cinnamaldehydes الموجودة في الخشب والألياف والأنسجة القصبة الهوائية 4. فلوروغلوسين يعد مؤشرا جيدا من cinnamaldehydes العامة ويمكن التفريق بين cinnamaldehydes والعطرية الأخرى. ويمكن الكشف عن الكحول مونومرات sinapylومتمايزة عن طريق استخدام مولي وصمة عار. طولويدين يا الأزرق هو صبغة متعدد الألوان، ولديه القدرة وصمة عار عناصر مختلفة من جدار الخلية في ألوان مختلفة 5،6 بالتالي. الاستخدام الرئيسي للطولويدين يا الأزرق هو للكشف عن البكتين واللجنين 5،6. ميزة استخدام طولويدين يا الأزرق هو أن العديد من عناصر جدار الخلية يمكن تصور في خطوة واحدة. كلا calcofluor الأبيض والكونغو الحمراء هي سهلة للعمل مع، ويمكن استخدامها لتصور السليلوز. Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان غير استبداله أو استبداله ضعيفة 6-9، في حين الكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبشكل خاص لالسيليلوز 10،11. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لاستخدام التقنيات تلطيخ المذكورة أعلاه للحصول على صور عالية الجودة من A. ينبع thaliana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الجذعية تضمينها
- جعل الحل الاغاروز 7٪ في الماء (7 غرام من الاغاروز الكهربائي الصف في 100 مل من الماء المقطر). حل الاغاروز بواسطة التعقيم لمدة 20 دقيقة أو عن طريق الميكروويف لمدة 20 دقيقة في أقل كثافة (على سبيل المثال، 10٪ من كثافة الميكروويف 1،250 واط).
- إعداد قالب محلية الصنع لتضمين ينبع باستخدام قوارير البلاستيك.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع أسفل المخروطية من 2 مل المسمار غطاء أنبوب microcentrifuge (الجزء أ). مع إبرة حقنة، ثقب ثقبا في غطاء أنبوب أكبر قليلا من قطر الجذعية لتكون جزءا لا يتجزأ. المقبل، وقطع من 0.5 سم في الجزء السفلي من 0.6 مل أنبوب microcentrifuge (الجزء ب).
- إضافة قطع 0.5 سم جزء من أنبوب microcentrifuge 0.6 مل مل في أنبوب microcentrifuge قبل القطع 2. ختم شطري باستخدام Parafilm (الشكل 1). ملاحظة: يتم قطع الجزء السفلي من الأنبوب لتسهيل إزالة عينة جزءا لا يتجزأ بعد أن عززت agarose. Tكان ثقب في الغطاء سوف تساعد في عقد الجذعية ثابت عندما يتم تضمين الجذعية في الاغاروز. سوف تخدم العفن لعقد الاغاروز وعقد على التوالي الجذعية عندما التضمين. سوف Parafilm عقد شطري، ألف وباء، حتى يتم تعيين الاغاروز وجزءا لا يتجزأ من الجذع.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع جزء الجذعية من منطقة الفائدة، (على سبيل المثال منتصف الأولى السلاميات الجذعية). ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي خفض الجذعية قبل التضمين لتجنب الدمار بسبب الجفاف. بدلا من ذلك، الجذعية يمكن تخزينها مؤقتا في لوحة تحتوي على ورق الترشيح المبللة بالماء. يمكن وضع هذه اللوحة على الجليد حتى جاهزة للجزءا لا يتجزأ من النسيج لمنع الجفاف وتشوه. سوف تخزين الجذعية لفترات أطول من 30 دقيقة من دون رطوبة عالية تسبب الجذعية لتجف.
- إذابة الاغاروز في الميكروويف في كثافة منخفضة. تحذير: زجاجة تحتوي على الاغاروز قد تكون ساخنة. استخدام قفاز لالتقاط زجاجة. السماح ليالي الاغاروز ذابTAND في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية) حتى يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية.
- ماصة ببطء 5 مل من الاغاروز في قالب من البلاستيك ولم يضف لملء القارورة. ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في قوالب. سوف فقاعات الهواء يسبب فجوات في قالب الاغاروز ولن تغطي كامل العينة الجذعية، الأمر الذي سيؤدي في نهاية المطاف إلى قطع متفاوتة من المقاطع العينة.
- السماح للالاغاروز يبرد لمدة 30 إلى 60 ثانية لتصبح نصف صلبة. اختبار مع مسواك الصغيرة، والتأكد من أنها يمكن أن تخترق والوقوف، ولكن لا تطفو، في الاغاروز. ملاحظة: إذا تم وضع الجذعية عندما الاغاروز لا تزال ساخنة فإنه سوف يضر عينة من الذبول الجذعية، وتدمير مورفولوجيا الخلايا.
- وضع الجذعية في هذا مملوءة الاغاروز القارورة. تأكد من أن يبقى الجذعية على التوالي. وضع غطاء مثقب في مثل هذه الطريقة التي يقام غيض من الجذعية من الغطاء. لا تتحول الغطاء المسمار على. في وقت ما أكثر من واحد الجذعية (من نوع واحد) يمكن أن يكون EMBEdded في قنينة واحدة؛ ولكن في هذه الحالة بالذات، لا تستخدم الغطاء. ملاحظة: إذا تم تشغيل كاب المسمار، سوف تحصل على جذع الملتوية.
- ترك القارورة في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة، حتى يتصلب.
- إزالة العفن من الانزلاق برفق من الأنبوب. فتح Parafilm. دفع الجزء السفلي من الجزء باء من العفن بلطف مع الإبهام للافراج عن الاغاروز طدت من الجزء (أ) على شريحة المجهر والزجاج.
- قطع الجذعية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز الى ثلاث قطع متساوية تقريبا من 1.2 سم في الطول. قطع جزء من الجذع الذي لم يكن في الاغاروز وتخلص منه.
- تخزين هذه القطع من الاغاروز مع جزءا لا يتجزأ من ينبع في محكم 2 مل أنابيب microcentrifuge في مربع الظلام في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للمقطع. بدلا من ذلك، تخزين الأنابيب في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها أسبوع واحد. ملاحظة: التخزين هو ممكن، ولكن المجرب يحتاج إلى أن يكون على علم بأن جزءا لا يتجزأ من ينبع لا تزال على قيد الحياة، واعتمادا على التجربة، يحتمل أن يكون عرض الأعمال الفنية.
2. الجذعية باجتزاء
- تنبيه: قراءة دليل vibratome بعناية واتباع جميع تعليمات السلامة.
- تأكد من أن القرص العينة نظيفة وجافة تماما (خالية من أي مادة صلبة أو سائلة). تنظيف القرص عينة بشفرة حلاقة لإزالة أي الغراء المتبقي من التجارب السابقة ويغسل بالماء. ثم تجف مع منشفة ورقية. ملاحظة: هذا سوف يضمن أن يعمل بشكل جيد لاصقة ويربط العينة الاغاروز. إذا لم تتم هذه الخطوة بشكل صحيح، فمن الممكن أن العينة قد لا تلتزم القرص، وسوف يتسبب في وقت لاحق العينة أن تسقط القرص خلال باجتزاء.
- مناديل استخدام ورقة ناعمة لإزالة أي الرطوبة من كتلة agarose تحتوي على العينات.
- وضع قطرة صغيرة من الأنسجة لاصقة على القرص العينة. خط من لاصق لتغطية المنطقة في منتصف لوحة باستخدام غيض من زجاجة لاصقة. المكان بسرعةكتلة agarose بحيث العينات إما عمودية أو بالتوازي مع لوحة لمدة طولية أو مستعرضة المقاطع العرضية، على التوالي. السماح لاصقة لإصلاح العينة إلى القرص العينة في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة. ملاحظة: هذه خطوة حساسة للوقت.
- إصلاح القرص العينة في مكان على صينية عازلة أو الحوض الصغير. وينبغي أن تكون كتلة / ث من الاغاروز مع أقسام بالتوازي مع شفرة حلاقة. ملء علبة عازلة مع الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة حتى يتم المغمورة العينات تماما.
- قطع شفرة حلاقة في نصف ثم رتبت النهاية مع مقص قوي بحيث يبقى شفرة مسطحة تماما. نعلق نصف شفرة حلاقة قبل القطع على حامل السكين.
- تعيين زاوية على حامل السكين إلى 84 درجة، وسرعة إلى 0.90 ملم / ثانية (8 الموقف على vibratome) وتردد إلى 50 هرتز (5 موقف على vibratome). قطع أجزاء من سمك 100 ميكرون. استخدام الوضع المستمر. NOTE: تم اختيار هذا سمك لضمان أن الأنسجة يمكن أن تصمد أمام مختلف العلاجات حمض وقاعدة تستخدم في بعض البروتوكولات تلطيخ. تعيين نافذة لباجتزاء والسماح 15-20 دقيقة على الوضع المستمر لvibratome إلى القسم كتلة الاغاروز حوالي 1.2 سم.
- جمع الأقسام باستخدام ماصة البلاستيكية خلال باجتزاء في علبة عازلة. بدلا من ذلك، يمكن نقل أقسام من علبة عازلة في كوب زجاجي ثم إلى لوحة بيتري واضحة. نقل المقاطع القليلة لأنابيب microcentrifuge 2.0 مل. ملاحظة: يتم جمع عينات من لوحة بيتري لأنه من الأسهل لمشاهدة المقاطع على خلفية واضحة، ولأن علبة عازلة يمكن معبي للعينة القادمة.
- ويمكن تخزين المقاطع في أنبوب 50 مل أو جمعها وتخزينها في 1،5-2 مل أنابيب microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. ملاحظة: تخزين المقاطع لفترات أطول وسوف يؤدي ذلك إلى ضعف جودة الصورة.
3. مجهر الكاميرا وإعدادات التصوير
- ضبط الإضاءة كوهلر على المجهر. اختيار الهدف. التركيز على العينة الأولى. جلب شدة الضوء إلى نصف أو أقل. إغلاق الحجاب الحاجز الحقل (FD) والفتحة (ا ف ب) أو إحضاره إلى أدنى الإعداد ممكن على هذا الهدف بالذات.
- وارتفاع التكبير، أكبر عصابة سيكون. استخدام مكثف التركيز مقبض الباب للتركيز القزحية الملعب بشكل حاد ممكن.
- جلب ببطء صورة القزحية الميدانية (على شكل مسدس حلقة صغيرة) إلى المركز باستخدام المقابض المكثف-توسيط (مسامير على شكل دبوس المحيطة المكثف). زيادة ببطء الحجاب الحاجز (FD) بحيث القزحية الحقل يصل إلى الحافة. وقف زيادة FD بعد القزحية مجال اجتاز الحافة.
- زيادة ببطء الفتحة (AP) لضبط التباين. ضبط شدة الضوء كما هو مطلوب. ملاحظة: كوهلر الإضاءة يحتاج إلى تعديل لكل سbjective، كل يوم التجريبية. نلاحظ الأرقام التي تم الحصول عليها بعد التعديل لهذا اليوم. وسيعاد استخدام هذه الأرقام في كل مرة أن يتم تبديل أهداف ذهابا وإيابا لهذا اليوم بالذات.
- ضبط الفتحة، وكثافة، وقت التعرض، وزيادة، والمرشحات كما هو موضح في الجدول رقم 1. ينبغي أن تستخدم هذه المعلومات فقط كدليل.
- استخدام كاميرا رقمية عالية الدقة مع كبير تنسيق الناقلات CCD رقاقة مع عدم وجود مفتاح ميكانيكي لالتقاط الصور مضان؛ وعالية الدقة، وكاميرا عالية السرعة للصور مشرق الميدان.
- معالجة الشرائح باستخدام البرمجيات القياسية. تحميل البرنامج. انقر على "اكتساب" و "مجموعة الكاميرا / المجلس"، ثم حدد الكاميرا لاستخدامها. انقر على زر "موافق". انقر على "الحصول على" تليها "علامة التبويب اللون." تحت "علامة التبويب اللون،" اختيار "طريقة باير"، يليه "متوسط أربعة." إضافة المكسب اقترح (الأحمر والأخضر والأزرق) جيئة وذهابام الجدول 1. حدد "تعيين انقاذ" علامة التبويب وانقر على الدليل حيث الصور هي ليتم تخزينها. تعيين "زمن التعرض" من الاقتراحات في الجدول 1. تعيين "Binning" في "1" و "binning لايف" في "1". التركيز على المنطقة من اهتمام وثم انقر على "حفظ العيش".
- الصور الإخراج على برنامج الكاميرا هي في شكل "TIF". تحليل الصور لالكيمياء النسيجية من أنواع الخلايا. استخدام برامج الكمبيوتر القياسية للاستخدامات المصب من العرض والنشر.
4. الأشعة فوق البنفسجية ومشرق الميدان التصوير
- استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة الحافة بحيث أقسام يمكن pipetted بسهولة. أقسام بلطف ماصة في تلميح وعلى لشريحة المجهر. تغطية الأجزاء مع انزلاق الغطاء. مراقبة أقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو الإضاءة مشرق الميدان.
5. فلوروغلوسين-حمض الهيدروكلوريك (يزنر) يلطخ 12
- حل 0.3 غرام من فلوروغلوسين في 10 مل من الإيثانول المطلق لإعداد حل فلوروغلوسين 3٪. مزج حجم واحد من حمض الهيدروكلوريك المركز (37 N) لمجلدين من 3٪ فلوروغلوسين في الإيثانول؛ هذا الحل هو فلوروغلوسين، حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة) أو يزنر وصمة عار. ملاحظة: هذا الحل يجب أن يصدر الطازجة في اليوم من تلطيخ ولا يمكن تخزينها، لأن الحل سوف تتحلل بمرور الوقت وسوف تصبح غير فعالة تلطيخ. تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هي ضارة للغاية، لذلك توخي الحذر الشديد أثناء التعامل مع وصمة عار فتاه حمض الهيدروكلوريك.
- نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام والأنكى من ذلك على الفور لأن حمض الهيدروكلوريك في وصمة عار فتاه حمض الهيدروكلوريك هي ضارة للغاية. بلطف تحريك أنبوب للتأكد من أن جميع أقسام هي ملطخة. بديل لهذه الخطوة هو الحفاظ على غطاء أنبوب مفتوحة بحيث يمكن pipetted الحل فتاه حمض الهيدروكلوريك صعودا وهبوطا، ويفضل أن يكون من دون إزعاج ثانيةستعقد. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف تلك المقاطع.
- استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر. تغطية أقسام مع غطاء قابل للانزلاق. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان. ملاحظة: الحل فتاه حمض الهيدروكلوريك يجف في 5-10 دقيقة، مما تسبب في تدهور العينات. وبالتالي، فإن التصوير لديه أن تكتمل في غضون تلك الفترة من الزمن.
6. MAULE تلطيخ 13،14
- حل 0.2 غرام من برمنجنات البوتاسيوم في 40 مل من الماء المقطر لإعداد 0.5٪ محلول برمنجنات البوتاسيوم. تخزين في زجاجة داكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها 7 أيام.
- يعد حمض الهيدروكلوريك حل 3.7٪ وذلك بإضافة 1 مل حمض الهيدروكلوريك تتركز (37 N) إلى 9 مل من الماء المقطر (1:10). إعداد 3.7٪ محلول حمض الهيدروكلوريك جديدة علىيوم من التجربة. تأكد من أن الحل الأسهم 37 N حمض الهيدروكلوريك المستخدمة ليست قديمة جدا. يجب أن يتم تخزين تتركز محلول هيدروكسيد الأمونيوم (14.8 م) في 4 درجات مئوية لمنع المولية للمحلول مشبع من التناقص.
- نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.5٪ في محلول برمنجنات البوتاسيوم إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام.
- ماصة 0.5٪ في محلول برمنجنات البوتاسيوم بلطف صعودا ونزولا، ويفضل من دون إزعاج أقسام. احتضان لمدة 2 دقيقة وتكرار pipetting ل. السماح للأنبوب microcentrifuge الوقوف حتى تسوية جميع الأقسام أسفل. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة كما المقاطع قد تحصل على تضررت. قد يكون من الصعب أن نرى الأقسام الجذعية باعتبارها الحل هو الظلام، حتى تبقى الأنبوب مع الأقسام في أنبوب اختبار رف والسماح لهم لتسوية لمدة 2 دقيقة.
- باستخدام ماصة 1 مل، استخلاص 700 ميكرولتر من 0.5٪ محلول برمنجنات البوتاسيوم.إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف خارج محلول برمنجنات البوتاسيوم. تكرار 3-4x أو حتى الحل يبقى الماء واضحة.
- تجاهل المياه. بسرعة إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 3٪ حتى تبرأ اللون البني العميق من الأقسام. هذا قد يحدث في غضون 3-5 دقائق أو قد تتطلب يغسل 2 من 5 دقائق لكل منهما. ماصة من كل 3٪ حمض الهيدروكلوريك حل والشروع فورا في الخطوة التالية.
- إضافة 1 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المركزة. استخدام ماصة 1 مل مع قطع طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر. تغطية الأجزاء مع ساترة. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان. تنبيه: لأن هيدروكسيد الأمونيوم هو تآكل للغاية، فإنه يتطلب المزيد من الحيطة والانتباه لتجنب التسبب في تآكل إلى مرحلة المجهر أو العدسة. ملاحظة: يمكن للأبخرة هيدروكسيد الأمونيوم الضباب ساترة، مما يجعل من الصعب مراقبة عينة. لذا كن حذرا اضافية قبل إضافة ساترة. الحل يجف في 5-10 دقيقة، وبالتالي فإن التصوير لديه أن تكتمل في غضون تلك الفترة من الزمن.
7. الكونغو الأحمر يلطخ 11،15
- حل 0.5 غرام الكونغو الحمراء في 100 مل من الماء المقطر لإعداد 0.5٪ محلول الأحمر في جمهورية الكونغو.
- نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.5٪ الحل الأحمر في جمهورية الكونغو إلى الأنبوب. ماصة بلطف 0.5٪ الحل الأحمر في جمهورية الكونغو صعودا وهبوطا دون إزعاج أقسام. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، وتكرار pipetting ل. يتبع مع 3 دقيقة أخرى من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.5٪ محلول الأحمر في جمهورية الكونغو. إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف من الحل الأحمر في جمهورية الكونغو. تكرار غسل 3-4X حتى حل الغسيلواضح.
- استخدام ماصة 1 مل مع قطع طرفها في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر. ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر، وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة العينات على شريحة المجهر تحت زرقاء ضوء الإثارة باستخدام فلتر مع ممر الموجة من 560/40. ملاحظة: عدم تخزين المقاطع في الماء لفترة طويلة قبل التحليل المجهري، حيث أن المياه سوف تغسل الكونغو الحمراء في 10-30 دقيقة.
8. Calcofluor الأبيض تلطيخ 9
- حل 0.02 غرام من الفلورسنت منير 28 (calcofluor الأبيض M2R) في 10 مل من الماء المقطر لإعداد محلول المخزون 0.2٪. ويمكن تخزين الحل 0.2٪ لمدة ستة أشهر في زجاجة داكنة في 4 درجات مئوية. يعد حل العاملة من 0.02٪ من خلال تمييع 0.2٪ محلول المخزون 10X مع الماء المقطر.
- نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة إلى أنبوب 1 مل من calcof 0.02٪luor حل البيضاء. ماصة بلطف الحل بيضاء 0.02٪ calcofluor صعودا وهبوطا. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتكرار pipetting ل. احتضان قسم للدقيقة 3 أخرى في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: السماح للأقسام ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب لجعله أسهل للماصة من الحل دون الإضرار أقسام.
- استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.02٪ calcofluor حل بيضاء وإضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر؛ الانتظار لمدة 5 دقائق لشطف من الحل calcofluor الأبيض. تكرار غسل 3-4X. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بسهولة من دون وقوع خسائر.
- ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة أقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
9. طولويدين بلوه يا تلطيخ 16،17
- حل ز 0.02 طولويدين يا زرقاء في 100 مل من الماء المقطر لإعداد محلول 0.02٪. ملاحظة: يمكن تخزين الحل يا الأزرق طولويدين لمدة أسبوعين في زجاجة داكنة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل أقسام الجذعية إلى أنبوب 2.0 مل ميكروسنتريفوج. إضافة 1 مل من 0.02٪ طولويدين يا زرقاء حل للأنبوب. ماصة بلطف 0.02٪ طولويدين الحل يا الأزرق صعودا وهبوطا. ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتكرار pipetting لمرة واحدة. ملاحظة: يجب الحرص على عدم ماصة الأقسام في تلميح ماصة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف أجزاء. السماح للأنبوب microcentrifuge نقف مكتوفي الأيدي حتى يستقر الأقسام أسفل. وهذا قد يكون من الصعب أن نرى، والحل هو الظلام، حتى تبقى الأنبوب الذي يحتوي على أقسام على أنبوب اختبار رف والسماح لهم لتسوية لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ماصة 1 مل لاستخلاص 700 ميكرولتر من 0.02٪ طولويدين الحل يا الأزرق. إضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف خارج طولويدين الأزرق يا سولution. تكرار 3-4x أو حتى حل يغسل واضح. استخدام ماصة 1 مل مع قطع ماصة طرف في مثل هذه الطريقة التي المقاطع يمكن pipetted بها بسهولة دون تعرضها للتلف.
- ماصة بلطف أقسام في تلميح وعلى شريحة المجهر وغطاء لهم مع ساترة. مراقبة أقسام تحت الإضاءة مشرق الميدان.
- ضبط الإضاءة كوهلر على المجهر. اختيار الهدف. التركيز على العينة الأولى. جلب شدة الضوء إلى نصف أو أقل. إغلاق الحجاب الحاجز الحقل (FD) والفتحة (ا ف ب) أو إحضاره إلى أدنى الإعداد ممكن على هذا الهدف بالذات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقف تضمين وباجتزاء:
استخدام قالب من البلاستيك محلية الصنع لتضمين ينبع في 7٪ الاغاروز ثبت أن تكون سريعة وسهلة (الشكل 1). شطري (A و B؛ الشكل 1) من النظام قارورة جزءا لا يتجزأ من جعلها بسيطة لاطلاق سراح بسهولة الجذعية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز كما الاغاروز لا التمسك أجزاء القارورة التي هي خاملة، والحفاظ على نظام نظيفة. قارورة يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لسنوات. راحة تخزين الجذعية جزءا لا يتجزأ أيضا يجعل الخطوات المقبلة أسهل. من أجل إنقاذ في وقت ما، على غرار جزءا لا يتجزأ من ينبع ويمكن تصنيف (تصل إلى 3) على لوحة واحدة لباجتزاء باجتزاء.
مراقبة العطريات تحت الأشعة فوق البنفسجية:
وقد شنت الأقسام الجذعية في الماء المقطر إلى الشرائح الزجاجية، ولاحظ تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المركبات العطرية، بما في ذلك اللجنين في الخلايا، يمكن تصور بواسطة تألق ذاتي بهم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. الخشب (س ص) والألياف بين الحزم (فاي)أظهرت تألق ذاتي تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية ولكن ليس في باب (بي) والقشرة أو البشرة (الجيش الشعبي) (الشكل 2)، وذلك لأن اللجنين، البوليمر العطرية، وتودع الثانوية الحيوي خلال جدار الخلية. في بعض الحالات، عندما تتراكم كميات كبيرة من النباتات العطرية في فجوات بهم (على سبيل المثال، الأنثوسيانين)، مضان يمكن ملاحظتها في الخلايا القشرية (لا تظهر البيانات). حللت تنبع عبر أقسام تحت 5X، 10X، 20X، 40X التكبير و(الشكل 2 لوحات A، B، C، D و- E، على التوالي) لتصور أفضل جدار الخلية توزيع العطرية عبر الجذعية.
مراقبة اللجنين في أقسام الجذعية الملون مع فلوروغلوسين ومولي البقع:
كانت تتألف من سفن الخشب والألياف والألياف بين الحزم العناصر فقط من الجذعية التي كانت ملطخة من البقع اللجنين (فلوروغلوسين ومولي) باستخدام نوع البرية قسم الجذعية العينة. فلوروغلوسين صمة عار يتفاعل مع سينامالديهيد نهاية مجموعات من اللجنين لإعطاء اللون الوردي أو ضارب الى الحمرة 4 (الشكل 3). كما لوحظ تحت إضاءة فوق البنفسجية، لوحظ تلوين ضارب الى الحمرة في الخشب والألياف بين الحزم ولكن تغيب في لب وقشرة أو البشرة (الشكل 3). حللت تنبع عبر أقسام تحت 5X، 10X، 20X، 40X التكبير و(الشكل 3 لوحات A، B، C، D و- E، على التوالي) لتصور أفضل توزيع وصمة عار فلوروغلوسين عبر الجذعية والتفريق بين الأنسجة الرئيسية؛ الخشب والألياف بين الحزم؛ باب والقشرة؛ والبشرة. عادة ما تكون كثافة اللون يرتبط مستوى lignification بطريقة النوعية - إلا عندما متحولة تحليل أو المعدلة وراثيا غير المخصب بشكل غير طبيعي في وحدات المستمدة سينامالديهيد (على سبيل المثال نذل متحولة) <سوب> 14. وصمة عار مولي هي محددة في الكشف عن وحدات اللجنين syringyl في الخشب والألياف بين الحزم. يشير تلوين أحمر وجود وحدات اللجنين syringyl في العناصر اللجنين (الشكل 4) 18. ومع ذلك، لوحظ تلون الحمراء أكثر إشراقا في الألياف بالمقارنة مع الأنسجة الخشب مما يشير إلى أن الألياف تحتوي على مستوى أعلى من S اللجنين في حين أن الخشب هو أكثر المخصب في وحدات G. كما لوحظ بعد فلوروغلوسين تلطيخ، لوحظ تلون الحمراء في الخشب والألياف بين الحزم ولكن تغيب في لب وقشرة أو البشرة (الشكل 4). فإنه يرتبط أيضا مع توزيع اللجنين وحظ تحت الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2) ويظهر أن وحدات syringyl موجودة في كل الأنسجة lignified من هذه العينة الجذعية. حللت تنبع عبر أقسام تحت 5X، 10X، 20X، 40X التكبير و(الشكل 2 لوحات A، B، C، وD - E، على التوالي) لتصور أفضل توزيع وصمة عار مولي عبر الجذعية والتفريق بين أنسجة رئيسية: ألياف الخشب وبين الحزم، وباب القشرة، والبشرة. من المهم أن نلاحظ أن كمية وتوزيع وحدات syringyl بين الأنسجة lignified تختلف مع سن الجذع ويمكن أن تكون غائبة في جذع الشباب (لا تظهر البيانات).
مراقبة أقسام الجذعية الملون مع Calcofluor الأبيض والأحمر الكونغو البقع:
Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان nonsubstituted أو استبداله ضعيفة؛ في حين الكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبخاصة السليلوز. وقد لوحظت أقسام الجذعية ملطخة calcofluor الأبيض تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 6-9. وقد لوحظت الكونغو أقسام حمراء ملطخة تحت زرقاء ضوء الإثارة باستخدام فلتر مع ممر الموجة من 560/40. كلا calcofluor الأبيض والأحمر الكونغو الملون البشرة، القشرة، وباب؛ الهو هو لأن كل من هذه الأنسجة تحتوي على السليلوز والكبرى بوليمر السكاريد في جدران الخلايا الخاصة بهم (الشكل 5 والشكل 6، على التوالي). وعلى النقيض من calcofluor الأبيض، الكونغو السكريات الملون الأحمر أفضل في الخشب والألياف بين الحزم ويبدو أقل تأثرا وجود اللجنين (الشكل 5 والشكل 6) 10،11. تنبع تم تحليل المقاطع العرضية تحت 5X، 10X، 20X، 40X التكبير و(ألواح A، B، C، وDE، على التوالي من الأرقام 5 و 6) لتصور أفضل calcofluor التوزيعات وصمة عار أبيض أحمر والكونغو عبر الجذعية والكبرى الأنسجة (الخشب والألياف بين الحزم، وباب القشرة، والبشرة).
مراقبة أقسام الجذعية الملون مع طولويدين الأزرق O:
ويصنف طولويدين يا الأزرق كما صبغة متعدد الألوان لأنه يتفاعل مع مختلف مكونات الكيميائية للخلايا بشكل مختلف والنتائج فيعينة متعددة الألوان (الشكل 7). الألوان الناتجة يمكن أن توفر معلومات عن طبيعة الخلية وجدرانه. طولويدين يا الأزرق هو صبغة الموجبة التي تربط لمجموعات المشحونة سلبا 5. محلول مائي من هذه الصبغة الزرقاء، ولكن يتم إنشاؤها ألوان مختلفة عندما يربط الصبغة مع جماعات مختلفة في أنيوني 6،9 الخلية. على سبيل المثال، سوف تظهر اللون الأرجواني وردي عندما يتفاعل مع الصبغة السكريات carboxylated مثل حمض بكتينية؛ الأخضر والأزرق المخضر، أو زرقاء لامعة مع المواد بولي العطرية مثل اللجنين والعفص؛ والأرجواني أو الأزرق المخضر مع الأحماض النووية. كشفت طولويدين O الزرقاء الجذعية عبر المقاطع التي الخشب والألياف وبين الحزم lignified لأنها تظهر صبغة زرقاء أو زرقاء مخضر (الشكل 7، لوحة C)، وهو ما يتفق مع الأشعة فوق البنفسجية والملاحظات تلطيخ فتاه حمض الهيدروكلوريك (أرقام 2 و 3). في المقابل، فإن لباب و تظهر الأنسجة القشرة والبشرة مخضر تلوين الأزرق أو الأزرق لأنه، على الرغم من أنها ليست lignified، أنها تحتوي على بعض البوليمرات البكتين في جدران زنزاناتهم. حللت تنبع عبر أقسام تحت 5X، 10X، 20X، 40X التكبير و(الشكل 7 لوحات A، B، C، D و- E، على التوالي) لتصور أفضل طولويدين يا الأزرق التوزيع وصمة عار في جميع أنحاء الجذعية والتفريق بين الأنسجة الرئيسية .
. الرقم 1 العفن محلية الصنع لتضمين ينبع على الجانب الأيسر. أعلى 2 مل المسمار غطاء أنبوب microcentrifuge (الجزء A) والجزء السفلي من 0.6 مل أنبوب microcentrifuge (الجزء ب). على الجانب الأيمن؛ وParafilm عقد شطري؛ A و B لتشكيل القالب النهائي.
الشكل 2. مضان الأشعة فوق البنفسجية من A. الجذعية thaliana عبر أقسام. أقسام عرضية من نوع البرية A. الجذعية thaliana تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مضان تبين وجود المركبات العطرية، بما في ذلك اللجنين، فقط في جدران الألياف بين الحزم وخلايا الخشب (A - E). يشار إلى مواقف البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، والألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X، لوحة ب: 10X؛ وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الشكل 3. فلوروغلوسين، حمض الهيدروكلوريك تلطيخ A. الجذعية thaliana عبر أقسام. فلوروغلوسين، حمض الهيدروكلوريك تلطيخ (وردي أو لون ضارب الى الحمرة) من نوع البرية A. thaliana القسم الجذعية تبين ترسب اللجنين طبيعي في جدران الخلايا والألياف بين الحزم الخشب (A - E). يشار إلى مواقف البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، والألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X، لوحة ب: 10X؛ وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الشكل 4. MAULE تلطيخ A. الجذعية thaliana عبر أقسام. MAULE تلطيخ (اللون الأحمر) من نوع البرية A. thaliana <م /> القسم الجذعية تبين ترسب اللجنين طبيعي في جدران الخلايا والألياف بين الحزم الخشب (A - E). يشار إلى مواقف البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، والألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X، لوحة ب: 10X؛ وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الرقم 5. Calcofluor تلطيخ الأبيض من A. الجذعية thaliana عبر المقاطع. Calcofluor تلطيخ بيضاء من نوع البرية A. thaliana القسم الجذعية تظهر ترسب السليلوز في جدران الخلايا من خلايا البشرة، القشرة، باب، الألياف بين الحزم، والخشب (A - E). وpositiإضافات من البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، يشار إلى الألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X، لوحة ب: 10X؛ وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الرقم 6. الكونغو تلطيخ الحمراء A. الجذعية thaliana المقاطع العرضية. الكونغو تلطيخ حمراء من نوع البرية A. thaliana القسم الجذعية تظهر ترسب السليلوز في جدران الخلايا من خلايا البشرة، القشرة، باب، الألياف بين الحزم، والخشب (A - E). يشار إلى مواقف البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، والألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X؛ وحة B وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الرقم 7. طولويدين يا الأزرق تلطيخ A. الجذعية thaliana عبر المقاطع. طولويدين يا الأزرق تلطيخ من نوع البرية A. thaliana القسم الجذعية تبين ترسب اللجنين طبيعي في جدران الخلايا والألياف بين الحزم الخشب (A - E). يشار إلى مواقف البشرة والقشرة (الجيش الشعبي)، والألياف بين الحزم (فاي)، باب (بي)، والخشب (XY). تكبير: لوحة A: 5X، لوحة ب: 10X؛ وحة C: 20X؛ وحات D و E: 40X. شريط = 100 ميكرون.
الجدول 1. مجهر وإعدادات الكاميرا للتصوير. المبادئ التوجيهية للعمل مع مرشحات مضان والتصوير مشرق الميدان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع أقسام الجذعية A. thaliana لدراسة تنظيم الخلايا في جدار الخلية والثانوية لدراسة نوعيا الاختلافات بين نوع البرية والنباتات المعدلة وراثيا. التقنيات المستخدمة عادة لباجتزاء العينات هي قطع اليد المباشر؛ أو عندما هي جزء لا يتجزأ العينات في الاغاروز أو تثبيتي، باجتزاء يمكن القيام به مع vibratome أو مبضع للفحص المجهري. وعلى النقيض من القطع من جهة، ومشاركة اثنين تسمح الحد من مخاطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن طريق إعداد عينة سيئة بسبب الاختلافات بين سمك العينات والأسطح غير المستوية. كل هذه الطرق لها مزاياها وعيوبها. اخترنا التضمين في الاغاروز، تليها باجتزاء باستخدام vibratome، وفعلت ذلك للأسباب التالية: سهولة دمج والوقت الذي يقضيه في استخدام الاغاروز يلغي الحاجة للمعالجة معقدة من أنسجة جديدة. أيضا، وقوالب محلية الصنع لدينا هي سهلة ورخيصة لجعل، ويمكن عقد اله وقف على التوالي، ويمكن استخدامها على مدى سنوات عديدة، ويمكن أن تساعد في إطلاق سراح من السهل العينات من دون فوضى. أفضل طريقة لإذابة عالية مئوية الاغاروز والحصول على حل متجانسة (حل كامل من 7 غرام من الاغاروز في 100 مل من دون تشكيل حبيبات مكتنزة) هو الأوتوكلاف أو الميكروويف لأنها في أدنى كثافة. فمن المهم لخفض الأنسجة الجذعية الطازجة، أو بدلا من ذلك لتخزينه في لوحة وضعت على الجليد تحتوي على ورق الترشيح المبللة بالماء لمنع جفاف الأنسجة وتشوه. سوف تخزين الجذعية لفترات أطول من 30 دقيقة من دون رطوبة عالية تسبب الجذعية لتجف. درجة حرارة الاغاروز الحق قبل أن يتم تضمين الجذعية يجب أن تكون حوالي 50 درجة مئوية. فمن الأهمية بمكان للتحقق من وجود فقاعات الهواء بعد أن تم سكب الاغاروز في القارورة، لأن فقاعات الهواء يسبب فجوات في قالب وبالتالي باجتزاء سيكون متفاوتا. فقاعات الهواء يمكن إزالتها بسرعة عن طريق وضع حل تحت فراغ قبل صبذلك. يجب وضع الجذعية في الاغاروز عندما لا تزال لينة وليس أكثر دفئا من 50 درجة مئوية. سوف الحرارة يؤدي إلى تلف عينة من الذبول الجذعية وسوف يدمر مورفولوجيا الخلايا. إذا كان الاغاروز بارد جدا سوف الجذعية لا تخترق من خلال الاغاروز التضمين، وسوف لا يكون ممكنا. بعد تضمين الاغاروز، وعينات الجذعية يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد.
استخدام vibratome بدلا من غلة باجتزاء ناحية خفض بالضبط العينات وأفضل جودة الصورة. جميع تعليمات السلامة ينبغي أن تقرأ بعناية واتباعها أثناء باستخدام vibratome. فمن المهم للتأكد من أن القرص العينة نظيفة وجافة لتسمح لاصقة الأنسجة لعقد العينة بقوة في مكان بحيث لا تسقط خلال باجتزاء. يتم تحديد سمك عينات لتحمل حمض قاسية والعلاجات قاعدة خلال إجراءات تلطيخ. شفرة الحلاقة المستخدمة في vibratome يجب أن تكون مسطحة تماما لضمان أن المقطع هو قطع EVenly. باجتزاء يستغرق حوالي 20 دقيقة لكل عينة؛ من أجل توفير الوقت وعينات مماثلة يمكن مقطوع في مجموعات على طبق من عينة واحدة. خلال باجتزاء، يتم نقل مقاطع من علبة عازلة في طبق بتري الصغيرة لجعل أقسام السهل أن نرى على خلفية واضحة وتحرير صينية عازلة للعينة القادمة. أقسام يمكن استخدامها على الفور لإجراءات تلطيخ المصب أو تخزينها لاستخدامها لاحقا. Aliquoting الأقسام الجذعية إلى 2.0 مل أنابيب microcentrifuge يساعد في فتيلة لتلطيخ الاجراءات. إجراء تعديلات الصحيح وإعدادات الكاميرا والمجهر حاسمة للغاية لتحقيق صور ذات جودة عالية. ضبط الإضاءة كولر هي واحدة من أهم الخطوات في استخدام المجهر. وتهدف التعديلات لفتحة وشدة الضوء، كما هو موضح في قسم الأساليب، إلا بوصفها المبدأ التوجيهي. قد يحتاجون إلى تعديل تبعا المجهر والكاميرا المستخدمة. استخدمنا عالية الدقةكاميرا رقمية مع كبير رقاقة CCD شكل الناقلات وليس مفتاح ميكانيكي للتصوير أشعة فوق البنفسجية، calcofluor الأبيض، والكونغو تلطيخ الأحمر؛ وعالية الدقة واللون عالية السرعة كاميرا للصور مشرق الميدان من مولي، فلوروغلوسين وطولويدين يا الأزرق تلطيخ. وقد تم تحليل الصور ومعالجتها وتجميعها باستخدام برامج التصوير القياسية.
فلوروغلوسين هو وصمة عار الأكثر استخداما لتحديد اللجنين؛ أنها ليست وصمة عار اللجنين صحيح لأنه بقع سينامالديهيد فقط نهاية المجموعات. وصمة عار فلوروغلوسين، المعروف أيضا باسم Weisner صمة عار، وتعطي الكرز الوردي أو لون ضارب الى الحمرة مميزة في الخشب والألياف بين الحزم التي توجد فيها هذه الجماعات ألدهيد 4. كثافة اللون الوردي يختلف مع مدى lignification. على الرغم من الفروق الدقيقة هي أصعب لمراقبة، فمن السهل على الفور الاختلافات بين النوع البري ومتحولة أقسام الجذعية التي لديها اختلافات في محتوى اللجنين بهم 19. بل هو أيضا قمة شرق آسياذ لمراقبة الاختلافات بين الأصغر سنا (نحو قمة الجذعية) وكبار السن (الجذعية قاعدة) الأنسجة، وذلك لأن مستويات lignification بين هذه الأنسجة تختلف. عادة في النوع البري الجذعية، البشرة القشرة وباب لا تحتوي على cinnamaldehydes (وبالتالي لا تحصل الملونة) ما لم يكن هناك lignification خارج الرحم 20. وصمة عار مولي، من ناحية أخرى، خاصة تجاه وحدة اللجنين syringyl، ويمكن استخدامها للتمييز التخصيب مختلفة اللجنين في S أو G الوحدات (مثل الألياف مقابل أنسجة الخشب) 14،18. وبرمنجنات البوتاسيوم وحمض الهيدروكلوريك الفعل على نواة syringyl وحدة S في اللجنين لتشكيل methoxycatechol ثم إلى ميثوكسي-O-كينون التالية رد فعل مع هيدروكسيد الأمونيوم. وصمة عار مولي يعد مؤشرا جيدا للتمييز المسوخ التي تفتقر أو المنضب على نطاق واسع في وحدات S من اللجنين (على سبيل المثال في A. thaliana المسوخ f5h والنباتات عارية البذور عامة)، مولي يعطي الأصفر والبني التلون معاهدهيئة البيئة الأحمر في كل من الخشب والنسيج الداعم 21. لنفس السبب، مولي تلطيخ يمكن استخدامها للتمييز بين كاسيات البذور، والتي تحتوي في المقام الأول S اللجنين من عاريات البذور التي تفتقر عادة وحدة S 18. لأنه يتم استخدام حمض قوي وقاعدة خلال فلوروغلوسين والإجراءات تلطيخ مولي على التوالي، تحتاج إلى بعض الخطوات التجريبية التي يتعين القيام بها بحذر. كل من حمض الهيدروكلوريك تتركز وهيدروكسيد الأمونيوم والمواد المسببة للتآكل قوية؛ أنها يمكن أن تتدهور المرحلة المجهر والعدسة إذا لم يتم التعامل مع الشرائح التي تحتوي على عينات ملطخة فتاه حمض الهيدروكلوريك ومولي بشكل صحيح. كما أنها يمكن أن تجف بسرعة، في غضون 5-10 دقيقة، مما تسبب في العينات في التدهور، وبالتالي فإن التصوير الذي ينبغي القيام به بسرعة. طولويدين يا الأزرق هو وصمة عار متعدد الألوان وبقع مختلفة من مكونات جدار الخلية بألوان مختلفة كما يتفاعل مع مكونات كيميائية مختلفة من جدران الخلايا بشكل مختلف، وإنتاج عينة متعددة الألوان. الألوان الناتجة يمكن أن يقوم بتقديمه المعلومات عن طبيعة الخلية. طولويدين يا الأزرق هو أيضا صبغة الموجبة التي تربط لمجموعات سالبة الشحنة 5،6. محلول مائي من هذه الصبغة الزرقاء، ولكن يتم إنشاؤها ألوان مختلفة عندما يربط الصبغة مع مجموعات مختلفة أنيوني في الخلية. على سبيل المثال، والألوان هي ردي الأرجواني عندما يتفاعل مع الصبغة السكريات carboxylated مثل البكتين؛ الأخضر والأزرق المخضر، أو زرقاء لامعة مع المواد العطرية مثل اللجنين والعفص؛ والأرجواني أو الأزرق المخضر مع الأحماض النووية. تلطيخ سهل ويمكن أن تستمر لمدة يومين.
Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان nonsubstituted أو استبداله ضعيفة 6-9، والكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبشكل خاص لالسيليلوز 8،10،11. Calcofluor البقع البيضاء ببراعة البشرة، القشرة، ولكن يتم تقليل باب أن تألق بشكل كبير في الخشب والألياف بين الحزم. هناك نوعان من عتفسيرات ossible لمضان انخفاض الأبيض calcofluor في الأنسجة lignified بشكل كبير؛ أحد سمات ذلك إلى وجود اللجنين، التي من شأنها، بدوره يقلل من قدرة الأبيض calcofluor لنشر صحيح حتى السكريات. A نقطة التفسير الثاني لتبريد الجزئي للمضان المنبعثة من calcofluor الأبيض متحمس تحت الأشعة فوق البنفسجية. وعلى النقيض من calcofluor أبيض، أحمر الكونغو تلطيخ يبدو أقل تأثرا وجود اللجنين. يمكن أن تكون ذات صلة إلى الاختلاف في خصائص مضان بين calcofluor الأبيض والأحمر الكونغو؛ قدرة نشر أفضل الكونغو الأحمر من خلال الأنسجة lignified من calcofluor أبيض؛ أو اختلاف طفيف في السكاريد خصائص ملزمة 22. من المهم أن نلاحظ أن الأجزاء ملطخة الكونغو أحمر يجب أن لا يتم تخزينها وقتا طويلا قبل التصوير، لأن الكونغو أحمر يميل إلى الحصول على جرفت في الماء.
على الرغم من تلطيخ النسيجية ليس الكميولا قاطعة تماما، فإنه يمكن أن تكشف من خلال الإشارات البصرية ثروة من المعلومات حول الصفات الهامة مثل سلامة الأنسجة أو غير طبيعي ترسب جدار الخلية وlignification. تقنيات تلطيخ المذكورة أعلاه هي سهلة لتنفيذ وقابلة للتطبيق لعناصر حاسمة في جدار الخلية النباتية، مثل اللجنين والسليلوز. على النقيض من ذلك، المناعي باستخدام أمصال مضادة محددة والاجسام المضادة مطلوب للكشف عن مختلف مكونات hemicelluloses والبكتين. ويهدف هذا التقرير ليكون بمثابة التمهيدي للمبتدئين في مجال الثانوية تلطيخ جدار الخلية الذين يستخدمون A. thaliana كنظام نموذجهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نحن ممتنون لسابين رسل للمساعدة التحرير. وكان هذا العمل جزءا من معهد الطاقة الحيوية المشتركة وزارة الطاقة (http://www.jbei.org) بدعم من وزارة الطاقة الأميركية، مكتب العلوم ومكتب بحوث البيولوجية والبيئية، من خلال عقد DE-AC02-05CH11231 بين لورانس بيركلي مختبر الوطني ووزارة الطاقة الأميركية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
