Introduction
Стена растительная клетка имеет множество информации в ее различных компонентов: лигнин, целлюлоза, гемицеллюлозы (ксилан, glucuronoxylan, ксилоглюкан, арабиноксилан, смешанная связь глюкан, или Glucomannan) и пектин. Гистологические методы обеспечивают важные визуальные подсказки в изучении различий внутри вторичных клеточных стенок в организационных и клеточном уровнях. Различные гистологические методы были разработаны и могут быть найдены в литературе, но эти методы могут быть сложным и трудоемким для начинающих, потому что очень подробные протоколы с простыми визуальными инструкциями редко, если когда-либо доступны. Целью данного исследования является предоставление рекомендациям по ее гистологических методов окрашивания для получения высококачественных изображений.
Секционирование шток ткани является первым шагом в визуализации клеточных стенок и клеточных форм. Хотя ручной огранки разделы недороги и займет меньше времени, чтобы подготовиться, использование Vibratome предлагает согласованность идает высокое качество изображения. Использование Vibratome позволяет производить лучшее качество данных путем генерации даже участки с той же толщины, что позволяет получать резкие снимки и значительно снижает риск получения неточных различия между образцами, которые будут просто вызванных плохой подготовки образца. Использование смолы исправить свежие образцы может быть проблемой для начинающих и до сих пор может занять много времени даже для специалистов, когда анализ нужно сделать быстро. Кроме того, становится невозможным измерить любой биологической активностью с образцом, когда он был встроен в смоле. Один простой метод, который использует агарозы и самодельный пресс-формы является полезным для встраивания стволовых ткани, а также может быть использован в других приложениях, требующих рассечение мягких тканей. По сравнению с вложением образцов в смоле, этот метод имеет то преимущество, что в ткани живых и снижения образец манипуляции. Секционирование ткани через Vibratome очень аккуратный и не генерирует однороднаяOUS разделы, которые, в зависимости от цели исследования, то можно использовать с несколькими различными методами окрашивания.
Простейшие методы для наглядного лигнин и другие ароматические соединения используют ультрафиолетовое (УФ) света. Возбуждение молекул ароматических основе УФ-светом старая техника, но он по-прежнему один из самых быстрых подходов для визуализации лигнина. Тем не менее, УФ визуализация на самом деле не является идеальным для обнаружения лигнина, потому что ультрафиолетовый свет будет возбуждать другие ароматические. Лигнин состоит в основном из трех блоков, в monolignols (hydroxycinnamyl спирты: кониферилового спирта, синапилового спирта и п-каумарильного спирт) 1-3. Флороглюцин пятно может дать ключ к степени cinnamaldehydes присутствующих в древесине, клетчатки, и трахеи тканей 4. Флороглюцин является хорошим показателем общих cinnamaldehydes и может различать cinnamaldehydes и других ароматических соединений. Мономеры синапилового спиртов могут быть обнаруженыи дифференцированы с помощью Мол пятна. Толуидин синий вывода полихроматичным краситель и, следовательно, имеет возможность окрасить различные элементы клеточной стенки в разные цвета 5,6. Основное применение толуидиновым синим O является выявление пектин и лигнин 5,6. Преимущество использования толуидиновым синим O является то, что многие элементы клеточной стенки могут быть визуализированы в одну стадию. Оба Calcofluor белый и конго красный легко работать, и может быть использован для визуализации целлюлозу. Calcofluor белые пятна целлюлозы, мозолистый, и другие не замещенных или слабо замещенных β-глюкан 6-9, в то время как конго красный пятна непосредственно к β-(1 → 4)-глюканы и особенно с целлюлозой 10,11. Целью данного исследования является предоставление простым рекомендациям для использования вышеупомянутых методов окрашивания для получения высококачественных изображений с А. THALIANA стеблей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Стволовые вложение
- Сделать 7%-ный раствор агарозы в воде (7 г электрофорез класса агарозы в 100 мл дистиллированной воды). Растворить агарозы в автоклаве в течение 20 мин или по микроволновой печи в течение 20 мин при низкой интенсивности (например, 10% интенсивности 1250 Вт СВЧ).
- Подготовить домашнее формы для встраивания стебли с использованием пластиковых флаконов.
- Использование лезвие, отрезать коническую нижнюю часть 2 мл завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных (часть А). Иглой шприца, проколоть отверстие в крышке трубки немного больший, чем диаметр штока для встраивания. Затем вырезать 0,5 см от дна 0,6 мл микроцентрифужных трубки (Часть B).
- Добавить отсечения 0,5 см часть 0.6 мл микроцентрифужных трубки в нарезанные 2 мл трубки микроцентрифужных. Уплотнение две части, используя парафильмом (рис. 1). ПРИМЕЧАНИЕ: В нижней части трубки разрезают, чтобы облегчить удаление встроенного образца после агарозном укрепил. Тон отверстие в крышке поможет в проведении стебель устойчивый когда шток вкладывается в агарозы. Пресс-форма будет служить для хранения агарозы и удерживайте Стебель прямой, когда вложение. Парафильмом проведет две части, А и В, пока агарозном не установлен и шток вкладывается.
- Использование лезвие, вырезать секцию штока из области интересов, (например середине первого ствола междоузлия). ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, стебель следует обрезать перед вложением чтобы избежать разрушения обезвоживанием. Кроме того, стержень может быть временно сохранены в пластину, содержащую увлажненную фильтровальную бумагу с водой. Эта пластина не могут быть размещены на льду до момента быть встроен чтобы предотвратить обезвоживание и тканей деформации. Хранение шток на срок более 30 минут без высокой влажности может привести стебель высохнуть.
- Расплава агарозы в микроволновой печи при низкой интенсивности. ВНИМАНИЕ: флакон, содержащий агарозы может быть горячей. Используйте рукавицей, чтобы забрать бутылку. Пусть расплавленную агарозу SТ и при комнатной температуре (от 20 ° С до 25 ° С), пока не остынет примерно до 50 ° С.
- Медленно пипетки 5 мл агарозы в предварительно сделанного пластиковые формы, чтобы заполнить пузырек. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, нет пузырьков воздуха в формы. Пузырьки воздуха вызовет пробелы в агарозном формы и не будет полностью покрывать образец стебель, который в конечном итоге приведет к неравномерному резки образца разделах.
- Пусть агарозы остыть в течение 30 до 60 сек, чтобы стать полутвердые. Проверьте с небольшим зубочисткой, убедившись, что он может проникать и встать, но не плавать, в агарозы. ПРИМЕЧАНИЕ: Если шток находится когда агарозы по-прежнему жарко это повредит образец в Сморщенность стебель, разрушая морфологии клеток.
- Установите шток в этом агарозном заполненные флаконе. Убедитесь, что шток остается прямой. Поместите перфорированную крышку таким образом, что наконечник штока проходит по колпачка. Не поверните винт-на колпачок. Иногда более чем одного ствола (одного вида) может быть embedded в одном флаконе; но в данном конкретном случае, не используйте крышку. ПРИМЕЧАНИЕ: Если винт-колпачок включен, стебель получите витая.
- Оставьте флакон при комнатной температуре или при 4 ° С в течение 10-30 мин, пока она не затвердеет.
- Извлеките форму, осторожно переместив его из трубки. Откройте парафильмом. Нажмите на нижнюю часть части B пресс-формы с большим пальцем осторожно, чтобы освободить затвердевшей агарозы из части А на предметное стекло микроскопа.
- Разрежьте агарозном встроенный шток на три примерно равные кусочки 1,2 см в длину. Вырежьте часть стебля, которая не была в агарозы и выбросьте его.
- Храните эти кусочки агарозы с встраиваемое стебли в герметичных 2 мл микроцентрифужных пробирок в темный ящик при 4 ° С до готовности к разделу. Кроме того, хранить пробирки при 4 ° С в течение не более одной недели. ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение возможно, но экспериментатор должен быть в курсе, что встроенный стебли все еще живы и, в зависимости от эксперимента, Артефакты могут потенциально быть введены.
2. Стволовые секционирования
- ВНИМАНИЕ: Внимательно прочтите инструкцию Vibratome и следуйте всем инструкциям по безопасности.
- Убедитесь, что образец диск чистый и абсолютно сухой (без любой твердый или жидкий). Очистите образца диск с бритвенным лезвием, чтобы удалить остатки клея из предыдущих экспериментов и промывают водой. Затем высушите бумажным полотенцем. ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет гарантировать, что клей хорошо работает, и связывается с геле образца. Если этот шаг не сделано должным образом, не исключено, что образец не может присоединиться к диску и позже вызывать образец упасть диск во секционирования.
- Используйте мягкую бумагу салфетки для удаления влаги из агарозного блока, содержащего образцы.
- Поместите небольшую каплю клея ткани на образец диска. Подряд из клея, чтобы покрыть площадь в середине пластинки с помощью иглы клея бутылки. Быстро местоагароза блок так, что образцы либо перпендикулярно или параллельно с пластиной для поперечных или продольных сечений, соответственно. Разрешить клей для фиксации образца к образцу диска при комнатной температуре или при 4 ° С в течение 10-30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Это время чувствительных шаг.
- Закрепите образца диск в месте на подносе буфера или корыто. Блок / с из агарозы с секциях должно быть параллельно с лезвием бритвы. Заполнить буфер лоток с дистиллированной водой при комнатной температуре, пока образцы не полностью погружен в воду.
- Вырежьте лезвие пополам и затем обрезать концы с крепкими ножницами так, чтобы лезвие остается совершенно плоская. Прикрепите одну половину предварительно выполн емого надреза лезвием бритвы на держатель ножа.
- Установите угол на держателе ножа до 84 °, скорость до 0,90 мм / с (положение 8 на Vibratome) и частотой до 50 Гц (положение 5 на Vibratome). Cut секции толщиной 100 мкм. Используйте режим непрерывной. НЕТTE: Эта толщина была выбрана, чтобы обеспечить, что ткань может выдерживать различные процедуры кислот и оснований, используемых в некоторых протоколов окрашивания. Установите окно для секционирования и позволяют 15-20 мин на непрерывном режиме для Vibratome к разделу агарозы блока примерно 1,2 см.
- Соберите разделы, используя одноразовые пластиковые пипетки во время секционирования в буферной лотка. Альтернативно, участки могут быть переданы из буфера лотка в стеклянном стакане и затем к четкому чашку Петри. Трансфер несколько разделов с 2,0 мл микропробирок. Примечание: Образцы собраны из чашку Петри, потому что это легче увидеть разделы о чистом фоне, и, так как буфер лоток может быть нацелены на ближайшие образца.
- Секции могут быть сохранены в 50 мл пробирку или собирается и хранится в 1,5 до 2 мл микроцентрифужных пробирках при температуре 4 ° С в течение от 30 до 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение разделы на более длительный срок может привести к ухудшению качества изображения.
3. Микроскоп и Настройка камеры для работы с изображениями
- Отрегулируйте освещение Келера на микроскопом. Выберите цель. Сосредоточьтесь на образце в первую очередь. Принесите интенсивность света до половины или ниже. Закройте полевую диафрагму (FD) и диафрагму (AP) или довести его до минимально возможного обстановке на этой конкретной цели.
- Чем выше увеличение, тем больше будет кольцо. С помощью ручки фокусировки конденсатора сосредоточиться на местах диафрагмы так резко, как это возможно.
- Медленно довести образ полевых радужной оболочки (с шестигранной форме небольшой кольцевых) к центру с помощью конденсатора центрирующие ручки (штифтообразных винта, окружающий конденсатор). Медленно увеличивайте диафрагма (FD), такие, что полевые ирис достигает края. Остановить повышение ФО сразу после поле ирис прошло края.
- Медленно увеличивайте диафрагму (AP), чтобы настроить контрастность. Отрегулируйте интенсивность света по мере необходимости. ПРИМЕЧАНИЕ: Келер освещенности должна быть скорректирована для каждого оЕЛЬ, каждый экспериментальный день. Обратите внимание на цифры, полученные после корректировки в течение дня. Эти цифры будут использоваться повторно каждый раз, когда цели включении туда и обратно за этот день.
- Отрегулируйте диафрагму, интенсивности, времени экспозиции, усиления и фильтров, как описано в таблице 1. Эта информация должна использоваться только в качестве ориентира.
- Используйте цифровую камеру высокого разрешения с большим форматом интерлайн CCD чип, без механического затвора, чтобы захватить флуоресцентные изображения; и с высоким разрешением, высокоскоростная камера для ярко-полевых изображений.
- Процесс слайды, используя стандартное программное обеспечение. Загрузите программное обеспечение. Нажмите "приобрести" и "Настройки камеры / доска", затем выберите камеру для использования. Нажмите "OK". Затем нажмите кнопку "Получить", а затем "вкладке Цвет." Под "вкладке Цвет" выберите "метод Байера" "Средняя четырех." Добавить предложенный усиления (красный, зеленый, синий) сюдам Таблица 1. Выберите вкладку "Установить сохранить" и нажмите на каталог, в котором изображения будут храниться. Установить "Выдержка" от предложений в таблице 1. Установить "Биннинг" на "1" и "Живая биннинга" на "1". Фокус на интересующей области, а затем нажмите "Сохранить в прямом эфире".
- Выходные изображения на ПО камеры в формате "TIF". Анализ изображений для гистохимии из типов клеток. Используйте стандартный компьютер программное обеспечение для использования в нижнем течении презентации и публикации.
4. Ультрафиолетовое и светлого поля изображений
- С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки так, что секции могут быть пипеткой легко. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под УФ-светом или светлого поля освещения.
5. Флороглюцин-HCl (Визнер) Окрашивание 12
- Растворите 0,3 г флороглюцин в 10 мл абсолютного этанола подготовить 3%-ный раствор флороглюцин. Смешайте одну объем концентрированной соляной кислоты (37 N) до двух объемов 3% флороглюцин в этаноле; это решение флороглюцин-HCl (Ph-HCl) или Wiesner пятно. Примечание: Это решение должно быть сделано свежий в день окрашивания и не могут быть сохранены, так как решение будет деградировать с течением времени и окрашивание станет неэффективным. ВНИМАНИЕ: HCl оказывает сильное коррозионное воздействие, поэтому будьте очень осторожны при обращении с пятно Ph-HCl.
- Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл раствора Ph-HCl в пробирку, содержащую секции и крышка его немедленно, поскольку HCl в пятне Ph-HCl оказывает сильное коррозионное воздействие. Аккуратно переместите трубку заверить, что все разделы окрашиваются. Альтернативой этому шагу должен держать трубки колпачок открытым, так что решение Ph-HCl можно пипеткой вверх и вниз, предпочтительно, не нарушая секTIONS. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в кончика пипетки, так как это может привести к повреждению этих разделов.
- С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения. ПРИМЕЧАНИЕ: Решение Ph-HCl высыхает через 5-10 мин, в результате чего ухудшение образцов. Таким образом, изображения должен быть завершен в течение этого периода времени.
6. Maule Окрашивание 13,14
- Растворить 0,2 г перманганата калия в 40 мл дистиллированной воды с получением 0,5%-ный раствор перманганата калия. Хранить в темной бутылке при комнатной температуре в течение максимум 7 дней.
- Приготовьте 3,7%-ный раствор HCl добавлением 1 мл концентрированной соляной кислоты (37 N) до 9 мл дистиллированной воды (1:10). Подготовьте свежий 3,7% раствор HCl надень эксперимента. Убедитесь, что исходный раствор 37 N HCl используется не слишком стар. Концентрированный раствор гидроксида аммония (14,8 M) следует хранить при 4 ° С для предотвращения молярность насыщенного раствора из уменьшается.
- Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,5% раствора перманганата калия в пробирку, содержащую секции.
- Внесите 0,5% раствор перманганата калия вверх и вниз мягко, предпочтительно, не нарушая разделы. Инкубировать в течение 2 мин и повторить пипетки. Пусть микроцентрифужных трубки стоят, пока все секции не успокоиться. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как разделы могут быть повреждены. Это может быть трудно понять, разделы стволовые как решение темно, так что держите трубку с секциях по пробирок и дать им возможность поселиться в течение 2 мин.
- Использование 1 мл пипетки, вытянуть 700 мкл 0,5% раствора перманганата калия.Добавить 700 мкл дистиллированной водой до промыть раствором перманганата калия. Повторите 3-4x или пока раствор вода не остается ясным.
- Откажитесь от воды. Быстро добавить 1 мл 3%-ной HCl, пока темно-коричневый цвет не выходит из секциях. Это может произойти в течение 3-5 мин, или может потребоваться 2 промыли 5 мин каждый. Пипетки из все 3%-ного раствора HCl и сразу перейти к следующему шагу.
- Добавить 1 мл концентрированного раствора гидроксида аммония. С помощью 1 мл пипетки с разрезом наконечника таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения. ВНИМАНИЕ: Поскольку гидроксид аммония чрезвычайно коррозионные, он требует дополнительную заботу и внимание, чтобы не вызывать коррозию на столик микроскопа или объектива. ПРИМЕЧАНИЕ: Пары гидроксид аммония может туман покровное, что делает его трудно наблюдать образец. Поэтому будьте очень осторожны, прежде чем добавлять покровное. Решение высыхает через 5-10 мин, так что изображения должен быть завершен в течение этого периода времени.
7. Окрашиванием Конго красным 11,15
- Растворить 0,5 г конго красный в 100 мл дистиллированной водой до 0,5% конго красный раствор.
- Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,5% конго красный раствор в трубу. Аккуратно пипетки 0,5% Конго красного раствора вверх и вниз, не нарушая разделы. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы.
- Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин и повторить пипетки. Последующие с другой 3 мин инкубации при комнатной температуре.
- Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,5% конго красного раствора. Добавить 700 мкл дистиллированной воды промыть Конго красный раствор. Повторяйте мыть 3-4x до промывочного раствораЯсно.
- С помощью 1 мл пипетки с разрезом наконечника таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровное. Соблюдайте образцы на предметное стекло при возбуждении синего света с помощью фильтра с полосовой 560/40. ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните разделы в воде долгое время до микроскопического анализа, так как вода будет размывать конго красным в 10-30 мин.
8. Calcofluor Белый Окрашивание 9
- Растворить 0,02 г флуоресцентного отбеливателя 28 (Calcofluor белого M2R) в 10 мл дистиллированной воды для получения 0,2% маточного раствора. 0,2% раствор можно хранить в течение шести месяцев в темной бутылке при 4 ° С. Подготовить рабочий раствор 0,02% путем разбавления 0,2% исходный раствор 10x дистиллированной водой.
- Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить к трубе 1 мл 0,02% calcofluor белый решение. Аккуратно пипетки белый решение 0,02% Calcofluor вверх и вниз. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы.
- Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и повторить пипетки. Инкубировать в разделе течение еще 3 мин при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешить секции оседать на дне пробирки, чтобы сделать его проще пипетки из раствора, не повреждая разделы.
- Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,02% Calcofluor белого раствора и добавить 700 мкл дистиллированной воды; подождите 5 мин промыть белую решение Calcofluor. Повторите промыть 3-4x. Используйте 1 мл пипетки с разрезом пипетки в таких, как образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений.
- Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровным. Соблюдайте разделы под ультрафиолетовым светом.
9. Толуидин Bluе О Окрашивание 16,17
- Растворите 0,02 г толуидинового синий O в 100 мл дистиллированной воды, чтобы подготовить 0.02% раствора. Примечание: толуидин раствор синий O могут быть сохранены в течение двух недель в темном флаконе при комнатной температуре.
- Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,02% толуидиновым синим O раствора к трубе. Аккуратно пипетки 0,02% толуидинового решение синий O вверх и вниз. Затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и повторить пипетирования один раз. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы. Пусть микроцентрифужных трубки стоять на месте, пока разделы не успокоиться. Это может быть трудно понять, как решение темно, так держать трубку, содержащий разделы, посвященные пробирок и дать им возможность поселиться в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,02% толуидиновым решения синий вывода. Добавить 700 мкл дистиллированной водой до промыть толуидинового синий O зольution. Повторите 3-4x или пока промывочного раствора не понятно. С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки таким образом, что секции могут быть легко пипеткой из не повреждая их.
- Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения.
- Отрегулируйте освещение Келера на микроскопом. Выберите цель. Сосредоточьтесь на образце в первую очередь. Принесите интенсивность света до половины или ниже. Закройте полевую диафрагму (FD) и диафрагму (AP) или довести его до минимально возможного обстановке на этой конкретной цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стволовые вложения и секционирования:
Использование самодельных пластиковых форм для встраивания стебли в 7% агарозном оказалось быстро и легко (рис. 1). Эти две части (А и В; рис. 1) из встроенной системы флакона сделать его простым, чтобы легко освободить шток, встроенный в агарозы как агарозы не прилипает к флакона частей, которые являются инертными, поддерживать чистоту. Ампулы могут быть использованы несколько раз в течение многих лет. Удобство хранения встроенного стебель также делает следующие шаги легче. В целях экономии когда-то, похоже встроен стебли могут быть сгруппированы (до 3) на одном секционирования пластины для секционирования.
Наблюдение ароматики при УФ:
Срезы стволовые были установлены в дистиллированной воде на предметных стеклах с и наблюдали под УФ-светом. Ароматические соединения, в том числе лигнина в клетках, могут быть визуализированы их флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Ксилема (XY) и межпучковых волокна (Fi)показал аутофлюоресценция под ультрафиолетовым освещением, но не в сердцевине (Pi) и коры или эпидермиса (EP) (рис. 2), так как лигнин, ароматический полимер, осаждается в процессе биосинтеза вторичных клеточной стенки. В некоторых случаях, когда растения накапливают значительные количества ароматических соединений в их вакуолей (например, антоцианов), флуоресценции можно наблюдать в корковых клеток (данные не показаны). Стволовые сечения были проанализированы при 5X, 10X, 20X, и 40-кратном увеличении (рис. 2 Панели A, B, C, и D - E, соответственно) лучше визуализировать клеточной стенки ароматическую распределение по стеблю.
Наблюдение лигнина в стволовых срезах, окрашенных флороглюцин и Maule пятен:
Ксилемы состоит из сосудов и волокон и волокон межпучковых были единственными элементами штока, что окрашивали по лигнина пятен (флороглюцин и MAULE) С помощью дикого типа раздел стволовых образец. Флороглюцин пятно реагирует с коричный конечных групп лигнина дать розовый или цвета фуксии 4 (рис. 3). Как заметил в УФ-подсветкой, фуксия окраска наблюдается в ксилемы и межпучковых волокон, но отсутствует в сердцевине и коре или эпидермиса (рис. 3). Стволовые сечения были проанализированы при 5X, 10X, 20X, и 40-кратном увеличении (рис. 3 Панели A, B, C, и D - E, соответственно) лучше визуализировать распределение флороглюцин пятен через шток и дифференцировать основные ткани; ксилемы и межпучковых волокна; сердцевина и кора; и эпидермис. Обычно интенсивность цвета коррелирует с уровнем одревеснения в качественном образом - кроме случаев, когда анализировали мутант или трансгенных аномально обогащены коричный альдегид-звеньев (например CAD мутантных) <вир> 14. Мол пятно специфичен для обнаружения лигнина единиц syringyl в ксилемы и межпучковых волокон. Красный окраска указывает на присутствие syringyl лигнина единиц в элементах лигнина (рис. 4) 18. Однако ярче красное окрашивание наблюдается в волокнах по сравнению с ксилемы тканей, позволяет предположить, что волокна содержат более высокий уровень S лигнина в то время как ксилемы более обогащен G единиц. Как заметил после окрашивания флороглюцин, красное окрашивание наблюдается в ксилемы и межпучковых волокон, но отсутствует в сердцевине и коре или эпидермиса (рис. 4). Он также коррелирует с распределением лигнина наблюдается в УФ (рис. 2) и показывает, что syringyl единиц присутствуют в каждой одревесневших тканей этого образца стволовых. Стволовые сечения были проанализированы в рамках 5X, 10X, 20X и 40X увеличение (рис. 2 Панели А, В, С иD - E, соответственно), чтобы лучше представить себе Maule распределение пятен по всему стебля и дифференцировать основные ткани: ксилемы и межпучковых волокна, пробковые и коры и эпидермиса. Важно отметить, что количество и распределение syringyl единиц между одревесневших тканей варьировать в зависимости от возраста штока и может отсутствовать в молодом штока (данные не показаны).
Наблюдение стволовых срезах, окрашенных Calcofluor Уайт и Конго красные пятна:
Calcofluor белые пятна целлюлозы, мозолистый и другие незамещенные или слабо замещенных β-глюканы; в то время как конго красный пятна непосредственно к β-(1 → 4)-глюканы и особенно с целлюлозой. Стволовые срезах, окрашенных Calcofluor белый наблюдались в УФ-свете 6-9. Конго красный окрашенных разделы наблюдались под сине-возбуждении светом с использованием фильтра с полосовой 560/40. Оба Calcofluor белый и конго красный окрашенных эпидермис, кору и сердцевину; йявляется то, потому что все эти ткани содержат целлюлозу в качестве основного полисахарида полимера в их клеточных стенок (рис. 5 и рис 6, соответственно). В отличие от Calcofluor белые, Конго красный окрашенных полисахариды лучше в ксилемы и межпучковых волокон и, кажется, меньше влияет присутствие лигнина (рис. 5 и Рисунок 6) 10,11. Стволовые сечения были проанализированы в рамках 5X, 10X, 20X, 40X и увеличение (Панели А, В, С и DE соответственно рисунков 5 и 6), чтобы лучше представить себе Calcofluor белых и Конго распределений красное пятно по стебля и основным тканей (ксилемы и межпучковых волокна, пробковые и коры, и эпидермис).
Наблюдение стволовых разделах толуидиновым Голубой O:
Толуидиновым синим O классифицируется как полихроматического красителя, поскольку он вступает в реакцию с различными химическими компонентами клеток по-разному и приводитразноцветной образец (рис. 7). Цвета, созданные может предоставить информацию о характере клетки и его стенок. Толуидин синий O представляет собой катионный краситель, который связывается с отрицательно заряженными группами 5. Водный раствор этого красителя синего цвета, но разных цветов генерируются, когда красителем связывается с различными анионными группами в клеточной 6,9. Например, розовато-фиолетовый цвет появится, когда краситель вступает в реакцию с карбоксилированных полисахаридов, таких как пектиновой кислоты; зеленый, зелено-голубой или ярко-синий с полиароматических веществ, таких как лигнин и дубильные вещества; и красноватый или зеленоватый оттенок синего цвета с нуклеиновыми кислотами. Толуидин синий О стволовых сечений показали, что ксилемы и межпучковых волокна одревесневшие, так как они показывают, зеленоватый синий или синюю окраску (рис. 7, Панель C), который находится в согласии с УФ и Ph-HCl окрашивания наблюдений (рис. 2 и 3). В противоположность этому, сердцевина и коры и эпидермиса ткани показывают, зеленовато-голубой или синюю окраску, потому что, хотя они и не одревесневшие, они содержат некоторые пектиновые полимеры в их клеточных стенок. Стволовые сечения были проанализированы при 5X, 10X, 20X, и 40-кратном увеличении (рис. 7 Панели A, B, C, и D - E, соответственно) лучше визуализировать толуидиновым синим O распределение пятен через шток и дифференцировать основные ткани .
. Рисунок 1 Домашнее формы для встраивания стебли На левой стороне.; верхняя часть 2 мл завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных (часть А) и нижней от 0,6 трубки микроцентрифужных мл (часть В). На правой стороне; Парафильмом проведения двух частей; А и В с образованием конечного формы.
Рисунок 2. УФ Флуоресценция А. THALIANA стволовые сечения. поперечных срезов дикого типа А. THALIANA стволовых под УФ-света флуоресценции, показывая присутствие ароматических соединений, в том числе лигнина, только в стенах межпучковых волокон и клеток ксилемы (А - Е). Позиции эпидермиса и коры (EP), межпучковых волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (XY) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Рисунок 3. Флороглюцин-HCl окрашивание А. THALIANA стволовые сечения. Окрашивание Флороглюцин-HCl (розовый или фуксия цвет) дикого типа А. THALIANA стволовых сечение, показывающее нормальное отложение лигнина в стенках межпучковых волокон и клеток ксилемы (А - Е). Позиции эпидермиса и коры (EP), межпучковых волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (XY) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Рисунок 4. Maule окрашивание А. THALIANA стволовые сечения. Maule окрашивания (красный цвет) дикого типа А. THALIANA </ EM> стволовых сечение, показывающее нормальную осаждения лигнина в стенках межпучковых волокон и клеток ксилемы (A - E). Позиции эпидермиса и коры (EP), межпучковых волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (XY) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Рисунок 5. Calcofluor белый окрашивание А. THALIANA стволовые сечения. Calcofluor белый окрашивание дикого типа А. THALIANA стволовых сечение, показывающее осаждение целлюлозы в клеточных стенках клеток эпидермиса, коры, сердцевины, межпучковых волокон и ксилемы (A - E). PositiДополнения эпидермиса и коры (Ер), межпучковых волокна (Fi), сердцевина (Pi) и ксилемы (Ху) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Рисунок 6. Окрашиванием Конго красным А. THALIANA стволовых сечения. окрашиванием Конго красным дикого типа А. THALIANA стволовых сечение, показывающее осаждение целлюлозы в клеточных стенках клеток эпидермиса, коры, сердцевины, межпучковых волокон и ксилемы (A - E). Позиции эпидермиса и коры (EP), межпучковых волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (XY) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель В Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Рисунок 7. Толуидин синий О окрашивание А. THALIANA стволовые сечения. Толуидин синий О окрашивание дикого типа А. THALIANA стволовых сечение, показывающее нормальное отложение лигнина в стенках межпучковых волокон и клеток ксилемы (А - Е). Позиции эпидермиса и коры (EP), межпучковых волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (XY) указаны. Увеличения: Панель A: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и Е: 40X. Bar = 100 мкм.
Таблица 1. Микроскоп и настройки камеры для работы с изображениями. Руководящие принципы для работы с флуоресцентных фильтров и изображений светлого поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разделы стволовые А. THALIANA широко используются для изучения организации клеток на вторичном клеточной стенки и качественно изучить различия между дикого типа и трансгенных растений. Обычно используемые методы секционирования образцы являются прямыми рука резки; или когда образцы встроены в агарозном или фиксатора, секционирования может быть сделано с Vibratome или микротоме. В отличие от ручной резки, последние два позволяют уменьшить риск получения неточных различий между образцами, которые были бы просто, вызванных плохой подготовки образца, вызванной толщины различий между образцами и неровных поверхностях. Все эти методы имеют свои плюсы и минусы. Мы выбрали встраивания в агарозы, а затем секционирования с использованием Vibratome, и сделал это по следующим причинам: легкость встраивания и время, проведенное в использовании агарозы устраняет необходимость в сложной обработке свежей ткани. Кроме того, наши домашние формы являются легко и дешево сделать, может держать тыс.э Стебель прямой, могут быть использованы в течение многих лет, и может помочь в легкой выпуска образцов, не делая беспорядок. Лучший способ, чтобы растворить с большим содержанием агарозы и получить гомогенный раствор (полного растворения 7 г агарозы в 100 мл без образования коренастый гранулы) является в автоклаве это или к микроволновой печи его по самой низкой интенсивности. Важно, чтобы сократить штока ткани свежий, или в качестве альтернативы, чтобы сохранить его в пластине помещают на лед, содержащего фильтровальную бумагу смоченный водой, чтобы предотвратить дегидратацию ткани и деформации. Хранение шток на срок более 30 минут без высокой влажности может привести стебель высохнуть. Температура агарозы непосредственно перед шток встроенного должна быть около 50 ° С. Очень важно, чтобы проверить на наличие пузырьков воздуха после агарозы была выливают в пробирку, потому что воздушные пузырьки вызывают пробелы в пресс-форме и, следовательно, секционирование будет неравномерным. Воздушные пузырьки могут быть быстро удалены путем размещения раствор под вакуумом до заливкиэто. Шток должен быть помещен в агарозы, когда он по-прежнему мягкие и не теплее, чем 50 ° С. Тепло может повредить образец в Сморщенность стебель и уничтожит морфологии клеток. Если агарозном слишком холодное шток не будет проникать через агарозы и вложение будет невозможно. После агарозном вложения, образцы стволовых можно хранить при температуре 4 ° С до одной недели.
Использование Vibratome вместо вручную секционирования урожайности точно вырезать образцы и лучшее качество изображения. Все инструкции по технике безопасности должны быть внимательно прочитать и затем при использовании Vibratome. Важно убедиться, что образец диска чистая и сухая, чтобы клей ткани удерживать образец сильно в месте, чтобы он не отвалится во время секционирования. Толщина образцов указывается выдерживать сложные кислоты и основания лечения во время процедуры окрашивания. Лезвие бритвы, используемый в Vibratome должно быть совершенно плоской чтобы гарантировать, что раздел разрезают эВenly. Секционирование занимает около 20 мин на образце; в целях экономии времени, подобные образцы можно разделить на группы на одном образца пластины. Во секционирования, секции передаются из буферной лоток в небольшой чашке Петри, чтобы сделать разделы легче увидеть на фоне ясно и освободить буферную лоток на ближайшие образца. Секции могут быть немедленно использованы для последующих процедур окрашивания или сохранены для последующего использования. Аликвоты разделы стволовые до 2,0 мл микропробирок помогает в грунтования для процедур окрашивания. Создание правильных настроек и регулировок на камере и микроскопом очень важное значение для достижения высокого качества изображения. Регулировка подсветки Kohler является одним из наиболее важных шагов в использовании микроскопа. Настройки для диафрагмы и интенсивности света, как описано в разделе методов, предназначены только в качестве ориентира. Они могут должны быть изменены в зависимости от микроскопа и камеры используется. Мы использовали высокое разрешениецифровая камера с большим чипом формат интерлайн CCD и без механического затвора для УФ изображений, Calcofluor белый и окрашиванием Конго красным; и с высоким разрешением и высокоскоростной цветная камера для ярко-полевых изображений Maule, флороглюцин и толуидиновым окрашивания синий вывода. Были проанализированы, обработаны и собраны с использованием стандартного программного обеспечения визуализации изображения.
Флороглюцин является наиболее часто используемым пятно для определения лигнина; это не правда, лигнин пятно, как это окрашивает только коричный концевые группы. Флороглюцин пятно, также известный как Вайснер пятна, дает характерный вишневый розовый или фуксии цвета в ксилемы и межпучковых волокон, где эти альдегидные группы присутствуют 4. Интенсивность розового цвета изменяется в зависимости от степени одревеснения. Хотя тонкие различия труднее наблюдать, это легко обнаружить различия между дикого типа и мутантных участков стволовых, которые имеют различия в их содержанием лигнина 19. Это также EASу наблюдать различия между моложе (к верхушке стебля) и старше (основании стебля) тканей, потому что уровни одревеснения между такими тканей меняться. Обычно в дикого типа стебля, эпидермис кора и сердцевина не содержат cinnamaldehydes (при этом не получить цветные), если нет внематочная одревеснение 20. Мол пятно, с другой стороны, является специфическим к syringyl лигнина единиц и могут быть использованы для дифференциации различных обогащения лигнина в S или G единиц (например, волокна по сравнению с ксилемы тканей) 14,18. Перманганат калия и соляной кислоты действуют на syringyl ядра S единицы в лигнина с образованием methoxycatechol, а затем метокси-о-хинонов следующие реакции с гидроксидом аммония. Мол пятно является хорошим показателем для дифференциации мутантов, которые не имеют или широко истощенных в S единиц лигнина (например в А. THALIANA F5h мутантов и общих голосеменных растений), Maule дает желто-коричневое окрашивание инстEAD красного как в древесине и склеренхимы 21. По той же причине, окрашивание Мол может быть использован, чтобы дифференцировать покрытосеменные, которые в основном содержат S лигнина из голосеменных, которые обычно не хватает S блок 18. Потому что сильная кислота и основание используют во флороглюцин и методы окрашивания Maule соответственно, некоторые экспериментальные шаги должны быть выполнены с осторожностью. Оба концентрированной соляной кислоты и гидроксида аммония сильные коррозионные; они могут ухудшить столик микроскопа и объектива, если слайды, содержащие окрашенные образцы Ph-HCl и Maule не обрабатываются должным образом. Они также могут высыхать быстро, в течение 5-10 мин, в результате чего образцы ухудшаться, так что изображения должно быть сделано быстро. Толуидин синий вывода полихроматичным пятна и пятна различных компонентов клеточной стенки в разные цвета, как он реагирует с различными химическими компонентами клеточных стенок разному, производя разноцветные образца. Цвета, созданные может Providе информацию о характере клетки. Толуидин синий O также катионный краситель, который связывается с отрицательно заряженными группами 5,6. Водный раствор этого красителя синего цвета, но разных цветов генерируются, когда красителем связывается с различными анионными группами в клетке. Например, цвета розовато-фиолетовый краситель, когда вступает в реакцию с карбоксилированных полисахаридов, таких как пектин; зеленый, зелено-голубой или ярко-синий с ароматическими веществами, такими как лигнина и дубильных веществ; и красноватый или зеленоватый оттенок синего цвета с нуклеиновыми кислотами. Окрашивание проста и может длиться в течение двух дней.
Calcofluor белые пятна целлюлозы, мозолистый и другие незамещенные или слабо замещенных β-глюкан 6-9, и конго красный пятна непосредственно к β-(1 → 4)-глюканы и особенно с целлюлозой 8,10,11. Calcofluor белых пятен блестяще эпидермис, кора и сердцевина, но, что блеск значительно снижается в ксилемы и межпучковых волокон. Есть два ржно объяснения пониженной флуоресценции Calcofluor белый в значительной степени одревесневших тканей; один приписывает его присутствии лигнина, который, в свою очередь снижает способность Calcofluor белый должным образом диффундировать через полисахаридов. Второе объяснение указывает на частичное тушения флуоресценции, испускаемого Calcofluor белого рады в УФ. В отличие от Calcofluor белый, окрашиванием Конго красным кажется менее влияет присутствие лигнина. Это может быть связано с различием в свойствах флуоресценции между Calcofluor белый и Конго красный; лучше диффузии возможность конго красного через одревесневших тканей, чем Calcofluor белый; или небольшая разница в полисахаридных обязательных свойств 22. Важно отметить, что срезах, окрашенных конго красный не следует хранить слишком долго, прежде изображений, потому что конго красный имеет тенденцию быть смыты водой.
Хотя гистохимическое окрашивание не является ни количественноени абсолютно убедительным, он может выявить через визуальные сигналы большой объем информации о важных черт, таких как целостности тканей или ненормального отложения клеточной стенки и одревеснения. Методы окрашивания, описанные выше, легко выполнить и применимы для критических элементов в клеточной стенки растений, таких как лигнин и целлюлозу. В противоположность этому, иммунофлуоресценции с использованием специфических антисывороток и моноклональных антител требуется для обнаружения различных компонентов гемицеллюлозы и пектина. Этот доклад призван служить в качестве грунтовки для начинающих в области среднего окрашивания клеточной стенки, которые используют A. THALIANA как их модельной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Сабин Рассела за помощью редактирования. Эта работа была частью DOE Совместной BioEnergy института (http://www.jbei.org) при поддержке Департамента энергетики США, Управление по науке, Управления биологических и экологических исследований, с помощью контракта DE-AC02-05CH11231 между Лоуренса Беркли Национальная лаборатория и Министерство энергетики США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
