Introduction
Den histologiske undersøgelse af biologisk væv er en grundlæggende tilgang i forståelsen af molekyler / celler i deres naturlige sammenhæng. Ideelt høj opløsning billeddannelse af hele organet er mest informative og ønsket. Fordi lys har en begrænset indtrængningsdybde på grund af spredning 1 faste organer skal snit for at udføre høj opløsning mikroskopisk billeddannelse. Derfor er de fleste af de histologiske undersøgelser udført på få vævssnit repræsenterer kun en lille del af orglet. I nogle studier, fx dem, der har til formål at spore neuronale forbindelser i hjernen eller rygmarven, alle vævssnit fra målorganer indsamles og filmede til en 3D-rekonstruktion. Men vævssektionering og efterfølgende billeddannelse af individuelle sektioner har forskellige begrænsninger. Heriblandt er tidskrævende og fører til en ufuldstændig 3D rekonstruktion af væv på grund af mekaniske forvridninger og vanskeligerne i tilpasningen af de resulterende billeder.
For nylig har clearing-og billedbehandling intakte gennemsigtige organer blevet udviklet som en afgørende løsning på denne mangel 2,3. Ved clearing, er hele organet gøres transparent tillader billeddannende lys til at rejse ende-til-ende (figur 1) til at producere billeder af unsectioned organ høj opløsning ved hjælp af et laserscanningmikroskop, såsom en multi foton eller lys ark mikroskop ( figur 2). Forskellige forskergrupper har udviklet nye væv clearing protokoller til at være i stand til at afbilde deres væv af interesse til forskellige formål. Disse omfatter organisk opløsningsmiddel 2-5, vand 6,7 og elektroforese baseret 8 clearing protokoller. Blandt dem, 3-dimensionelle billeder af opløsningsmiddel blokerede organer eller 3DISCO er en let anvendelig protokol på en række biologiske prøver, herunder det centrale nervesystem (CNS) organer, immune organer og solide tumorer. I Addition, kan den kombineres med forskellige mikroskopi teknikker såsom plade lys fluorescensmikroskopi (LSFM), multi foton og konfokal laser scanning mikroskopi. 3DISCO er baseret på clearing med let tilgængelige og billige reagenser, såsom tetrahydrofuran (THF) og dibenzylether (DBE) 4.. Hele protokollen kan tage så kort som 3-4 timer. Således 3DISCO er en robust og hurtig teknik i forhold til traditionelle histologiske metoder, der kan tage uger til måneder at færdiggøre 9..
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC (Institutional Animal Care og brug Udvalg) forordningerne om mus ~ 3-5 måneder gammel. Forfatteren erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
1.. Animal perfusion og Vævspræparat
Timing: 30-60 min per mus + post-fiksering (nogle få timer til natten over).
- Dyret vejes, og bedøver hjælp ketamin (80-200 mg / kg) og xylazin (7-20 mg / kg) eller 2,5% avertin (0,5 ml/25 g legemsvægt IP).
- Vent et par minutter til anæstesi til at tage fuld virkning.
- Klem tå og hale af dyret for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet.
- Perfuse dyret først ved stuetemperatur med 0,1 M phosphatpuffer (PB) eller 0,1 M phosphatpuffer saltvand (PBS) i 5-10 minutter, indtil blodet er helt fjernet fra vævet.
- Skift perfusionen til fikseringsopløsning: 4% PFA i 0,1 M PB (eller 0,1 M PBS) og fortsætte perfusionmed 4% PFA 30-40 minutter ved en hastighed på 3 ml / min.
- Dissekere orgel / s interesse omhyggeligt uden at beskadige, fx undgå at punktere og klemme det væv, der bliver dissekeret.
- Fjern det ekstra væv omkring organer (bindevæv, hjernehinderne eller dura stof) i en petriskål fyldt med PBS.
- Post-fix organerne i 4% PFA for et par hr eller natten over ved 4 º C. Undgå lange post-fiksering, fordi PFA kan slukke signalet eller øge autofluorecense overtid 10 især for GFP-kanal (som er et mindre problem i røde og fjerne røde kanaler).
- Vask organerne 2-3x med PBS ved RT lige før clearing procedure.
2.. Tissue Clearing
Timing: 2-3 timer til små organer og 1-4 dage for store organer.
Bemærkninger: Den fluorescerende mærkning af det væv ved transgen ekspression, viral transfektion farvestof tracing eller antikrop mærkning bør være afsluttet, før clearing. Alle væv clearing trin udføres ved stuetemperatur. Clearing-løsninger THF, DBE, Babb (1 del benzylalkohol og 2 del benzylbenzoat) og dichlormethan er giftige og indånding (udføre eksperimenter i korrekt ventileret stinkskab) og direkte kontakt med hud bør undgås (brug nitrilhandsker).
- Forbered 50% (vol / vol), 70%, og 80% THF fortyndinger i destilleret vand i separate glasflasker som følger: for 50% THF, fx blande 25 ml THF og 25 ml destilleret vand i en glasflaske med volumen af større end 50 ml.
- Bland løsninger ved forsigtigt at ryste flasken for en 1-2 min.
- Mærk glasflaske tydeligt.
- Sikker lukke flaskerne og holde de arbejdende løsninger i et mørkt skab. For de bedste resultater, må du ikke bruge de samme arbejdsvilkår løsninger længere end 1-2 uger. Derfor bestille clearing løsninger som den mindste mængde til rådighed til at kunne bruges friske lager reagenser.
- Fyld hætteglas (fx 2-3 ml) med den første clearing løsning, 50% THF, og overføre organer fra PBS i hætteglas til at starte clearing.
- Sikkert lukke hætteglas med låg og anvende en rotator (fx et hjul omrører) i omrøring.
- Brug aluminiumsfolie til at dække og holde hætteglas i mørke. Start rotator at røre prøverne i hætteglas for den angivne tid (tabel 1) ved en konstant hastighed (~ 30 rpm).
- Fjern clearing og der tilsættes den næste i protokollen, når tiden i tabel 1 er afsluttet.
- Saml clearing affald i glas affaldscontainere, der holdes i en hætte.
Gentag forrige trin for hver clearing løsning i protokollen indtil slutningen. Brug en ny Pasteurpipette når der tilføjes en ny clearing løsning (fx skift fra THF til DBE). - Ved den afsluttende clearing trin med Babb eller DBE kan inkubationstiderne forlænges eller shortened indtil prøverne bliver helt gennemsigtig i synligt lys (eller gullig / transparent, hvis det er en meget stor væv som hjerne).
- Hold ryddet organer i den endelige clearing løsning på alle tidspunkter, herunder de billeddannende trin.
3.. Forberedelse Ryddet Organs for Imaging
Timing: 5-15 min.
Bemærk: Image ryddet organer, så snart et komplet clearing er opnået. Til dette formål skal du følge de næste skridt til at forberede prøverne for lys-ark mikroskopi (f.eks ultramicroscopy) eller konfokal / multi-foton mikroskopi billeddannelse.
Bemærk: Ryddet organer vil miste deres fluorescens styrke over tid (især fluorescerende proteiner f.eks GFP, antistof-mærkning er mere modstandsdygtig og kan endda give bedre resultater med længere inkubationer). For billedbehandling kan forskellige fluorescerende mikroskopi teknikker blive anvendt, så længe korrekt håndtering af organer i clearring opløsning er opnået.
- For lys-sheet mikroskopi
- Placer eller monter prøven korrekt.
- Fastgør ryddet orgel ved manuelt at dreje på skruen i prøveholderen 4..
- Dyp prøven i imaging kammer (fortrinsvis fremstillet af glas) thelight ark mikroskop, der er fyldt med Babb eller DBE, alt blev brugt på det afsluttende clearing skridt.
- For multi foton / konfokal mikroskopi
- Monter prøven på en billeddannende dias (eller en imaging kammer) med den endelige imaging løsning til at være i stand til at billedet med en multi foton eller konfokal mikroskopi, som typisk bruger olie eller vand nedsænket mål.
- Brug dental cement til at lave en kant rundt vævet.
- Fyld poolen med Babb eller DBE lige før dental cement bliver helt stiv.
Bemærk: Den dental cement størkner hurtigt; øve et par gange for at blive fortrolig med det, før du prøver de faktiske prøver. - Umiddelbart placererryddet prøve i midten af poolen og dække det med et dækglas.
- Tryk glasafdækningen indtil den er helt forseglet af dental cement og rører ved overfladen af den ryddet organ, som vil give nå den maksimale imaging dybde ved konfokal / multi-foton mikroskopi.
Bemærkninger: Dette sikrer, at ingen clearing løsning vil blive spildt under billedbehandling. Undgå at dyppe afbildningslinsen direkte ind i clearing løsning, som kan skade objektivet, medmindre det er resistent over for Babb / DBE eller har et beskyttende dække.
4.. Imaging Ryddet Organs
Timing: 15-45 min.
- Saml en z-scan, der dækker hele ryddet væv (hvis den anvendte linse tillader det) på den bedste opløsning at mikroskopet kan levere.
- Zoome ind på områder af interesse for at indsamle billeder i højere opløsning.
5.. Undersøgelse af data med softwaren Amira
- Indlæse billedet series til software Amira med ResolveRT modul.
- Indtast de korrekte voxel størrelser i "Image Læs Parameter" vinduet og tryk på ok.
- Vælg "Multi Planer View" sub-ansøgning. Brug derefter "Tykkelse" slider til at vælge den optimale tærskel for de grå værdier, justere 2D-og 3D-værdier.
- Visualiser prøven ved at gennemse skiver i forskellige 2D orienteringer og bruge afgrøde-hjørne modul i 3D-visning.
Bemærk: En detaljeret fejlfindingsvejledning af protokollen kan findes i Ertürk et al 4.
Representative Results
Neuroner er stærkt polariserede celler med ekstremt lange morfologi. Deres funktion afhænger af de forbindelser, som de danner med hinanden og med andre væv. Derfor er yderst vigtigt at kortlægge den strukturelle organisering af neuroner med henblik på at forstå, hvordan de fungerer i sundhed og sygdom. Men, opsporing så enorme neuronale forbindelser i hele hele nervesystemet-nylig navngivne connectomics 11 - stadig et af de mest vanskelige udfordringer i neurovidenskab. Til dette formål har både EU 12 og USA 13 igangsat store projekter for at kortlægge den menneskelige hjerne.
Mens 3DISCO kan være ansat på forskellige organer, har det været særligt nyttigt at spore lange neuronale forbindelser i rygmarv og hjerne. For eksempel ved hjælp ultramicroscopy scanninger af store ryddet rygmarv segmenter de axonale forbindelser kan følges i centimeter i gnaver rygmarv (Figur 2). På lignende måde kan hele blokerede musehjerne (figur 3a) og hippocampus (figur 3b), der skal afbildes at følge neuronale forbindelser i hjernen.
Når konfokal eller multi foton mikroskopi anvendes på ryddet organer, kan billedbehandling opløsning forbedres betydeligt, især i z-dimension. For eksempel, multi foton billeddannelse ryddede rygmarv fra GFP-M line mus (Figur 4a) opnår en problemfri billede hele dybde (~ 1,5-2 mm) i rygmarven. Konfokal mikroskopi på blokerede rygmarven leverer forbedret opløsning på en lignende måde (figur 4b og c). Multi foton mikroskopi billeddannelse af ryddet hjerner leverer billeder med meget høj opløsning til at visualisere fine detaljer neuronale strukturer, herunder dendritiske Torner (figur 5). Prøverne til 3DISCO kan mærkes på forskellige måder, herunder transgenekspressionssystem, viral transfektion farvestof sporing og antistof mærkning. For eksempel er det muligt at mærke hele vaskulaturen af hjernen (figur 6a og b) og rygmarv (figur 6c og d) ved hjælp af lectin-konjugerede fluorescerende sporstoffer 4, som kan anvendes til at undersøge blod-hjerne-barrieren (BBB ) i sundhed og sygdom.
Begge mikroglia og astrocytter er stærkt impliceret i patologien af neurodegeneration, herunder Alzheimers sygdom og traumatiske skader 14,15. Brug 3DISCO kan deres tæthed og fordeling i rygmarven (Figur 7) eller hjerne skal undersøges.
Ikke-neuronale væv kan også afbildes. For eksempel kan Clara-celler i hele gnaver lungerne blive immunolabeled med antistoffer og afbildet uden skæring på en enkelt celle niveau (figur 8). Ligeledes er det muligt at rydde og billedfiler celler, fxalfa-celler i unsectioned pancreas væv (figur 9).
Figur 1.. 3DISCO væv clearing gør unsectioned væv transparente til dyb væv billeddannelse. Uncleared (a) og ryddet (B) rygmarvsbetændelse som set af synligt lys. Ved clearing, bliver det muligt dybe væv laser-scanning mikroskopi. (C) uncleared og ryddet rygmarvsbetændelse blev afbildet med 2-foton mikroskopi. Skalapanelerne i a, b = 0,5 mm og i c = 100 um.
Figur 2.. 3DISCO billeddannelse af rygmarven til følge axonale extensions. Den dissekeret rygmarv fra Thy-1-GFP transgene mus linje (GFP-M) er opdelt i mindre stykker (~4 mm). Efter at have fulgt clearing protokol for små væv (tabel 1) de transparente rygmarv blev visualiseret ved hjælp ultramicroscopy. 3D rekonstruktioner af en ~ 4 mm rygmarv segment i vandrette (a), coronal (b) og sagittalbillede (c). (D) Repræsentant spores axoner (rød) vises i gråtoner gennemsigtig udsigt. (E) Høj forstørrelsessynsfelt af den angivne region (d). Skalapanelerne i a, b, c, d = 0,5 mm og i e = 20 um.
Figur 3.. 3DISCO billeddannelse af ryddet hjerne og hippocampus. Eksempler på ryddet hjerner og hippocampi af GFP-M-mus blev afbildet med en ultramicroscope. 3D-billeder af hele hjernen (a) og hippocampus (b) viser den neuronale netwoRKS i afbildet gennemsigtige væv. Skalapanelerne i a = 2 mm, og i B = 20 um.
Figur 4.. Tissue clearing forbedrer opløsningen opnået ved multi foton og konfokal mikroskopi. Transparent rygmarv segmenter fra GFP-M mus afbildet ved at multiplicere foton (a) eller konfokal mikroskopi (b, c). Bemærk at rydde væsentligt forbedrer opløsningen og billedbehandling dybde afslører den fine struktur axoner og dendritter. Skalapanelerne i en = 100 um og i b, c = 20 um.
Figur 5.. 3DISCO billeddannelse af dendritiske Torner. Transparent hjernevæv fra GFP-M mus afbildet af multi foton. 3D visualiseringer af scannede cortex region præsenteres i vertiske (a) og horisontale perspektiver (b). (C) ~ 50 um projektion fra de angivne niveauer i (a, b). (D) Høj forstørrelse af den angivne region i (c) fremviser de fine detaljer i de neuronale strukturer, herunder dendritiske Torner (pilespidser). Skalapanelerne i en = 50 um, i B, C = 25 um, i d = 5 um.
Figur 6.. 3DISCO af kar. At mærke blodkarrene i hele organer blev lectin-FITC farvestof anvendes under perfusion (før rydningen) som beskrevet 16. Det er værd at nævne, at vi fandt, at haleveneinjektion af røbestof giver bedre signal over hjerte-perfusion af sporstof. Efter indsamling af de faste hjerner og rygmarv, blev de ryddet, og jegmaged af ultramicroscopy. 3D-visualisering af hele musehjerne vaskulaturen i Heatmap (a) og grå skala (a). (B) 3D visualisering af kar en mus rygmarven segment i Heatmap (c) og grå skala (d). De heatmaps blev genereret på grundlag af intensiteten af lektin farvning; blå: lav intensitet (baggrund) og rød: høj intensitet (kar). Skalapanelerne i a = 2 mm, b = 1 mm, og i c, d = 250 um.
Figur 7.. 3DISCO af gliaceller i ryddet CNS væv. De rygmarv af transgene mus udtrykker GFP i mikroglia TGH (CX3CR1-EGFP), eller astrocytter TGN (hGFAP-ECFP), blev ryddet og afbildet af multi foton mikroskopi. 3D rendering af mikroglia vises som overflade volumen visualisering (a) og gennemsigtig udsigt (
Figur 8. 3DISCO af en hel-mount lungelap med antistof farvning af Clara-celler. For hele-mount antistoffarvning af lungelapper blev 10 uger gamle BALB / C-hunmus perfunderet gennem den højre ventrikel med PBS med henblik på at fjerne blod fra lungerne. Lunger blev efterfølgende oppustet med 4% PFA og fast O / N ved RT i fiksativ mindst tre gange rumfanget af the væv. Næste dag blev lungerne skylles kortvarigt i PBS og højre lap blev anbragt i 5 ml 1% Triton X-100 i PBS i permeabilisering i 48 timer eller indtil vævet sank. Alle farvninger blev udført i 0,2% Triton X-100 i PBS indeholdende 5% FBS og 2% BSA og skylning var i 0,2% Triton X-100 i PBS. Farvning med anti-CC10 var i 72 timer ved 4 ° C efterfulgt af omfattende vask til ca 6 timer. Fluorescerende mærkning af det primære antistof blev opnået med anti-ged-Alexa Fluor-594 sekundært antistof natten over ved 4 ° C efterfulgt af omfattende vask i 6 timer til natten over. Den følgende dag blev farvet lapper væk gennem 50%, 70% og 80% THF i 30 minutter hver, efterfulgt af tre 30 minutters vaske i 100% THF, efterfulgt af 20 minutter i DCM, efterfulgt af 30 minutter i DBE. Skalapanelerne i a og b = 1 mm, og i c = 100 um.
Figur 9.. 3DISCO i bugspytkirtlen. Efter perfusion af mus, som beskrevet ovenfor i protokollen, bugspytkirtlen blev dissekeret og ryddet med den korte protokol. Fluorescens stammer fra ROSA26 LSL tdTomato rekombination fremkaldt af tamoxifen behandling af mus, der bærer en 200 kb BAC transgen spænder det endogene muse glucagon locus med CreERT2 indsat i ATG glukagon. Pilene markerer nogle af de fluorescensmærkede alfa-celler i ø. Skalapanelerne i a, b og c = 1 mm, og i d = 500 um.
Tabel 1.. Tissue clearing protokoller for forskellige væv. Eksempler på væv clearing protokoller for forskellige væv. Bemærk, at clearing tid for hvert trin kan forkortes eller forlænges for at forbedre clearing ydeevne. Den omtrentlige vægt af små væv er ~ 20-100 mg og hjerne er ~ 300-500 mg.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel.
Discussion
Tissue clearing metoder til formål at reducere spredning af imaging lys ved at matche de brydningsindeks forskellige vævslag i de ryddede organer. Som et resultat heraf kan den billeddannende lys trænge dybt ind i væv og stimulere de mærkede celler / molekyler. Denne gamle koncept af væv clearing 17 har fået voksende opmærksomhed efter den første avancerede anvendelse af teknikken på intakte musehjerner af Dodt og kolleger 2. Siden da, er der en hurtigt voksende liste over nye clearing metoder, herunder 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY og SeeDB 3,4,7,18-20. I det væsentlige, de alle til formål at gøre de organer gennemsigtige for dyb væv billedbehandling ved at bevare den fluorescerende mærke. Blandt dem, 3DISCO skiller sig ud som en af de mest enkle og reproducerbare metoder. Det er relativt hurtigt i forhold til andre clearing ovennævnte metoder (1-5 dage vs 2-3 uger for voksne hjerner, henholdsvis) 21. Det er allerede blevet en succesfuldt ud anvendes til forskellige organer såsom hjerne, rygmarv, lymfeknuder, milt, lunge, solide tumorer, bugspytkirtel og mælkekirtler 3,4,9. Desuden flere publikationer fra uafhængige forskergrupper allerede brugt denne metode til at opnå billeddannelse resultater 22,23. Ikke desto mindre kan forskellige væv clearingprocedurer være fordelagtigt for forskellige betingelser. For eksempel, mens Sca / e og SeeDB gælder bedst i embryonale væv 6,7, er de vandbaserede clearing metoder, der kan være lettere at håndtere under billedbehandling. I modsætning hertil Klarhed er en kompliceret og kostbar clearing metode. Men det kan være fordelagtigt i forbindelse med antistof mærkning, især i store væv såsom hjernen 8.
Den mest kritiske skridt til at opnå de bedste imaging resultaterne fra 3DISCO er væv mærkningen, der er opnået før vævet clearing. Det er vigtigt at starte med det stærkeste fluorescenssignal muligt. Dette kan be opnås på forskellige måder, herunder transgene ekspression af fluorescerende proteiner, opsporing af syntetiske farvestoffer, viral transfektion eller antistof mærkning. Det bør erindres, at enhver clearing procedure vil reducere det fluorescerende signal af væv. Derfor, hvis det fluorescerende signal er ikke stærk nok i begyndelsen - det vil sige, ikke er let påviseligt før clearing-billeddannelse af de ryddede væv vil give dårlige resultater.
Der er nogle begrænsninger for at rydde metoder, der venter på forbedringer. En kritisk begrænsning er, at eftersom clearing reagenser ændrer strukturen af de ryddede organer, kan de ikke anvendes på levende væv. Derfor bør eksperimenter såsom med fotoaktiverbart mEos2 24 skal udføres før fastgørelse og clearing. Ved clearing, super-opløsning billeddannelse af det fluorescerende signal fra lyse og fotostabile proteiner bliver muligt. Hertil kommer, fordi clearing protokol formindskerintensiteten af de fluorescerende proteiner, kan de ryddede organer ikke kan opbevares i længere perioder. Det er vigtigt at bemærke, at nogle organer er sværere at blive ryddet. Især, hvis de dissekerede organer bevarer store mængder af blodlegemer (f.eks, milt, lever), er de forholdsvis svære at afhjælpe og image. Det er også relativt sværere at opnå en fuldstændig rydning af store væv, såsom voksen gnaverhjerne. Sådanne væv kan være nødvendigt længere inkubationstider, som, på den anden side reducerer det fluorescerende signal. Desuden udvikling af mikroskopi metoder, der kan billeddata store gennemsigtige organer på en gang på en høj opløsning er en afventer behov for at blive behandlet. En anden vigtig begrænsning af teknikken er vævet mærkning. Mens et stærkt fluorescerende signal via genetisk eller virus udtryk er ideel, kan ikke hver celle eller molekyle mærkes genetisk eller viralt. På den anden side, er ikke en enkel procedure eller endda ikke po antistof mærkning af tykke vævssible i de fleste tilfælde. Det kan kræve særlige permeabilization protokoller og lange inkubationstider (flere dage til et par uger) 3. Det er også vigtigt at huske på, at væv skrumpe ~ 20% i hver dimension (målt for rygmarven væv) efter clearing hovedsageligt på grund af dehydrering og delipidering. Dette svind sker ratiometrically og bør korrigeres i kvantificering trin. Som observeret i de præsenterede resultater, fluorescens-mærkede strukturer forbliver intakt, hvilket er indikation af protein integritet i de ryddede væv. På grund af den hydrofobe natur af det endelige blokerede væv, kan det ikke blive yderligere farvet med antistoffer eller indlejret i vandholdige opløsninger f.eks Focusclear-der anvendes i CLARITY-eller 80% glycerol. Endelig er det en udfordring at analysere overvældende størrelser af billeddata. For eksempel, når en hel murine hjerne er scannet på et cellulært opløsning, ville det være meget svært at spore og kvantificere ønsket structures (f.eks neuronal eller glia-netværk) og sammenligne over forskellige prøver på en automatiseret måde. Sammenfattende mens forskerne til formål at finde ud af nye clearing metoder, de forskellige udfordringer ovenfor (vanskeligheder med at rydde forskellige væv, billedbehandling i høj opløsning af større områder, og kompliceret dataanalyse) bør forbedres parallelt.
Afslutningsvis nyligt udviklede væv clearing teknikker, herunder 3DISCO, elegant viser, at høj opløsning 3D billeddannelse af intakte organer er nu muligt. Ved hjælp af disse metoder, kan forskerne få anatomiske oplysninger af celler og molekyler i den intakte organ. Disse banebrydende 3D billeddiagnostiske undersøgelser af transparente organer inspirere et stigende antal forskere til at dechifrere komplekse anatomiske og molekylære organisationer af væv / organer i hede og sygdom.
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker C. Hojer for kritisk læsning af manuskriptet, B. Bingol (Genentech) til deltagelse i script fortællinger, N. Bien-Ly for at dele oplevelsen af forbedret vasculature billeddannelse med haleveneinjektion af Lectin farvestof, og M Solloway (Genentech ) for de anvendte mus i bugspytkirtlen billeddannelse. GFP-M linje blev skabt af J. Sanes (Washington University i St. Louis) og CX3CR1-GFP-mus ved R. Littman (NYU). Arbejdet er støttet af Genentech, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | Can be obtained from Jackson. | ||
| CX3CR1 GFP mouse | Can be obtained from Littman lab at NYU. | ||
| TgN(hGFAP-ECFP) mouse | Can be obtained from Jackson. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7892-04 | |
| 2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | Used to prepare Avertin solution. |
| Saline | Braun | ||
| Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
| Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
| Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
| Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
| anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
| Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | Used in perfusion. |
| Glass vials | VWR | 548-0554 | |
| Forceps | FST | 11251-10 | |
| Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| 100 ml Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
| Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
| Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
| FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
| Cover slip | Corning | 2940-245 | |
| Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
| Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
| Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
| Amira with RT resolve microscopy module | Visage Imaging | image analysis software | |
| Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
| ImageJ | NIH | freeware |
References
- Tuchin, V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , SPIE Press. (2007).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
- Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
- Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
- Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
- Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , S. Hirzel. (1903).
- Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
- Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
- Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
- Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).
