Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Нуклеозидтрифосфатов - от синтеза до биохимической характеризации

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

Протокол, описанный здесь призвана объяснить и сокращать многочисленных препятствий на пути сложной трассе, ведущей к модифицированным нуклеозидтрифосфатов. Следовательно, этот протокол облегчает как синтез этих активированных строительных-блоков и их доступности для практического применения.

Abstract

Традиционная стратегия для внедрения химических функциональных групп является использование твердофазного синтеза из путем добавления соответствующим образом модифицированные предшественники фосфорамидит к зарождающейся цепи. Тем не менее, условия, используемые в процессе синтеза и ограничение на относительно коротких последовательностей препятствовать применимость этой методологии. С другой стороны, модифицированные нуклеозидтрифосфаты активируются стандартные блоки, которые были использованы для мягкого введения многочисленных функциональных групп в нуклеиновые кислоты, стратегии, которая открывает путь для использования модифицированных нуклеиновых кислот в широкомасштабной палитре практических приложений таких как функциональное пометки и поколения рибозимов и DNAzymes. Одна из основных проблем заключается в сложности методологии, ведущей к изоляции и характеристике этих аналогов нуклеозидов.

В этом видео статье мы представляем подробный протокол для синтеза Фесе изменение аналогов с использованием фосфора реагентов (III) на основе. Кроме того, порядок их биохимической характеристике разглашается, с особым акцентом на удлинения праймера реакций и хвостохранилища полимеризации TdT. Это Подробный протокол будет полезен для крафта модифицированных дНТФ и их дальнейшего использования в химической биологии.

Introduction

5'-нуклеозидтрифосфатов ((г) НПТ) представляют собой класс жизненно важных биомолекул, которые участвуют в бесчисленных процессов и функций, начиная от того, универсальная валюта энергии регуляторов клеточного метаболизма. В дополнение к своей роли в этих фундаментальных биологических преобразований, их модифицированные аналоги продвинулись как универсальный и мягким платформы для введения функциональных групп в олигонуклеотидов, методологии, которая прекрасно дополняет автоматизированную твердофазного синтеза, который обычно применяется 1,2. В самом деле, при условии, что (г) НПТ может выступать в качестве субстратов для РНК и ДНК-полимеразы 3, богатством функциональных групп, включая аминокислоты 4-13, борной кислоты 14,15, nornbornene 16, алмазоида-подобных остатков 17, боковых цепей для органокатализа 18, желчные кислоты 19, и даже 20 олигонуклеотиды могут быть введены в олигонуклеотидов.

_content "> За что составляет удобный вектор для функционализации нуклеиновых кислот, модифицированные дНТФ может заниматься SELEX и других связанных с комбинаторные методы экстракорпорального отбора в для генерации модифицированных каталитических нуклеиновых кислот 21-30 и аптамеров для различных практических приложений 10, 31-36. Дополнительные боковые цепи, которые вводятся путем полимеризации модифицированных дНТФ, как полагают, увеличивает химическую пространство, которое может быть изучены в ходе эксперимента отбора и дополнить довольно плохой функциональный арсенал нуклеиновых кислот 37. Однако, несмотря на эти привлекательные черты и недавний прогресс, достигнутый в разработке синтетических и аналитических методов, нет универсально применимой и высокоурожайный процедура существует для крафта модифицированных нуклеозидтрифосфатов 2,38.

Цель этой Настоящий Протокол, чтобы пролить свет на (иногда) сложные процедуры, ведущие то синтез и биохимические характеристики этих активированных строительных блоков (рис. 1б). Особое внимание будет уделено на всех синтетических деталей, которые часто трудно найти или отсутствуют в экспериментальных участков, но которые еще ​​решающее значение для успешного завершения синтетического пути, ведущие к изоляции чистых (г) НПТ (рис. 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов

Синтетический подход выбран в соответствии с процедурой, разработанной Людвига и Экштейном так как этот метод, как правило, надежны и приводит к очень мало побочных продуктов (рис. 1А) 39.

  1. Coevaporate подходящим образом 3'-OAc-защищенный нуклеозид (как правило, 0,1 ммоль) дважды безводном пиридине (2 мл) и затем сушили под вакуумом в течение ночи. В то же время, сухой трибутиламмонийпирофосфат (0,13 ммоль) под вакуумом в течение ночи.
  2. Растворить нуклеозида в минимальном количестве сухого пиридина (0,2 мл) и добавляют сухом диоксане (0,4 мл) в качестве сорастворителя. Наконец, добавляют 2-хлор-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-он (0,11 ммоль) и дают реагировать при комнатной температуре в течение 45 мин.
    Примечание: Следует отметить, что особое внимание должно быть принято с 2-хлор-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-одного реагента. Действительно, даже хранение этого реагента в атмосфере инертного газа атмосферздесь не является достаточным, чтобы предотвратить его разложение. Таким образом, твердое вещество белого цвета, который образуется в этом разложении можно и нужно соскрести перед использованием.
  3. Готовят раствор трибутиламмонийпирофосфата в сухом ДМФА (0,17 мл) и свежеперегнанный трибутиламин (58 мкл; никогда не добавляют молекулярные сита). Добавить полученного раствора реакционной смеси (появляется белый осадок, но быстро исчезает) и позволяют реагировать при комнатной температуре в течение 45 мин.
  4. Готовят раствор йода (0,16 ммоль) в пиридине (0,98 мл) и H 2 O (20 мкл) и добавляют к реакционной смеси для того, чтобы окислить Ра (III) центр. Разрешить Полученный темный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Используйте 10% водный раствор NaS 2 O 3, чтобы утолить избыток I 2. Растворитель удаляют в вакууме (температура вод ной бане при роторном испарителе должна быть ниже 30 ° С). Добавить H 2 O (5 мл) и позволяют Миxture стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы гидролизовать циклический фрагмент, трифосфат.
  6. На данном этапе, защитные группы обычно удаляются (т.е. 3'-OAc и групп на боковых цепей нуклеоснованием). Следовательно, добавление NH 4 OH (30% в H 2 O, 10 мл) в сырой нефти и перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре, и растворитель удаляют в вакууме.
  7. Добавить 2 мл H 2 O и разбит на 2 трубки. Добавить 12 мл 2%-ным раствором NaClO 4 в ацетоне и центрифуге (1000 мкг) в течение 30 мин. Эту процедуру повторяют еще раз. Это позволяет осадки для разделения растворителей и реагентов, используемых в синтезе от трифосфата (который будет выпадать в осадок), тем самым упрощая вытекающими отсюда очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ существенно.
  8. После воздушной сушки маслянистого остатка, запись 31 P-ЯМР спектр сырого (в соответствии со стандартными процедурами, см. также перечень материалов и фиг.3) ирастворить в 4 мл H 2 O.
    Примечание: Эта методика синтеза главным образом сосредоточена на создании модифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов, но очень подобная процедура может быть применена для их аналоги РНК (просто с помощью 2 ', 3'-бис-О-ацетилированный предшественники).

2. ВЭЖХ Очистка модифицированного нуклеозидтрифосфатов

  1. Приготовление 1 М исходного раствора бикарбоната триэтиламмони (TEAB): 40
    1. Приготовьте раствор 1 моль триэтиламина (139 мл) в ≈ 600 мл дистиллированной и фильтруют H 2 O.
    2. Пузырь CO 2 (через сухого льда и газовой барботером) в раствор при интенсивном перемешивании до рН 7,6 не будет достигнуто (это займет не менее 10 часов). Этот исходный раствор можно хранить в холодильнике в течение до одного месяца.
  2. Очистка:
    1. Приготовьте два буферных растворов от 1 М складе: 2 л 50 мМ TEAB в особо чистой воды (элюент)й 1 л 50 мМ TEAB в 50% MeCN (элюент B). Дега оба элюентов под вакуумом и при перемешивании в течение 20 мин (особое внимание необходимо, чтобы не изменить рН путем удаления СО 2 в процессе дегазации).
    2. Подготовить аналитическую пробу путем растворения 10 мкл неочищенного трифосфата в 300 мкл дистиллированной H 2 O и впрыснуть в ВЭЖХ системе, оснащенной полу-колонки RP (C18) и, используя градиент в диапазоне от 0-100% В в течение 40 мин (рис. 4). Отрегулируйте программу ВЭЖХ в соответствии с R т трифосфата (который, как правило, основной пик на хроматограмме) и дифосфат (который имеет несколько меньшую R T). Очищают сырой смеси с использованием этих условий и, удалив ранние фракции, которые могут содержать некоторые дифосфат.
    3. Смешайте все фракции, содержащие продукт и подвергают сублимационной сухой (который является предпочтительным для испарения на роторном испарителе, чтобы минимизировать гидролиз к нежелательному diphosphели). Coevaporate несколько раз сверхчистой водой (для удаления остатка триэтиламин из элюентов). Оценить чистоту трифосфата методом ЯМР (как 1 H и 31 P ЯМР) и MALDI-TOF применением стандартных протоколов (см. рисунок 5). Типичные выходы, полученные путем применения этого протокола, как правило, лежат в диапазоне 30-70%, в зависимости от субстрата.

3. Грунтовка Реакции расширения и TdT полимеризации

  1. 5'-конец маркировка праймера
    1. Смешайте 30 пмоль соответствующей грунтовкой (например, P1, Перечень материалов) с 4 мкл 10х полинуклеотид-киназы (ПНК) буфера, 3 мкл γ-[32 Р]-АТФ, 1 мкл ПНК и DDH 2 O (для Общий объем реакционной смеси 40 мкл). Инкубируют реакционную смесь при 37 ° С в течение 30 мин и затем термически деактивировать киназу (10 мин при 70 ° С).
    2. Во время маркировки реакции подготовкиколонка Sephadex G10, подключив пипетки на 1 мл с силанизированного стекловолокна и заполнение наконечник с G10 раствора (10% в DDH 2 O, автоклавного). Спином вниз и промыть три раза 500 мкл DDH 2 O и одной заключительной промывки 50 мкл DDH 2 O. Запуск реакционной смеси через G10 (чтобы удалить свободный радиоактивную метку).
    3. Гель очистить (стр. 20%) меченые праймер и восстановить путем применения давке и замочить метод (т.е. вымывание с 500 мкл водного раствора, содержащего 1% LiClO 4 и 1 мм Вес нетто 3 (рН 8) при 72 ° С в течение 15 мин). Этанол осадок и G10 опреснения элюированную олигонуклеотида.
  2. Грунтовка реакция расширение
    1. Отжиг 1 пмоль радиоактивно грунтовки P1, 10 пмоль праймера Р1 и 10 пмоль шаблона T1 (перечень материалов) в 10х реакционного буфера (по данным поставщика полимеразы, которые будут использоваться), поместив тUbe в горячей (90-95 ° С) воде и позволяя постепенно остыть до комнатной температуры (через 45 мин).
    2. Поместите пробирку на льду и добавляют (в свою очередь) коктейль дНТФ (содержащий обе модифицированные природные и трифосфатов, 100 мкМ конечная концентрация) и 1 ед ДНК-полимеразы (Vent (экзо -), Кленова, Pwo или 9 ° N м) и в комплекте с водой (в общем реакционном объеме 20 мкл). Инкубируют при оптимальной рабочей температуры фермента (например, 60 ° C в течение 30 мин при Vent (экзо -) используется).
    3. Добавьте 20 мкл стоп-раствора (формамидном (70%), этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA; 50 ммоль), бромфенол синий (0,1%), ксилолцианола (0,1%)), нагреть образцы (95 ° C, 5 мин), прохладно вниз (0 ° С), и разрешить по денатурации гель-электрофореза в полиакриламидном. Визуализация на Phosphorimager.
  3. Полимеризации TdT
    1. Развести 7 пмоль одноцепочечной, Без маркировки праймер Р2 (Перечень материалов), 1 пмоль радиоактивно грунтовки в 1 мкл TdT буфера 10х.
    2. Поместите пробирку на льду и добавляют (в свою очередь) коктейль дНТФ (при адекватной концентрации, составляющей от 10 до 200 мкм) и TdT-полимеразы (4 U). Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Добавить 10 мкл стоп раствора, нагревать образцы (95 ° C, 5 мин), остыть (0 ° C), и разрешить по денатурации гель-электрофореза в полиакриламидном (стр. 15%). Визуализация на Phosphorimager.

4. ПЦР с модифицированных нуклеозидтрифосфатов

  1. Смешайте 8 пмоль прямого и обратного праймеров с 0,5 пмоль шаблона должен быть усилен. Добавить 10x реакции буфер и коктейль дНТФ (для 200 мкм конечной концентрации) и положить трубку на льду. Добавить 1 U ДНК-полимеразы и в комплекте с H 2 O, чтобы достичь конечного объема 20 мкл. Передача смеси в пробирку PCR и выполнять 30 циклов ПЦР.
  2. Развести 6 мкл с 6 мкл 2х буфера для сахарозы и разрешить по агарозы 2% (окрашивали бромистым этидием) электрофореза. Визуализация на Phosphorimager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Модифицированные нуклеозидтрифосфаты которые заманчивые синтетических целей, так как они позволяют легкому введения огромного массива функциональных групп в нуклеиновых кислот 41. Тем не менее, выделение и характеристика этих активированных блоков часто обнаруживается быть трудным. Следовательно, результаты, показанные здесь, как полагают, обеспечивают руку помощи, чтобы следовать различные шаги в рамках вышеупомянутых синтетических и биохимических процедур (рис. 1б).

В частности, Рисунок 3 показывает типичную сырой 31 P-ЯМР-спектр модифицированной дНТФ (в данном конкретном случае, Ду BPU ТП (4) 18, рис 2), где характерные сигналы фосфора центров можно наблюдать (то есть дублет на -5,02 (Р γ), дублет на -10,44 (P α), и триплет на -20,55 (Р β) частей на миллион). Кроме того, сignals вытекающие для дифосфат (два дублета на -4,84 и -10,63 частей на миллион) и монофосфата (синглетного на -0,18 промилле) побочных продуктов наряду с более высокими фосфатов (сигналов на -21,02 и -23,19 частей на миллион) всегда наблюдаются на данном этапе. Первый ОФ-ВЭЖХ анализ неочищенной смеси показано на рисунке 4 (для Du БПУ ТП (4)), где основной пик (R т = 30,78 мин) соответствует 5'-трифосфат, а главный побочный продукт, 5 '-дифосфат, отображает несколько ниже время удерживания (R т = 30,03 мин). Наконец, после тщательной очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ, модифицированный дНТФ должен быть охарактеризован по данным ЯМР и MALDI-TOF (рис. 5). И 1 H-ЯМР спектры и 31 P-ЯМР имеют решающее значение для оценки чистоты модифицированных дНТФ, так как наличие нежелательных ди-и моно-фосфатов дает отличительные сигналы.

После установления чистоту нуклеозIDE аналог и оценки концентрации исходного раствора либо по массе или УФ-спектроскопии, модифицированный дНТФ могут быть использованы в реакции расширения праймеров с целью оценки его принятия подложка мощности на различных полимераз. 6 иллюстрирует исход реакций удлинени праймера с Du т P ТП (2), Д. А. Hs ТП (6), и постоянного Вал ТП (7) использовать в качестве одиноких модификаций (дорожки 5-7), как комбинации двух модифицированных дНТФ (дорожки 8-10), или вместе вместе с одинокой природного дГТФ (дорожка 11).

Наконец, на рисунке 7 показаны репрезентативные ТДТ-опосредованных реакций полимеризации с различными модифицированных аналогов дУТФ. В этом контексте, Ду С Р ТП (1) и Ду FP ТП (3) являются лучшими субстраты для ТДТ (дорожки 1 и 4), так как эффективность хвостохранилища сопоставимы или превышают естественного дТТФ (дорожка 6). Вместо, Ду BPU ТП (4) (дорожка 5) является довольно плохим субстратом в этом контексте, так как мало полидисперсные больше размера олигонуклеотиды можно наблюдать.

Рисунок 1
Рисунок 1. А) Людвиг-Экстайн подход для синтеза (базы) изменение нуклеозидтрифосфаты 39. B) Схематическое изображение всех шагов, предписанных для синтеза и биохимических характеристик модифицированных дНТФ до их использования в таких приложениях, как SELEX. Щелкните здесь для просмотра увеличить .

"FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 2. Химическая структура модифицированных нуклеозидтрифосфатов: DU С Р ТП (1), Ду т Р ТП (2), Ду FP ТП (3), Ду BPU ТП (4), Ду гостиниц ТП (5), 18 дА Hs TP ( 6), и постоянного Вал ТП (7) 13. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. 31 P-ЯМР-спектр (121 0,4 МГц, D 2 O) из сырой реакционной смеси Du BPU ТП (4). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. ОФ-ВЭЖХ профиль сырой Du BPU ТП (4): 3,5 мл / мин (элюент:: 0-100% элюент B за 40 мин, скорость потока 50 ммоль TEAB в H 2 O; элюент В: 50 мм TEAB в Н 2 O / CH 3 CN (1/1)). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

/ 51385fig5.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 5. Характеристика модифицированного нуклеозидтрифосфата сШ мини TP (5): A) 31 P-ЯМР-спектр (121,4 МГц, D 2 O, 128 сканирований), 18 B) 1 H-ЯМР-спектр (300 МГц, D 2 O, 128 сканирует );. C) MALDI-TOF спектр Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6
Рисунок 6. Представитель гель изображение (стр. 15%) праймеров реакций расширения с различными базовыми изменение дНТФ аналогов Дорожка 1:. Праймеров; дорожка 2: природные дНТФ без дУТФ; полоса 3: природные дНТФ без дАТФ; полоса 4: природные дНТФ без дЦТФ; полоса 5: DU <EM> т Р ТП (2); дорожка 6: Д. Hs ТП (6); дорожка 7: DC Вал ТП (7); полоса 8: Д. Hs ТП (6) и Ду т Р ТП (2); полоса 9: Д. Hs ТП (6) и постоянного тока Вал ТП (7); дорожка 10: DU т Р ТП (2) и постоянного тока Вал ТП (7); полоса 11: DU т Р ТП (2), Д. А. Hs ТП (6), и постоянного Вал ТП (7); полоса 12:. природные дНТФ Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 7Рисунок 7. Гель изображение (стр. 20%) из реакций полимеризации ТДТ с различными базовыми изменение аналогов дУТФ Дорожка 1:. СШ С Р ТП (1); дорожка 2: DU т Р ТП (2); полоса 3: DU гостиниц ТП (5); полоса 4: DU FP ТП (3); полоса 5: DU BPU ТП (4); дорожка 6: дТТФ; дорожка 7: грунтовка. Концентрации:. 10 мкм, 25 мкм, 50 мкм, 75 мкм и 100 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Включение модификаций в нуклеиновые кислоты представляет интерес для многочисленных практических приложений, включая разработку антисмысловых и антигенных агентов 42,43, маркировки и функциональной мечения олигонуклеотидов 41, а также в усилиях по расширению генетический алфавит 44-46. Химические изменения и функциональные группы, как правило, вводят в нуклеиновых кислот путем применения стандартных и автоматизированных протоколов синтеза твердофазных. Тем не менее, фосфорамидита строительные блоки должны быть устойчивыми к довольно жестких условий, налагаемых этой методики, которые в свою очередь накладывает серьезное ограничение на природу химической функциональности 47. Вместо этого, фермент-опосредованной полимеризации модифицированных нуклеозидтрифосфатов позволяет для введения более широкого диапазона функциональных возможностей, поскольку единственным ограничением является то, что они действуют в качестве подложек для полимераз 1,2. Несмотря на то, есть заметное отсутствие поколенияerally применимо методология, надежный и прочный синтетический и аналитические методики были разработаны для синтеза модифицированных дНТФ. Кроме того, из-за присущей им природы, модифицированные трифосфаты весьма чувствительны к различным внешним условиям (например, рН, температуры) и таким образом, Подробный протокол для их синтеза и характеристики является весьма полезным.

Рабочий процесс представлен здесь, включает химический синтез модифицированных дНТФ, очистки ОФ-ВЭЖХ, анализа ЯМР, и ферментативные анализы для биохимического характеристике этих аналогов нуклеозидов. Наиболее критические шаги для успешного синтеза и характеристики модифицированных дНТФ являются анализ неочищенного продукта (по данным ЯМР), ВДЖХ очистка тщательный анализ очищенного материала и выбор соответствующей ДНК (РНК)-полимеразы.

Для синтеза модифицированных дНТФ мы применили метод, разработанный Людвига и EckStein 39, поскольку меньше побочных продуктов образуются по сравнению с другими процедурами, хотя и за счет немного длиннее путь синтеза. Кроме того, очистка ОФ-ВЭЖХ, конечно, представляет собой основную стадию всей синтеза, так как это позволит для разделения нуклеозидных дифосфатов (dNDPs), который часто сильно ингибировать ДНК и РНК-полимеразы 48. После достижения синтеза и очистки, чистота полученного трифосфата должно быть оценено как по данным ЯМР и MALDI-TOF, чтобы ни полимеразной ингибирующих дифосфат нет.

Включение анализа показано на рисунке 6 четко подчеркивает полезность этого подхода. В самом деле, все дНТФ, используемых в этом репрезентативного примера показывают, чтобы быть хорошими субстратами для ДНК-полимеразы (в данном случае Vent (экзо -)), так как не быстрее работает можно было наблюдать полосы, соответствующие более мелкие фрагменты. Бесиды, фермент переносит две подложки, украшенные остатков карбоновой кислоты (Du т Р ТП (3) и постоянного тока Вал ТП (7)) и полимеризации обоих дНТФ результатов в олигонуклеотида, несущего не менее 39 дополнительных отрицательные заряды. Еще одной характерной особенностью является то, что полосы в результате включения модифицированных дНТФ часто демонстрируют медленнее электрофоретической подвижности, чем естественные управления (сравните, например, дорожки 11 и 12). Таким образом, грунтовки реакции расширения представляют собой мощный и в то же простой способ оценки принятие субстрата модифицированных дНТФ.

Кроме того, TdT-опосредованной полимеризации трифосфатов на 3'-концов одноцепочечных олигонуклеотидов заманчиво стратегия для генерации высоко функционализированных 49-52 нуклеиновых кислот. Представитель Пример, показанный на рисунке 7 ясно показывает процедуру селектинаг функциональные, которые переносится Со 2 +-зависимой TdT 53. Действительно, Ду С Р ТП (1) и Ду FP ТП (3), которые оснащены Протеиногенные аминокислоты L-пролина и дипептида α-Phe-Pro, соответственно, самые лучшие субстраты для TdT и породило хвостохранилища эффективности, которые выгодно отличаются от немодифицированного контроля дТТФ, даже при таких низких концентрациях, как 10 мкм (дорожки 1 и 4). Удивительно, но аналог сШ т P TP (2), где остаток пролина подключен к линкерной рукой в транс по сравнению с свободной карбоновой кислоты, не так хорошо, как подложка ее аналога цис-, так полидисперсных больше размера олигонуклеотиды наблюдалось только при более высоких концентрации дНТФ (> 100 мкм, полоса 2). Кроме того, сульфонамидсодержащее изменение дНТФ 5 является умеренным субстратом для TdT и сопоставимы с DU т Р ТП (2) (дорожка 3). Кроме того, Ду BPU ТП (4), который имеет сильное водородных связей отдающего мотив, является довольно плохим субстратом для TdT и реакцию полимеризации, кажется, равнодушным к концентрации модифицированного дНТФ. Таким образом, следующий порядок принятия подложки может быть истолковано на рисунке 7: DU С Р ТП (1), Ду FP ТП (3)> Du т Р ТП (2), Ду гостиниц ТП (5)> Du BPU ТП (4 ).

Наконец, процедура, описанная для реакций полимеризации в условиях ПЦР с использованием модифицированные аналоги довольно похож на вовлечение натуральные дНТФ. Однако, совместимость модифицированных дНТФ с полимераз в этих условиях имеет решающее значение для генерации высокой плотности functionaliZed нуклеиновые кислоты 7, особенно с точки зрения их использования в в пробирке эксперименты отбора.

Таким образом, метод синтеза и характеристики модифицированных нуклеозидтрифосфатов подчеркивалось и создание такого протокола, безусловно, поможет в разработке и крафта новых аналогов. Одновременно, появление таких новых дНТФ будет способствовать поколение функционализованных олигонуклеотидов; В частности, каталитические нуклеиновые кислоты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (гранты N ° PZ00P2_126430 / 1 и PZ00P2_144595). Профессор С. Leumann выражает искреннюю признательность за предоставление лабораторного помещения и оборудование, а также за постоянную поддержку. Г-жа Сью Кнехт признается за плодотворные дискуссии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Tags

Химия выпуск 86 аналоги нуклеиновых кислот биоорганической химии ПЦР грунтовки реакции расширения органического синтеза страницы ВЭЖХ нуклеозидтрифосфаты
Нуклеозидтрифосфатов - от синтеза до биохимической характеризации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hollenstein, M., Smith, C. C.,… More

Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter