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Biology

Histochemische Färbung von Published: May 13, 2014 doi: 10.3791/51381
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Introduction

Die Pflanzenzellwand hält eine Fülle von Informationen innerhalb seiner verschiedenen Komponenten: Lignin, Cellulose, Hemicellulose (Xylan, Glucuronoxylan, Xyloglukan, Arabinoxylans, gemischte Verknüpfung Glucan oder Glucomannan) und Pektin. Die histologische Techniken liefern wichtige visuelle Hinweise in Studium Unterschiede innerhalb der sekundären Zellwände auf organisatorischer und zellulärer Ebene. Verschiedene histologische Techniken wurden entwickelt und kann in der Literatur gefunden werden, aber diese Techniken kann schwierig und zeitaufwendig für Anfänger sein, weil sehr ausführliche Protokolle mit einfachen visuellen Anweisungen sind selten, wenn überhaupt vorhanden. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien zur histologischen Färbung Techniken bieten, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.

Unterteilen des Schaftgewebe ist der erste Schritt bei der Visualisierung von Zellwänden und Zellformen. Obwohl von Hand geschnitten Abschnitte sind kostengünstig und weniger Zeit für die Vorbereitung, die Verwendung eines Vibratom bietet Kontinuität undliefert qualitativ hochwertige Bilder. Mit einem Vibratom ermöglicht die Herstellung besserer Datenqualität durch die Erzeugung auch Abschnitte mit der gleichen Stärke, die hilft, scharfe Bilder und reduziert das Risiko der Herstellung ungenau Unterschiede zwischen den Proben, die einfach von einer schlechten Probenvorbereitung verursacht werden würde. Mit Harze an die frische Proben zu beheben, kann eine Herausforderung für Anfänger und kann immer noch zeitaufwändig sein, selbst für Experten, wenn eine Analyse muss schnell durchgeführt werden. Darüber hinaus wird es unmöglich, irgendeine biologische Aktivität der Probe zu messen, wenn es in ein Harz eingebettet sind. Eine einfache Technik, die Agarose und eine hausgemachte Form beschäftigt ist hilfreich für die Einbettung von Stammzellen Gewebe, und es kann auch in anderen Anwendungen Dissektion der Weichteile erfordern, genutzt werden. Im Vergleich zu Proben in Harz eingebettet, hat dieses Verfahren den Vorteil, dass das Gewebe gesund und reduzierendem Probenmanipulation. Schneiden Gewebe über einen Vibratoms ist sehr präzise und homogen erzeugtschiedenen Abschnitten, die je nach dem Ziel der Studie kann dann mit verschiedenen Färbetechniken verwendet werden.

Die einfachsten Methoden, um Lignin und andere Aromaten visualisieren beschäftigen ultraviolettem (UV) Licht. Anregung der aromatischen Moleküle auf durch UV-Licht ist eine alte Technik, aber es ist immer noch eine der schnellsten Ansätze zur Visualisierung von Lignin. Doch tatsächlich ist die UV-Visualisierung nicht ideal für die Erkennung Lignin, weil UV-Licht werden andere Aromaten zu erregen. 1-3: Lignin besteht hauptsächlich aus drei Bausteinen, die Monolignole (Coniferylalkohol, Sinapylalkohol und p-Cumarylalkohol hydroxycinnamyl Alkohole) gemacht. Phloroglucin Flecken können Hinweise auf den Umfang der in das Xylem, Fasern und Luftröhrengewebe 4 vorhanden Zimtaldehyde bereitzustellen. Phloroglucinol ist ein guter Indikator für die allgemeine Zimtaldehyde und kann zwischen Zimtaldehyde und anderen Aromaten unterscheiden. Die Sinapylalkohol Monomere nachgewiesen werden kannund differenziert durch die Verwendung Maule Fleck. Toluidinblau O eine polychromatische Farbstoff und hat die Fähigkeit, verschiedene Elemente der Zellwand in verschiedenen Farben färben daher 5,6. Der primäre Einsatz von Toluidinblau O ist es, Pektin und Lignin 5,6 zu erkennen. Der Vorteil der Verwendung von Toluidinblau O ist, dass viele Elemente der Zellwand kann in einem einzigen Schritt dargestellt werden. Sowohl Calcofluor weiß und Kongorot sind leicht zu verarbeiten und kann verwendet werden, um Zellulose zu visualisieren. Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierten oder schwach substituierten β-Glucane 6-9, während Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere zu Cellulose 10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien für die Verwendung der oben genannten Färbetechniken, um qualitativ hochwertige Bilder von A zu erhalten bieten thaliana stammt.

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Protocol

1. Stem Einbetten

  1. Machen Sie einen 7% igen Lösung in Wasser (7 g Elektrophorese-Grade Agarose in 100 ml destilliertem Wasser). Ige Agarose durch Autoklavieren für 20 min oder durch Mikrowellenbehandlung für 20 min bei geringsten Intensität (z. B. 10% Intensität eines 1250 Watt Mikrowelle).
  2. Bereiten Sie eine hausgemachte Form für die Einbettung der Stiele mit Kunststofffläschchen.
    1. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die konischen Boden einer 2 ml mit Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen (Teil A). Mit einer Spritzennadel, durchstoßen eine Bohrung in der Rohrkappe geringfügig größer als der Durchmesser des Schaftes eingebettet werden. Als nächstes schneiden 0,5 cm aus dem Boden eines 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Teil B).
    2. Hinzufügen des abgeschnittenen 0,5 cm Abschnitt der 0,6 ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die vorgeschnittenen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die beiden Teile mit Parafilm (Abbildung 1). HINWEIS: Der Boden der Röhre geschnitten wird, um die Entfernung der eingebetteten Probe zu erleichtern, nachdem die Agarose erstarrt. Ter Loch in der Kappe wird das Halten der Stamm stabil, wenn der Schaft in Agarose eingebettet unterstützen. Die Form wird dazu dienen, die Agarose halten und halten den Stamm gerade bei der Einbettung. Der Parafilm werden die beiden Teile A und B zu halten, bis die Agarose eingestellt ist und der Schaft eingebettet ist.
    3. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie ein Stammabschnitt aus dem Bereich der Zinsen, (zB Mitte der ersten Stamm Internodium). HINWEIS: Im Idealfall sollte der Stamm kurz vor der Zerstörung durch die Einbettung Austrocknung zu vermeiden geschnitten werden. Alternativ kann der Stiel vorübergehend in einer Platte, die ein Filterpapier mit Wasser benetzt gespeichert werden. Diese Platte kann auf Eis, bis bereit, um eingebettete Gewebe Austrocknung und Verformung zu verhindern platziert werden. Speichern Sie den Vorbau für Zeiträume von mehr als 30 Minuten ohne hohe Feuchtigkeit bewirkt, dass die Stammzellen zu trocknen.
  3. Schmelzen Sie die Agarose in der Mikrowelle bei niedriger Intensität. ACHTUNG: Die Flasche, die Agarose kann heiß sein. Verwenden Sie einen Handschuh zu holen die Flasche. Lassen Sie die geschmolzene Agarose stand bei Raumtemperatur (zwischen 20 ° C und 25 ° C) bis auf ca. 50 ° C abkühlt
  4. Langsam Pipette 5 ml der Agarose in die vorgefertigten Kunststoffform, um das Fläschchen zu füllen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Formen. Luftblasen werden Lücken in der Agarose-Form führen und wird nicht vollständig den Stamm Probe, die schließlich zu einer ungleichmäßigen Schneiden der Probenabschnitte führen zu decken.
    1. Lassen Sie die Agarose abkühlen für 30 bis 60 Sekunden halbfester zu werden. Testen Sie mit einem kleinen Zahnstocher, um sicherzustellen, dass es zu durchdringen und aufstehen, aber nicht schwimmen, in der Agarose kann. HINWEIS: Wenn der Schaft platziert, wenn die Agarose noch heiß es wird die Probe durch schrumpf den Schaft beschädigen, zerstören die Zellmorphologie.
    2. Setzen Sie den Stiel in diesem Agarose-Fläschchen gefüllt. Stellen Sie sicher, dass der Schaft bleibt gerade. Platzieren Sie die perforierte Kappe derart, daß die Spitze des Schafts von der Kappe gehalten wird. Schalten Sie den Schraubverschluss. Irgendwann mehr als einen Stamm (von einer einzigen Art) können embe seinin einer einzigen Ampulle dded; aber in diesem speziellen Fall, verwenden Sie nicht die Kappe. HINWEIS: Wenn die Schraubkappe eingeschaltet ist, wird der Stamm verdrillt.
  5. Belasse das Röhrchen bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für 10-30 min, bis es erstarrt.
  6. Entfernen Sie die Form durch vorsichtiges Schieben Sie es aus der Röhre. Öffnen Sie die Parafilm. Drücken Sie den unteren Teil B der Form vorsichtig mit dem Daumen auf die erstarrte Agarose aus Teil A auf einen Glasobjektträger zu lösen.
  7. Schneiden der Agarose eingebettete Stiel in drei etwa gleich große Stücke von 1,2 cm Länge. Schneiden Sie den Teil des Stammes, das war nicht in der Agarose und entsorgen.
    1. Bewahren Sie diese Stücke von Agarose mit der eingebetteten Stiele in luftdichten 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einer dunklen Box bei 4 ° C bis zu seiner Seite. Alternativ speichern die Röhrchen bei 4 ° C für maximal eine Woche. HINWEIS: Lagerung möglich ist, sondern der Versuchs muss sich bewusst sein, dass das eingebettete stammt noch am Leben und in Abhängigkeit des ExperimentsKönnte möglicherweise Artefakte eingeführt werden.

2. Stem Schnitte

  1. VORSICHT: Lesen Sie die Bedienungsanleitung sorgfältig Vibratoms und befolgen Sie alle Sicherheitshinweise.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist sauber und vollständig trocken (frei von festen oder flüssigen). Reinigen Sie die Probenscheibe mit einer Rasierklinge, um restliche Klebstoff von vor Experimenten zu entfernen und mit Wasser waschen. Dann trocknen Sie mit einem Papiertuch. HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass der Klebstoff funktioniert gut und bindet an die Agarose-Probe. Wenn dieser Schritt nicht richtig gemacht, ist es möglich, dass die Probe nicht an der Scheibe haften und wird später führen, dass die Probe von der Scheibe beim Schneiden fällt.
    1. Weichen Papiertücher verwenden, um die Feuchtigkeit aus dem Agarose-Block, der die Proben zu entfernen.
    2. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Gewebekleber auf dem Probenteller. Streak aus dem Klebstoff auf den Bereich in der Mitte der Platte mit der Spitze der Klebeflasche zu decken. Schnell Ortdie Agarose-Block, so daß die Proben entweder senkrecht oder parallel zu der Platte für Quer-oder Längsquerschnitt auf. Den Kleber, um die Probe auf die Probenscheibe bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für 10-30 min zu fixieren. HINWEIS: Dies ist eine zeitkritische Schritt.
  3. Befestigen Sie die Objektplatte an Ort und Stelle auf der Pufferwanne oder Trog. Die Block / s aus Agarose mit den Abschnitten sollten parallel mit der Rasierklinge sein. Füllen der Pufferschacht mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig eingetaucht.
  4. Schneiden Sie eine Rasierklinge in der Mitte und dann schneiden Sie die Enden mit einer stabilen Schere, so dass die Klinge bleibt völlig flach. Befestigen Sie die Hälfte der vorgeschnittenen Rasierklinge auf den Messerhalter.
    1. Den Winkel am Messerhalter um 84 °, wird die Geschwindigkeit auf 0,90 mm / sec (Position 8 auf der Vibratom) und die Frequenz auf 50 Hz (Position 5 auf der Vibratom). Schneiden Abschnitte von 100 um Dicke. Verwenden kontinuierlichen Modus. NOTE: Diese Dicke wurde gewählt, um zu gewährleisten, dass das Gewebe der verschiedenen Säure-und Basenbehandlung in einigen der Färbungsprotokolle verwendet zu widerstehen. Stellen Sie die Fenster zum Schneiden und lassen 15-20 min auf einer kontinuierlichen Modus für die Vibratom Abschnitt ein Agarose-Block von ca. 1,2 cm.
  5. Sammeln Sie die Abschnitte mit einem Einweg-Plastikpipette beim Schneiden in der Pufferwanne. Alternativ können die Abschnitte aus der Pufferwanne in ein Becherglas zu einem klaren Petrischale überführt werden und dann. Übertragen paar Abschnitte zu den 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Die Proben werden von einer Petrischale gesammelt, da es einfacher ist, die Abschnitte auf einem klaren Hintergrund zu sehen, und da der Puffer Fach kann für die nächsten Probe grundiert werden.
  6. Die Abschnitte können in einem 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C für 30 bis 60 min, gespeichert oder gesammelt und in 1,5 bis 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gelagert. HINWEIS: Speichern Sie die Abschnitte für einen längeren Zeitraum in einer schlechten Bildqualität führen.

    3. Mikroskop und Kamera-Einstellung für Imaging

    1. Stellen Sie die Köhler-Beleuchtung am Mikroskop. Wählen Sie ein Ziel. Konzentrieren Sie sich auf die Probe zuerst. Bringen Sie die Lichtintensität auf die Hälfte oder weniger. Schließen Sie die Feldblende (FD) und Blende (AP) oder bringen Sie es auf die niedrigste mögliche Einstellung an diesem Ziel.
      1. Je höher die Vergrößerung, desto größer wird der Ring sein. Verwenden Sie den Kondensator mit Schwerpunkt Knopf, um die Feldblende so scharf wie möglich zu konzentrieren.
      2. Langsam bringen das Bild der Feldblende (sechseckigen kleinen Ring) in der Mitte mit den Kondensator-Zentrierung Knöpfe (stiftförmigen Schrauben rund um den Kondensator). Steigern Sie langsam die Membran (FD), so dass die Feldblende den Rand erreicht. Stoppen Sie die Erhöhung der FD nur, nachdem das Feld Iris hat den Rand geleitet.
      3. Erhöhen Sie langsam die Öffnung (AP), um den Kontrast einzustellen. Passen Sie die Lichtintensität je nach Bedarf. HINWEIS: Köhler-Beleuchtung muss für jeden o eingestellt werdenIEL, jeder experimentellen Tag. Beachten Sie die nach der Einstellung für den Tag erhaltenen Zahlen. Diese Zahlen werden jedes Mal, dass Ziele hin und her für diesen besonderen Tag eingeschaltet wiederverwendet werden.
    2. Stellen Sie die Blende, Intensität, Belichtungszeit, Gain und Filter, wie in Tabelle 1 beschrieben. Diese Informationen sollten nur als Richtlinie verwendet werden.
    3. Verwenden Sie eine hochauflösende Digitalkamera mit einem Großformat-Interline-CCD-Chip ohne mechanischen Verschluss, um die Fluoreszenz Bilder zu erfassen; und eine hohe Auflösung, High-Speed-Kamera für Hellfeld-Bilder.
    4. Verarbeiten Sie die Folien mit Standardsoftware. Laden Sie die Software. Klicken Sie auf "Acquire" und "Set Kamera / Board", wählen Sie dann die Kamera verwendet werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "Erfassen", gefolgt von "Registerkarte Farbe." Unter "Registerkarte Farbe", wählen Sie "Bayer-Verfahren", gefolgt von "Durchschnitts vier." In den vorgeschlagenen Verstärkung (rot, grün, blau) herTabelle 1 m. Wählen Sie das Register "Einstellung speichern" und klicken Sie auf das Verzeichnis, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Stellen Sie "Belichtungszeit" von den Anregungen in Tabelle 1. Set "Binning" auf "1" und "Live-Binning" auf "1". Fokus auf die Region von Interesse und klicken Sie dann auf "Speichern zu Hause sind."
    5. Ausgabe von Bildern auf der Kamera-Software sind in der "TIF"-Format. Analysieren der Bilder für Histochemie der Zelltypen. Verwenden Sie Standard-Computer-Software für nachgelagerte Anwendungen von Präsentation und Veröffentlichung.

    4. Ultraviolett-und Hellfeld-Imaging

    1. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten, so dass die Abschnitte können leicht pipettiert werden. Pipette vorsichtig Abschnitte in der Spitze und auf einem Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter UV-Licht oder Hellfeldbeleuchtung.

    5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Färbung 12

    1. Lösen Sie 0,3 g Phloroglucin in 10 ml absolutem Ethanol, eine 3% Phloroglucin-Lösung herzustellen. Man mischt ein Volumen von konzentrierter HCl (37 N), um zwei Bände von 3% Phloroglucin in Ethanol; Diese Lösung ist Phloroglucin-HCl (pH-HCl) oder Wiesner Fleck. HINWEIS: Diese Lösung ist an die frische ist für den Tag der Färbung und kann nicht gespeichert werden, da die Lösung im Laufe der Zeit zersetzen und die Färbung wird unwirksam. ACHTUNG: HCl ist stark ätzend, also mit äußerster Vorsicht beim Umgang mit dem Ph-HCl Fleck.
    2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml des pH-HCl-Lösung zu der Röhre mit den Abschnitten und die Kappe sofort, weil die HCl in dem pH-HCl-Beize ist stark ätzend. Bewegen Sie vorsichtig das Rohr, um sicherzustellen, dass alle Abschnitte werden gefärbt. Eine Alternative zu diesem Schritt ist, den Tubenkappe offen halten, so daß der pH-HCl-Lösung auf und ab pipettiert werden, vorzugsweise ohne die störende sectionen. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze pipettiert werden, da dies die Abschnitte beschädigen.
      1. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettiert Abschnitte in der Spitze und auf einen Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung. HINWEIS: Der Ph-HCl-Lösung trocknet in 5-10 min, was eine Verschlechterung der Proben. Daher weist das Abbildungs ​​innerhalb dieser Zeit abgeschlossen werden.

    6. Mäule Färbung 13,14

    1. Man löst 0,2 g Kaliumpermanganat in 40 ml destilliertem Wasser zu einer 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung herzustellen. Speichern in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur für maximal 7 Tage.
      1. Bereiten Sie eine 3,7% HCl-Lösung durch Zugabe von 1 ml konzentrierter HCl (37 N) zu 9 ml destilliertem Wasser (1:10). Eine frische 3,7% HCl-Lösung auf dieTag des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die 37 N HCl-Stammlösung verwendet wird, ist nicht zu alt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid-Lösung (14,8 M) bei 4 ° C gelagert werden, um die Molarität der gesättigten Lösung abnimmt verhindern.
    2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,5% igen Kaliumpermanganatlösung mit dem Rohr, das die Abschnitte.
      1. Pipettieren Sie die 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung oben und unten vorsichtig, vorzugsweise ohne die Abschnitte zu stören. Inkubation für 2 Minuten und wiederholen Sie das Pipettieren. Lassen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen stehen, bis alle Abschnitte niederzulassen. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze pipettiert werden, da die Abschnitte können beschädigt werden. Es kann schwer sein, die Stielabschnitte zu sehen, wie die Lösung ist dunkel, so halten die Röhre mit den Abschnitten über Reagenzglasständer und es ihnen ermöglichen, für 2 min absetzen.
      2. Mit einer 1 ml Pipette, ziehen 700 ul 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung.In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Kaliumpermanganat-Lösung. Wiederholen Sie die 3-4x oder bis das Wasser klar bleibt Lösung.
      3. Entsorgen Sie das Wasser. Schnelles Hinzufügen von 1 ml 3% HCl, bis die dunkelbraune Farbe wird aus den Abschnitten ausgetragen. Dies kann in ca. 3-5 min passieren oder 2 Wäschen von jeweils 5 min benötigen. Pipettieren Sie sich die 3% HCl-Lösung und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
      4. 1 ml konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Spitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettiert Abschnitte in der Spitze und auf einen Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung. ACHTUNG: Wegen Ammoniak ist stark ätzend, extra Pflege und Aufmerksamkeit erfordert es zu vermeiden, dass Korrosion auf die Bühne des Mikroskops oder Objektiv. HINWEIS: Die Ammoniumhydroxid Dämpfe können das Deckglas beschlagen, so dass es schwierig ist, die Probe zu beobachten. Daher besonders vorsichtig sein, bevor das Deckglas. Die Lösung trocknet in 5-10 min, so dass innerhalb dieser Zeit abgeschlossen werden die Abbildungs ​​hat.

    7. Kongorotfärbung 11,15

    1. Lösen Sie 0,5 g Kongorot in 100 ml destilliertem Wasser zu einer 0,5% Kongorot Lösung herzustellen.
    2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,5% Kongorot-Lösung zu der Röhre. Pipette vorsichtig die 0,5% Kongorot-Lösung auf und ab, ohne die Abschnitte zu stören. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren.
      1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min und wiederholen den Pipettieren. Folgen mit einem anderen 3-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur.
      2. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul 0,5% Kongorot Lösung. In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Kongorot-Lösung. Wiederholen Sie den Wasch 3-4x, bis die Waschlösungist klar.
      3. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Spitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger, und sie mit Deckglas. Beachten Sie die Proben auf dem Objektträger unter Blaulicht-Anregung mit einem Filter mit einem Bandpass von 560/40 liegt. HINWEIS: die Abschnitte in Wasser für die lange vor der mikroskopischen Analyse nicht lagern, da das Wasser wird in 10-30 min auswaschen Kongorot.

    8. Calcofluor Weiß-Färbung 9

    1. Lösen 0,02 g Aufheller 28 (Calcofluor weiß M2R) in 10 ml destilliertem Wasser, um eine 0,2% ige Stammlösung herzustellen. Die 0,2% ige Lösung kann für sechs Monate in einer dunklen Flasche bei 4 ° C gelagert werden Bereiten Sie eine Arbeitslösung von 0,02% durch Verdünnen der Stammlösung 0,2% 10x mit destilliertem Wasser.
    2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In den Rohr 1 ml der 0,02% calcofluor weiße Lösung. Pipette vorsichtig die 0,02% Calcofluor weiße Lösung auf und ab. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren.
      1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min und wiederholen den Pipettieren. Inkubieren der Abschnitt für weitere 3 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte auf den Boden des Röhrchens absetzen, um es einfacher zu pipettieren, die Lösung ohne die Abschnitte.
      2. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul von 0,02% Calcofluor weiße Lösung und fügen Sie 700 ul destilliertem Wasser; 5 Minuten warten zum Ausspülen des Calcofluor weiße Lösung. Wiederholen Sie den Wasch 3-4x. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze Schnitt in so konzipiert, dass die Abschnitte können leicht pipettiert werden ohne Schaden.
      3. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger und bedecken sie mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter UV-Licht.

    9. Toluidine BluE O Färbung 16,17

    1. Lösen 0,02 g Toluidinblau O in 100 ml destilliertem Wasser zu einer 0,02%-Lösung herzustellen. HINWEIS: Die Toluidinblau O Lösung für zwei Wochen in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur gelagert werden.
    2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,02% Toluidinblau-O-Lösung zu der Röhre. Pipette vorsichtig die 0,02% Toluidinblau O-Lösung auf und ab. Dann Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und wiederholen Sie das Pipettieren einmal. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren. Lassen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen stehen still, bis die Abschnitte niederzulassen. Das kann hart sein, um zu sehen, wie die Lösung ist dunkel, so halten die Röhre, die die Abschnitte über Reagenzglasständer und es ihnen ermöglichen, für 2 min bei Raumtemperatur zu regeln.
      1. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul von 0,02% Toluidinblau O-Lösung. In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Toluidinblau O Solution. Wiederholen Sie die 3-4x oder bis der Waschlösung ist klar. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden, ohne sie zu beschädigen.
      2. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger und bedecken sie mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung.

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Representative Results

Stem Einbetten und Schneiden:
Die Verwendung des hausgemachten Kunststoffform, um die Stiele einbetten in 7% Agarose erwies sich schnell und einfach (Abbildung 1). Die beiden Teile (A und B; Abbildung 1) des eingebetteten Ampullensystem machen es einfach, die einfache Wiedergabe der Stammzellen in Agarose eingebettet, wie die Agarose nicht den Fläschchen Teile, die inert sind, bleiben, damit das System sauber. Die Fläschchen können mehrmals über Jahre wiederverwendet werden. Die Bequemlichkeit der Speicherung der eingebetteten Stammzellen macht auch die nächsten Schritte zu erleichtern. Um irgendwann zu speichern, ähnlich eingebettet Stämme können auf einem einzigen Schneideplatte zum Schneiden gruppiert werden (bis zu 3).

Beobachtung von Aromatics Unter UV:
Die Stammabschnitte wurden in destilliertem Wasser auf den Glasobjektträger aufgebracht und unter UV-Licht betrachtet. Die aromatischen Verbindungen, einschließlich des Lignins in den Zellen kann durch ihre Eigenfluoreszenz unter UV-Licht visualisiert werden. Xylem (XY) und interfaszikuläre Fasern (Fi)Autofluoreszenz zeigte unter UV-Beleuchtung, aber nicht in Mark (Pi) und Kortex oder Epidermis (Ep) (Fig. 2), da Lignin, ein aromatisches Polymer, während der Sekundärzellwand-Biosynthese abgeschieden. In einigen Fällen, wenn die Pflanzen akkumulieren wesentliche Mengen von Aromaten in die Vakuolen (zB Anthocyanin), Fluoreszenz in kortikalen Zellen (Daten nicht gezeigt) beobachtet werden. Stabquerschnitte wurden unter 5X, 10X, 20X analysiert, und 40-facher Vergrößerung (Fig. 2 die Felder A, B, C und D - E, jeweils), um besser sichtbar zu Zellwand aromatischen Verteilung über den Stamm.

Beobachtung von Lignin in den Stamm Abschnitte mit Phloroglucin und Mäule Stains Bunt:
Das Xylem von Schiffen und interfaszikuläre Fasern und Fasern zusammengesetzt waren die einzigen Elemente des Schaftes, die durch die Lignin Flecken (Phloroglucin und Mäule gefärbt wurden) Mit einem Stammabschnitt Probe Wildtyp. Phloroglucinol Fleck reagiert mit Zimtaldehyd Ende Gruppen von Lignin, ein rosa oder fuchsia Farbe 4 (Abbildung 3) zu geben. Wie unter UV-Beleuchtung beobachtet wird, wird ein fuchsia Färbung in Xylem und interfaszikuläre Fasern beobachtet, ist aber in Mark und Rinde oder Epidermis (Abbildung 3) fehlt. Stabquerschnitte wurden unter 5X, 10X, 20X analysiert, und 40-facher Vergrößerung (Fig. 3 Panel A, B, C und D - E bezeichnet), um eine bessere Visualisierung Phloroglucin Fleckenverteilung über den Stamm und die wichtigsten Gewebe unterscheiden; Xylem und interfaszikuläre Fasern; Mark und Rinde; und Epidermis. Normalerweise ist die Intensität der Farbe korreliert mit der Höhe der Verholzung in qualitativer Weise - außer, wenn der analysierte mutierten oder transgenen abnormal in Zimtaldehyd abgeleiteten Einheiten (zB CAD-Mutante) angereichert <sup> 14. Die Mäule Fleck ist bei der Erfassung der spezifischen Syringyllignin Einheiten in Xylem und interfaszikuläre Fasern. Rote Färbung zeigt die Anwesenheit von Syringyllignin Einheiten der Lignin-Elemente (Abb. 4) 18. Es wird jedoch eine hellere rote Färbung der Fasern im Vergleich zu den Xylem Gewebe, legt nahe, dass die Fasern eine höhere S Lignin während das Xylem ist angereichert in G-Einheiten beobachtet. Als nach Phloroglucin-Färbung beobachtet wird, wird eine rote Färbung in Xylem und interfaszikuläre Fasern beobachtet, ist aber in Mark und Rinde oder Epidermis (Abbildung 4) fehlen. Es korreliert auch mit dem Lignin Verteilung unter UV beobachtet (Fig. 2) und zeigt, dass in jeder Syringyleinheiten verholzten Gewebes dieses Stammes Probe vorhanden sind. Stabquerschnitte wurden unter 5X, 10X, 20X analysiert, und 40-facher Vergrößerung (Fig. 2 die Felder A, B, C, undD - E, beziehungsweise), um besser zu visualisieren Mäule Fleckenverteilung über den Stamm und die wichtigsten Gewebe differenzieren: Xylem und interfaszikuläre Fasern, Mark und Rinde und Epidermis. Es ist wichtig zu beachten, dass die Menge und Verteilung von Syringyleinheiten zwischen verholzten Gewebes variiert mit dem Alter des Schaftes und in einer jungen Schaft (Daten nicht gezeigt) vorhanden sein.

Beobachtung der Stamm Abschnitte mit Calcofluor Weiß und Kongorot Stains Bunt:
Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierte oder schwach substituierten β-Glucane; wohingegen Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere Cellulose. Stammabschnitte mit Calcofluor weiß gefärbt wurden unter UV-Licht 6-9 beobachtet. Kongo-Rot-gefärbten Schnitte wurden unter Blaulicht-Anregung mit einem Filter mit einem Bandpass von 560/40 festgestellt. Sowohl Calcofluor weiß und Kongo-Rot gefärbt die Epidermis, Rinde und Mark; thist, weil alle diese Gewebe enthalten Cellulose als Haupt Polysaccharidpolymer in ihren Zellwänden (Fig. 5 und Fig. 6 bezeichnet). Im Gegensatz dazu scheint weiß, Kongorot gefärbten Polysaccharide besser im Xylem und interfaszikuläre Fasern Calcofluor und weniger durch die Anwesenheit von Lignin (Bild 5 und Bild 6) 10,11 betroffen. Stabquerschnitte wurden unter 5X, 10X, 20X analysiert, und 40-facher Vergrößerung (Tafeln A, B, C und DE, die jeweils den Fig. 5 und 6), um eine bessere Calcofluor-white und Kongorot-Färbung visualisiert Verteilungen über dem Schaft und dem Haupt Gewebe (Xylem und interfaszikuläre Fasern, Mark und Rinde und Epidermis).

Beobachtung der Stamm Abschnitte mit Toluidinblau O gefärbt:
Toluidinblau O wird als eine vielfarbige Farbstoff eingestuft, weil es mit verschiedenen chemischen Komponenten der Zellen anders reagiert und die Ergebnisse ineine mehrfarbige Muster (Abbildung 7). Die erzeugten Farben können Informationen über die Art der Zelle und ihre Mauern. Toluidinblau O ein kationischer Farbstoff ist, die negativ geladene Gruppen 5 bindet. Eine wässrige Lösung des Farbstoff blau, aber verschiedene Farben erzeugt werden, wenn der Farbstoff bindet mit verschiedenen anionischen Gruppen in der Zelle 6,9. Zum Beispiel wird ein rosa lila Farbe erscheinen, wenn der Farbstoff mit carboxylierten Polysaccharide wie Pectinsäure reagiert; grün, grünblau oder hellblau mit polyzyklischen aromatischen Substanzen wie Lignin und Tannin; und violett oder grünlich blau mit Nukleinsäuren. Toluidinblau O der Stammquerschnitte ergeben, dass Xylem und interfaszikuläre Fasern verholzt, da sie einen grünlichen Blau oder Blaufärbung (Abbildung 7, Tafel C), die im Einvernehmen mit dem UV-und Ph-HCl-Färbung Beobachtungen (Abbildung 2 ist zu zeigen und 3). Im Gegensatz dazu das Mark und Rinde und Epidermis Gewebe zeigen, grünlich-blau oder blau Färbung, weil sie zwar nicht verholzt sind, einige Pektin Polymere in ihren Zellwänden enthalten sie. Stabquerschnitte wurden unter 5X, 10X, 20X analysiert, und 40-facher Vergrößerung (7 Tafeln A, B, C und D - E bezeichnet), um eine bessere Visualisierung Toluidinblau O Fleckenverteilung über den Stamm und die großen Geweben differen .

Figur 1
. Abbildung 1 Homemade Form für die Einbettung der Stämme auf der linken Seite. Spitze der 2 ml mit Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen (Teil A) und dem Boden von der 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Teil B). Auf der rechten Seite; die Parafilm hält die beiden Teile; A und B, um die endgültige Form zu bilden.

ntent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 2
2. UV-Fluoreszenz von A. thaliana Stammquerschnitte. Querschnitte eines Wildtyp A. thaliana-Stamm unter UV-Licht Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von aromatischen Verbindungen, darunter Lignin, nur in den Wänden der Fasern und interfaszikuläre Xylemzellen (A - E). Die Positionen der Epidermis und Cortex (Ep), interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) sind angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B: 10X; Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Fig. 3
Abbildung 3. Phloroglucin-HCl-Färbung von A. thaliana Schaftquerschnitte. Phloroglucin-HCl-Färbung (rosa oder fuchsia Farbe) eines Wildtyp A. thaliana Schaftschnitt, der den normalen Lignin Abscheidung in den Wänden der Fasern und interfaszikuläre Xylemzellen (A - E). Die Positionen der Epidermis und Cortex (Ep), interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) sind angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B: 10X; Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Fig. 4
4. Mäule Färbung von A. thaliana Stammquerschnitte. Mäule-Färbung (rot) einer Wildtyp A. thaliana </ Em> Schaftabschnitt, welche den normalen Lignin Abscheidung in den Wänden der Fasern und interfaszikuläre Xylemzellen (A - E). Die Positionen der Epidermis und Cortex (Ep), interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) sind angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B: 10X; Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Figur 5
5. Calcofluor weißen Färbung von A. thaliana Stammquerschnitte. Calcofluor weiß-Färbung eines Wildtyp A. thaliana Stielabschnitt zeigt Cellulose Abscheidung in den Zellwänden der Zellen der Epidermis, Hirnrinde, Mark, interfaszikuläre Fasern und Xylem (A - E). Die positions der Epidermis und Cortex (Ep), sind interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B: 10X; Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Fig. 6
Abbildung 6. Kongorotfärbung von A. thaliana Stammquerschnitte. Kongorotfärbung eines Wildtyp A. thaliana Stielabschnitt zeigt Cellulose Abscheidung in den Zellwänden der Zellen der Epidermis, Hirnrinde, Mark, interfaszikuläre Fasern und Xylem (A - E). Die Positionen der Epidermis und Cortex (Ep), interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) sind angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Fig. 7
Abbildung 7. Toluidinblau-O-Färbung von A. thaliana Stammquerschnitte. Toluidinblau-O-Färbung eines Wildtyp A. thaliana Schaftschnitt, der den normalen Lignin Abscheidung in den Wänden der Fasern und interfaszikuläre Xylemzellen (A - E). Die Positionen der Epidermis und Cortex (Ep), interfaszikuläre Fasern (Fi), Mark (Pi) und Xylem (XY) sind angegeben. Vergrößerungen: Feld A: 5X, Feld B: 10X; Feld C: 20X; Panels D und E: 40-fach. Bar = 100 um.

Tabelle 1 Tabelle 1. Mikroskop-und Kameraeinstellungen für die Bildgebung. Richtlinien für die Arbeit mit Fluoreszenz-Filter und Hellfeld-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

A. thaliana Stammabschnitte werden häufig verwendet, um die Organisation der Zellen in der sekundären Zellwand zu untersuchen und qualitativ untersuchen die Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Pflanzen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Schneiden der Proben sind direkte schneidend; oder, wenn Proben in Agarose-oder Fixiermittel eingebettet ist, kann mit einem Schnitt Vibratom oder Mikrotom durchgeführt werden. Im Gegensatz zu schneidend, die letzten beiden ermöglichen die Verringerung des Risikos von Herstellung ungenau Unterschiede zwischen den Proben, die einfach von einer schlechten Probenvorbereitung durch Dickenunterschiede zwischen den Proben und unebene Oberflächen verursacht werden würde. Alle diese Methoden haben ihre Vor-und Nachteile. Wir haben uns für die Einbettung in Agarose, gefolgt von Schneiden mit einem Vibratom, und tat dies aus folgenden Gründen: Die Leichtigkeit der Einbettung und Zeit sich mit der Agarose verbrachte eliminiert die Notwendigkeit für aufwendige Verarbeitung von frischem Gewebe. Auch sind unsere hausgemachten Formen einfach und billig zu machen, können th haltenE Stammzellen gerade, über viele Jahre verwendet werden, und kann in einfachen Lösen der Proben, ohne ein Chaos zu helfen. Der beste Weg, um hochprozentigen Agarose aufzulösen und eine homogene Lösung (vollständige Auflösung von 7 g Agarose in 100 ml ohne Bildung klobig Granulat) ist, es Autoklaven oder, um es auf der niedrigsten Intensität Mikrowelle. Es ist wichtig, den Schaft schneidet Gewebe frisch oder alternativ, um sie in eine Platte auf Eis, die ein Filterpapier mit Wasser benetzt, um Gewebe Dehydratisierung und Verformung zu verhindern platziert speichern. Speichern Sie den Vorbau für Zeiträume von mehr als 30 Minuten ohne hohe Feuchtigkeit bewirkt, dass die Stammzellen zu trocknen. Die Temperatur des Agarose direkt vor der Schaft eingebettet ist etwa 50 ° C. Es ist kritisch, um die Gegenwart von Luftblasen zu überprüfen, nachdem die Agarose wurde in die Ampulle gegossen, weil Luftblasen zu Lücken in der Form und damit die Schneide uneben sein. Luftblasen schnell, indem die Lösung unter Vakuum vor Gießen entfernt werden,es. Der Stamm sollte in der Agarose platziert werden, wenn er noch weich und nicht wärmer als 50 ° C. Die Wärme wird die Probe durch schrumpf den Stiel beschädigt werden, und die Zellmorphologie zu zerstören. Wenn die Agarose zu kalt ist der Schaft nicht über die Agarose eindringen und Einbettung ist nicht möglich. Nach Agarose-Einbettung kann Schaft Proben bei 4 ° C bis zu einer Woche gelagert werden.

Verwendung eines Vibratom statt handSchnitt Erträge präzise geschnitten Proben und eine bessere Bildqualität. Alle Sicherheitshinweise sollten sorgfältig gelesen und befolgt, während mit einem Vibratom werden. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Probe Scheibe sauber und trocken ist, damit die Gewebekleber, um die Probe stark in Position zu halten, damit es nicht beim Schneiden fallen ab. Die Dicke der Proben wird angegeben, um die harte Säure und Base Behandlungen während Färbeverfahren zu widerstehen. Die Rasierklinge in der Vibratom verwendet werden, sollten ganz flach sein, um sicherzustellen, dass der Abschnitt ev geschnittenENLY. Schnitte dauert ca. 20 min pro Probe; Um Zeit zu sparen, können ähnliche Proben in Gruppen auf einem einzigen Probenplatte geschnitten werden. Beim Schneiden werden die Abschnitte von der Pufferwanne in eine kleine Petrischale die Abschnitte leichter zu sehen, auf einem klaren Hintergrund zu machen und Pufferwanne für die nächsten Probe befreien übertragen. Abschnitte unmittelbar nachgeschalteten Färbeverfahren verwendet oder zur späteren Verwendung gespeichert werden. Aliquotierung der Stielabschnitte bis 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen hilft bei der Grundierung für Färbeverfahren. Die korrekte Anpassungen und Einstellungen an der Kamera und Mikroskop sind sehr kritisch für die Erreichung hoher Bildqualität. Einstellen der Köhlerbeleuchtung ist eine der wichtigsten Schritte bei der Verwendung des Mikroskops. Die Einstellungen für Blende und Lichtintensität, wie im Methodenteil beschrieben, sind nur als Leitfaden gedacht. Sie müssen in Abhängigkeit von der Mikroskop-und Kamera verwendet modifiziert werden. Wir haben eine hochauflösendeDigitalkamera mit einer Großformat-Interline-CCD-Chip und kein mechanischer Verschluss für den UV-Imaging, Calcofluor weiß und Kongorot-Färbung; und eine hohe Auflösung und High-Speed-Farbkamera für Hellfeld-Bilder der Mäule, Phloroglucin und Toluidinblau-O-Färbung. Bilder wurden analysiert, verarbeitet und mit Standard-Bildbearbeitungssoftware zusammengesetzt.

Phloroglucin ist die am häufigsten verwendete Färbung zur Bestimmung Lignin; es ist keine echte Lignin Fleck, da es nur Zimtaldehyd Endgruppen Flecken. Das Phloroglucin Fleck, der auch als Weisner Fleck bekannt ist, ergibt sich eine charakteristische Kirsche rosa oder fuchsia Farbe im Xylem und interfaszikuläre Fasern, wo diese Aldehyd-Gruppen vorhanden sind 4. Die Intensität der rosa Farbe variiert mit dem Ausmaß der Lignifizierung. Obwohl feine Unterschiede sind schwerer zu beobachten, ist es einfach, Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante Stammabschnitte, die Variationen in ihren Ligningehalt 19 haben vor Ort. Es ist auch EASy, um Unterschiede zwischen jüngeren (in Richtung der Schaftspitze) und älteren (Stamm Basis) Gewebe, zu beobachten, weil Verholzung Niveaus zwischen solchen Geweben variieren. In der Regel in Wildtyp-Stamm, Rinde und nicht Epidermis Mark Zimtaldehyde enthalten (also nicht gefärbt werden), es sei denn Eileiter Verholzung 20. Mäule Fleck, auf der anderen Seite, ist spezifisch gegen Syringyllignin Einheiten und können unterschiedliche Anreicherungen Lignin in S oder G-Einheiten (z. B. Fasergewebe gegen Xylem) 14,18 unterscheiden. Die Kaliumpermanganat und Salzsäure wirken auf die Syringyl Kern der S-Einheit im Lignin, ein Methoxykatechol bilden, und dann Methoxy-o-Chinon folgende Reaktion mit Ammoniak. Die Mäule Fleck ist ein guter Indikator für die Differenzierung Mutanten, die fehlen oder sind ausführlich in S-Einheiten von Lignin (z. B. in A. thaliana F5H Mutanten und allgemeine Gymnospermen Pflanzen) erschöpft ist, gibt Mäule gelb-braune Färbung instead von roten sowohl im Xylem und der sclerenchyma 21. Aus dem gleichen Grund kann Mäule Färbung verwendet, um Angiospermen unterscheiden, welche in erster Linie S enthalten Lignin aus Gymnospermen, die in der Regel nicht über die S-Einheit 18 werden. Da starke Säure und Base werden während Phloroglucin und Mäule Färbeverfahren jeweils verwendet wird, müssen einige experimentelle Schritte mit Vorsicht durchgeführt werden. Beide konzentrierten HCl und Ammoniak sind stark ätzende Stoffe; sie können den Mikroskoptisch und Objektiv verschlechtern, wenn die Folien mit den Ph-HCl und Mäule gefärbten Proben nicht richtig gehandhabt wird. Sie können auch trocknen schnell auf, innerhalb von 5-10 min, wodurch Proben zu verschlechtern, so schnell durchgeführt werden die Abbildungs ​​hat. Toluidinblau O eine polychromatische Flecken und Flecken verschiedener Komponenten der Zellwand in verschiedenen Farben, wie es reagiert mit verschiedenen chemischen Komponenten der Zellwände unterschiedlich, wodurch ein mehrfarbiges Muster. Die erzeugten Farben können provide Informationen über die Art der Zelle. Toluidinblau O ist auch eine kationische Farbstoff, die negativ geladenen Gruppen 5,6 bindet. Eine wässrige Lösung des Farbstoff blau, aber verschiedene Farben erzeugt werden, wenn der Farbstoff bindet mit verschiedenen anionischen Gruppen in der Zelle. Zum Beispiel sind die Farben einer rötlichen Purpur, wenn der Farbstoff mit carboxylierten Polysaccharide, wie Pektin reagiert; grün, grünblau oder hellblau mit aromatischen Substanzen wie Lignin und Tannin; und violett oder grünlich blau mit Nukleinsäuren. Die Färbung ist sehr einfach und kann für zwei Tage.

Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierte oder schwach substituierten β-Glucane 6-9 und Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere zu Cellulose 8,10,11. Calcofluor weißen Flecken brillant die Epidermis, Rinde und Mark, aber das ist deutlich Brillanz in Xylem und interfaszikuläre Fasern reduziert. Es gibt zwei pÖGLICHE Erklärungen für die reduzierte Fluoreszenz Calcofluor weiß in stark verholzten Gewebe; eine schreibt sie auf die Anwesenheit von Lignin, das würde wiederum verringern die Fähigkeit von Calcofluor-white, um richtig durch den Polysacchariden diffundieren. Eine zweite Erklärung zeigt auf eine Teillöschung der Fluoreszenz der angeregten Calcofluor-white unter UV emittiert. Im Gegensatz zu Calcofluor-white, Kongorotfärbung scheint weniger durch das Vorhandensein von Lignin beeinflußt. Es könnte auf den Unterschied in der Fluoreszenz-Eigenschaften von Calcofluor-white und Kongorot verwandt sind; eine bessere Diffusionsfähigkeit von Kongo-Rot durch die verholzten Gewebe als Calcofluor weiß; oder einen kleinen Unterschied in Polysaccharid Bindungseigenschaften 22. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schnitte mit Kongorot gefärbt sollten nicht zu lange gelagert, bevor Bildgebung, da Kongorot dazu neigt, in Wasser gewaschen zu bekommen.

Obwohl histochemische Färbung ist weder quantitativenoch absolut schlüssig, kann es durch visuelle Signale zeigen eine Fülle von Informationen über wichtige Merkmale wie die Integrität von Geweben oder abnormale Zellwandabscheidung und Verholzung. Die oben beschriebenen Färbetechniken sind einfach durchzuführen und sind für kritische Elemente in einer Pflanzenzellwand, wie Lignin und Cellulose. Im Gegensatz dazu wird Immunofluoreszenz unter Verwendung spezifischer Antiseren und monoklonale Antikörper zur Detektion verschiedener Komponenten Hemicellulosen und Pektin erforderlich. Dieser Bericht soll als Grundierung für Anfänger im Bereich der sekundären Zellwand-Färbung, die A. verwenden dienen thaliana als Modellsystem.

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Acknowledgments

Wir sind dankbar für die Bearbeitung von Sabin Russell Unterstützung. Diese Arbeit war Teil des DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) durch das US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological-und Umweltforschung, unterstützt durch Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und das US Department of Energy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose EMD MERC2125 CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol Sigma P 3502 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric acid EMD HX0603-75 CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide EMD AX1303-6 CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O Sigma T3260 Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] 
Potassium permanganate Sigma 223468 CAS Number 7722-64-7 
Ethanol 190 proof KOPTEC V1401 CAS Number: 64-17-5
Congo Red Sigma  C6277 Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain Sigma F3543  4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] 
Vibratome Leica Leica Vibrating blade microtome VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor American Safety razor company Item # 60-0139-0000  Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) VWR 16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) Axygen Scientific MCT-060-C
Mitt Bel-Art 380000000 SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive Ted Pella Inc 10033 Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage
Microwave Panasonic NN-SD762S PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive 
Camera with CCD chip with no mechanical shutter  Hamamatsu C4742-95
High speed color camera    QImaging MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software   Molecular Devices MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis  Adobe  Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-067 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm.
Frosted Micro Slides, 1 mm VWR 48312-003 75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M Alcan packaging BRNDPM998
TX2 Filter cube Leica 11513851/11513885 Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.

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Pradhan Mitra, P., Loqué, D. Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements. J. Vis. Exp. (87), e51381, doi:10.3791/51381 (2014).

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