Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Abstract

Bir kimyasal fonksiyonelliğin getirilmesi için geleneksel bir strateji olgunlaşmamış zincirine uygun şekilde modifiye edilmiş fosforamidit öncüleri eklenmesi ile katı-faz sentezi kullanılmasıdır. Ancak, oldukça kısa dizilere sentezi ve sınırlama sırasında kullanılan koşullar, bu yöntemin uygulanabilirliğinin engellemektedir. Öte yandan, modifiye edilmiş nükleosit trifosfatlar nükleik asitler, pratik bir uygulama geniş palette modifiye nükleik asitlerin kullanımı için bir yol açıyor bir strateji içine çok sayıda işlevsel grupların sokulması için hafif kullanılmıştır yapı taşları aktive edilir Böyle ribozimlerin ve DNAzimler fonksiyonel etiketleme ve nesil gibi. En önemli sorunlardan biri, bu nükleosid analoglarının izolasyonu ve karakterizasyonu yol açan metodoloji karışıklık bulunur.

Bu ekran yazıda, thes sentezi için detaylı bir protokol mevcute fosfor (III) bazlı reaktifler kullanılarak değiştirilmiş analoglarıdır. Buna ek olarak, onların biyokimyasal karakterizasyonu için prosedür astar uzatma reaksiyonları ve TdT kuyruklanmasız polimerizasyon özel bir vurgu ile, ifşa edilir. Bu ayrıntılı protokol modifiye dNTP işçiliği ve kimyasal biyolojide bunların daha sonraki kullanım için faydalı olacaktır.

Introduction

5'-nükleosit trifosfatlar ((d) NTP'ler) evrensel enerji birimi olmaktan hücre metabolizması düzenleyicileri kadar sayısız işlem ve fonksiyonların katılan önemli bir biyomoleküllerin bir sınıfını temsil eder. Bu temel biyolojik dönüşümler rollerine ilave olarak, bunların modifiye edilmiş oligonükleotidlerin muadilleri olarak işlevsel grupların sokulması için bir çok yönlü ve hafif bir platform, güzel bir şekilde, genellikle 1,2 uygulandığı bir otomasyonlu katı faz sentezini tamamlar bir yöntem olarak gelişmiş var. Gerçekten de, (d) NTP'ler RNA ve DNA polimerazların 3 alt-tabakalar için, amino asitler 4-13, boronik asitler 14,15, nornbornene 16, diamondoid benzeri kalıntıları 17 için, yan zincirler de dahil olmak üzere işlevsel grupların zenginliği olarak hareket edebilir Resim organik kataliz 18, safra asitleri 19 ve hatta 20 oligonükleotidler oligonükleotid içine sokulabilir.

_content "> nükleik asitlerin işlevsellik için uygun bir vektör temsil ötesinde, modifiye edilmiş dNTP, SELEX ve modifiye katalitik nükleik asit 21-30 ve çeşitli pratik uygulamalar için 10 aptamers oluşturulması için in vitro seçimi diğer ilgili kombinasyon yöntemlerinde meşgul olabilir 31-36. modifiye edilmiş dNTP'ler polimerizasyonu tarafından ortaya olan ilave Yan zincirler, bir seçim deney sırasında incelenmiş ve nükleik asitlerin 37'nin oldukça kötü fonksiyonel cephanelik takviye edilebilir kimyasal alanını artırmak düşünülmektedir. Ancak, bu rağmen çekici özellikleri ve sentetik ve analitik yöntemlerin her ikisi de gelişmesinde yapılan son ilerlemeler, evrensel uygulanabilir ve yüksek verimli bir prosedür modifiye nükleosit trifosfat 2,38 işçiliği ihtiyaç vardır.

Bu mevcut protokolün amacı, (bazen) karmaşık prosedürleri önde gelen t içine ışık tutmaktıro sentezi ve bu aktive edilmiş yapı blokları (Şekil 1 B) biyokimyasal karakterizasyonu. Özel vurgu genellikle bulmak zor ya da deneysel bölümlerde bulunmadığına ancak saf (d) NTP'ler izolasyonu (Şekil 1) yol açan sentetik yolunun başarılı bir şekilde tamamlanması için henüz çok önemli olan tüm sentetik ayrıntılar verilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Modifiye nükleosit trifosfatın sentezi

Seçilen sentetik yaklaşım bu yöntem genellikle güvenilir ve çok az yan ürünlerin (Şekil 1A) 39 yol açar beri Ludwig ve Eckstein tarafından geliştirilen prosedürü takip eder.

  1. Iki defa, susuz piridin (2 mi) ile ve daha sonra gece boyunca vakum altında kuru olarak uygun 3'-OAc-korumalı nükleositi (genellikle 0.1 mmol) Coevaporate. Aynı zamanda, bir gece boyunca vakum altında kuru tributilamonyum pirofosfat (0.13 mmol).
  2. Kuru piridin (0.2 mi) bir minimum nükleositi eritin ve bir birlikte-çözücü olarak, kuru dioksan (0.4 ml) ekleyin. Son olarak, 2-kloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0.11 mmol) ekleyin ve 45 dakika için oda sıcaklığında reaksiyona izin verir.
    Not: Bu, özellikle bakım 2-kloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on bir reaktif ile alınması gerektiği dikkat çekicidir. Gerçekten de, bir atıl gaz altında bu hava ortam maddesi içinde bir kullanıcının depolamaBurada da ayrışmasını önlemek için yeterli değildir. Bu nedenle, bu ayrışma oluşturulur bu, beyaz bir katı ve kullanım öncesinde kazınıp gerektiğini açıklar.
  3. Kuru DMF (0.17 mi) içinde tributilamonyum pirofosfat çözeltisi ve taze damıtılmış tributilamin hazırlayın (58 ul; moleküler elekler eklemek hiç). Reaksiyon karışımına (beyaz bir çökelti oluştu fakat hızla kaybolur), elde edilen çözelti ilave edin ve 45 dakika boyunca oda sıcaklığında reaksiyona girmesine izin verir.
  4. Bir iyot çözeltisi piridin (0.16 mmol) (0.98 mi) ve H2O (20 ul) hazırlayın ve (III) 'ün merkezi Pα okside etmek için reaksiyon karışımına ekleyin. Elde edilen koyu renkli çözelti, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karışmaya bırakın.
  5. I 2 fazlalığını gidermek için NAS 2 O 3,% 10 sulu solüsyonu kullanın. Çözücüyü vakum altında çıkarın (döner buharlaştırıcı içinde su banyosunun sıcaklığı, 30 ° C'nin altında tutulmalıdır). H2O (5 mi) ilave edin ve bir mil izinsiklik trifosfat kısmı hidrolize 30 dakika boyunca oda sıcaklığında beklemeye Karışımı soğutun.
  6. Bu aşamada, koruyucu gruplar, genellikle (3'-OAc ve nükleobaz yan zincirler üzerindeki grupların, yani) çıkarılır. Sonuç olarak, ham için NH4 OH (2 H, O, 10 ml içinde% 30) ekleyin ve oda sıcaklığında 1.5 saat karışması ve çözücüyü vakum altında çıkarın.
  7. 2 tüp içine H 2 O ve bölünmüş 2 ml ekleyin. 30 dakika boyunca aseton ve santrifüj (1,000 x g) içinde NaClO 4 arasında bir% 2 çözeltisi 12 ml ilave edilir. Bu prosedür bir kez daha tekrar edilir. Bu çökelme böylece esas olarak takip eden RP-HPLC arıtma basitleştirilmesi, (çökelecektir) trifosfattan sentezinde kullanılan çözücüler ve reaktifler ayrılmaktadır.
  8. Yağlı tortu, hava ile kurutmadan sonra, (standart prosedürler izlenerek Malzemeler ve Şekil 3'ün de listesi bakınız), ham bir 31 P-NMR spektrumunu kaydetme ve4 ml H2O içinde eritildi
    Not: Bu sentezleme prosedürü esas olarak tadil edilmiş deoksinükleosit trifosfat jenerasyonu üzerinde odaklanırken, çok benzer bir prosedür, (sadece, 3'-bis-O-asile ön-maddeleri 2 'kullanılarak) kendi RNA meslektaşları için uygulanabilir.

2. Modifiye nükleosid trifosfatlar HPLC ile saflaştırılması

  1. Trietilamonyum bikarbonat (Teab) bir 1 M stok çözeltisinin hazırlanması: 40
    1. Damıtılmış ve süzüldü H 2 O'dan ≈ 600 ml trietilamin 1 mol (139 mi) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın
    2. Kabarcık CO2 (kuru buz ve bir gaz kabarcık ile) kuvvetli karıştırma altında çözelti içine 7.6 bir pH (bu, en az 10 saat sürer) ulaşana kadar. Bu stok çözeltisi, bir aya kadar buzdolabında muhafaza edilebilir.
  2. Arıtma:
    1. Ultra saf su içinde 50 mM Teab 2 L (eluent A) a: 1 M stok çözelti hazırlayın iki geçici belleknd 50% MeCN (eluent B) 50 mM Teab 1 L. Her iki yıkama sıvıları vakum altında ve 20 dakika boyunca karıştırıldıktan Degas (dikkat ve özen gaz alma sırasında CO2 kaldırarak pH değerini değiştirmek için o kadar olarak gereklidir).
    2. 300 ul damıtılmış H2O içinde ham trifosfat 10 ul eritilerek, bir analitik numune hazırlayın ve bir yarı-hazırlayıcı RP kolonu (C18) ile donatılmış ve değişen bir gradyan kullanılarak, bir HPLC sistemi içine enjekte edilir, 40 dakika içinde% 0-100 B (Şekil 4). Trifosfat R t (genellikle kromatogramda ana pik olan) ve (a biraz daha düşük R t vardır) difosfat göre HPLC programı ayarlayın. Bu koşulları ve bazı difosfat içerebilir ilk fraksiyonlar kaldırarak kullanılarak ham karışım arındırın.
    3. Ürünü içeren tüm fraksiyonlar birleştirilir ve dondurularak kuru (istenmeyen diphosph için hidrolizini minimuma indirmek amacıyla, döner buharlaştırıcı üzerinde buharlaştırma tercih edilir) yedik. (Saflaştırma maddesi kalıntısı trietilamin çıkarmak için) ultra-saf su ile bir kaç kez Coevaporate. NMR ile trifosfat saflığını standart protokoller uygulanmasıyla (1H ve31P NMR her ikisi) ve MALDI-TOF (bkz. Şekil 5) değerlendirmek. Bu protokolün uygulanması ile elde edilen tipik verimler, tipik olarak alt tabakaya bağlı olarak,% 30-70 aralığı içinde yer alır.

3. Primer Uzatma Reaksiyonları ve TdT Polimerizasyon

  1. Primerin 5'-uç etiketleme
    1. Uygun primerin 30 pmol karıştırın (örneğin P1, Malzeme Listesi) 10x polinükleotid kinaz (PNK) tamponu, γ-[32P]-ATP, PNK 1 ul ve GKD 2 O 3 ul için (4 ul 40 ul toplam reaksiyon hacmi). 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve reaksiyon karışımı daha sonra kinaz (70 ° C 'de 10 dakika) ısı devre dışı bırakır.
    2. Etiketleme reaksiyonu sırasında hazırlamaksilanize cam yünü ile 1 ml pipet takıp ve G10 çözeltisi (GKD 2 O içinde% 10, otoklav) ile ucu doldurarak bir Sephadex G10 kolonu. Spin ve 500 ul GKD 2 O ve 50 ul GKD 2 O. ile son bir kez yıkama ile üç kez yıkayın (Serbest radyoaktif etiket çıkarmak için) G10 boyunca reaksiyon karışımının çalıştırın.
    3. Jel (PAGE% 20) radyo-etiketli primer arındırmak ve ezmek uygulanmasıyla kurtarmak ve 15 için 72 ° C'de% 1 LiClO 4 ve 1 mM 3 NEt (pH 8) ihtiva eden sulu bir çözelti ile 500 ul bir yöntem (yani, bir elüsyon emmek dk). Çökelti etanol ve G10 elüt oligonükleotid tuzunun giderilmesi.
  2. Primer uzatma reaksiyonu
    1. Tavlama 1 radyo-etiketli primer P1 pmol, 10 pmol primer P1 ve 10 (kullanılacak polimerazın tedarikçi tarafından sağlanan) 10x reaksiyon tamponu içinde şablon T1 (Malzeme Listesi) pmol t yerleştirerekUbe, sıcak (90-95 ° C) su içinde ve yavaş yavaş (45 dakika boyunca), oda sıcaklığına kadar soğuması için izin verilir.
    2. Buz üzerinde tüp koyun ve (sırayla) dNTP kokteyl ekleyin (değiştirilmiş veya her ikisini de içeren, doğal trifosfatı, 100 uM son konsantrasyon) ve DNA polimeraz 1 U (ekzo (Vent - Klenow, Pwo ya da 9 ° N,) m) ve 20 ul toplam reaksiyon hacmi için, su () ile tam. (-) Kullanılıyor Vent (ekzo 30 dakika boyunca, örneğin 60 ° C) enzim en uygun çalışma sıcaklığında inkübe edin.
    3. Durdurma solüsyonu (formamid (% 70), etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 50 mM), bromofenol mavisi (% 0.1), ksilen siyanol (% 0.1)) 20 ul ekle örnekleri (95 ° C, 5 dakika) ısı, soğuk aşağı (0 ° C), ve denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile çözmek. Fosforimagere canlandırın.
  3. TdT polimerizasyon
    1. Tek şeritli 7 pmol seyreltin, Etiketlenmemiş primer P2 (Malzeme listesi), 1 ul tampon maddesi TdT 10x in radyo-etiketli primerden 1 pmol.
    2. Buz üzerinde tüp koyun ve (sırayla) (10 ve 200 uM arasında bulunan uygun bir konsantrasyonda) dNTP kokteyl ile TdT polimeraz (4 U) ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Stop solüsyonu 10 ul ekleyin örnekleri (95 ° C, 5 dakika) ısıtın, (0 ° C) soğumaya bırakın ve (SAYFA 15%) denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile çözmek. Fosforimagere canlandırın.

4. Modifiye nükleosid trifosfatlar ile PCR

  1. Her ikisi de ileri 8 pmol karıştırın ve amplifiye edilecek şablonun 0.5 pmol ile geri primerler. 10x reaksiyon tamponu ve (200 uM son konsantrasyon) dNTP kokteyl ilave edin ve buz üzerinde tüp koydu. 20 ul bir son hacme ulaşmak için 1 U DNA polimeraz ve H2O ile birlikte ekleyin. PCR şişenin içine karışımı aktarın ve 30 PCR döngüleri yürütmek.
  2. 2x sakaroz yükleme tamponu 6 ul 6 ul seyreltin ve elektroforezi (etidyum bromür ile boyanmış) agaroz ile% 2 çözmek. Fosforimagere canlandırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu nükleik asitler 41 içine işlevsel grupların bir çok dizi kolay sokulması için izin verirse, modifiye nükleosit trifosfatlar sentetik hedefleri çekici edilir. Bununla birlikte, bu aktif yapı bloklarının izolasyonu ve karakterizasyonu genellikle zor olduğu ortaya çıkar. Sonuç olarak, bu tarifnamede gösterilen sonuçlar, belirtilen sentetik ve biyokimyasal işlemler (Şekil 1 B) içinde çeşitli adımları için bir yardım el sağlamak düşünülmektedir.

Özel olarak, Şekil 3, fosfor merkezlerinin karakteristik sinyaller (örneğin bir gözlemlenebilir bir tadil edilmiş dNTP, tipik bir ham P-31 NMR spektrumu (bu özel durumda, dU BPU TP (4) 18, Şekil 2) gösterir, -5,02 (P γ) de eş, -10,44 (P α) bir çifti ve -20,55 (P β) ppm'de bir üçüz). Buna ek olarak, s,Difosfat (-4,84 da iki çiftli ve -10,63 ppm) ve monofosfat (-21,02 de sinyal ve -23,19 ppm), daha yüksek fosfat ile birlikte yan ürünler (-0.18 ppm de tekil) için ignals sırasında oluşan her zaman bu aşamada gözlenir. Ham karışımın bir birinci RP-HPLC analizi sırasında, ana yan ürün, 5 (dU BPU TP (4)), ana peak (Rt = 30.78 dakika), 5'-trifosfat karşılık gelir, Şekil 4 üzerinde gösterilmiştir '-difosfat, biraz daha düşük bir tutma süresi (Rt = 30.03 dakika) gösterir. Son olarak, tam bir RP-HPLC ile arıtma sonucunda, modifiye edilmiş dNTP, NMR ve MALDI-TOF (Şekil 5) ile karakterize edilmesi gerekmektedir. Istenmeyen di-ve mono-fosfatların varlığı farklı sinyaller vermektedir yana 1 'H-NMR ve 31P-NMR spektrumları, modifiye edilmiş dNTP saflığını değerlendirmek için çok önemlidir de.

NUCLEOS saflığını kurduktan sonraide analog ve kütle ile ya da UV spektroskopi ile ya da stok çözeltisi konsantrasyonunu elde etmeyi, modifiye edilmiş dNTP, çeşitli alt-tabaka bir polimeraz tarafından kabul kapasitesini değerlendirmek amacıyla primer uzatma reaksiyonlarında kullanılabilir. 6 primer uzatma reaksiyonları sonucunu göstermektedir Şekil dU t P TP ile (2), dA Hs TP (6) ve akım Val TP (7), iki modifiye edilmiş dNTP'ler (kulvarlar 8-10) kombinasyonları gibi yalnız modifikasyonlar (kuşak 5-7) gibi ya da birlikte kullanılabilir yalnız doğal dGTP (hat 11) ile birlikte.

Son olarak, Şekil 7, farklı tadil edilmiş dUTP analogları ile temsil TdT aracılı polimerizasyon reaksiyonları göstermektedir. Bu bağlamda, dU c P TP (1) ve dU FP TP (3) TdT için en iyi alt tabakalar olan (şerit 1 ve 4) tailing verimleri karşılaştırılabilir olduğu ya da doğal dTTP (hat 6) daha fazla. Biraz daha çok yönlü dağılmış ölçekli oligonükleotitler gözlenebilir tarihi Bunun yerine, dU BPU TP (4) (yol 5) bu bağlamda oldukça kötü bir substrattır.

Şekil 1
Şekil 1. A) (baz sentezi için Ludwig-Eckstein yaklaşımı)) önce bu SELEX gibi uygulamalarda kullanımları ile modifiye edilmiş dNTP'ler sentezi ve biyokimyasal karakterizasyonu için gerekli tüm adımların şematik temsili nükleosid trifosfatlar 39. Tadil edilmiş B. görüntülemek için büyüt .

"Fo: İçerik-width =" "fo: src =" 5in / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 2. DU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3), dU BPU TP (4), dU Kahvaltılar TP (5), 18 dA Hs TP (: değiştirilmiş nükleozid trifosfatlann kimyasal yapıları 6) ve akım Val TP (7) 13. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. 31P-NMR spektrumu (121 .4 MHz, dU BPU TP ham reaksiyon karışımının D 2 O) (4). resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Ham dU BPU TP RP-HPLC profili (4): H 2 O 50 mM Teab; eluent B: 3.5 ml / dk (eluent A: 40 dakika içinde% 0-100 eluent B, akış hızı H 50 mM Teab 2 O / CH 3 CN (1/1)). resmi büyütmek için buraya tıklayın .

/ 51385fig5.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 5,. , 18 B) 1H-NMR spektrumu (300 MHz, D 2 O ', 128 tarama A) 31P-NMR spektrumu (121.4 MHz, D 2 O', 128 tarama): modifiye nükleosit trifosfat dU arasında TP (5) karakterizasyonu ). C) MALDI-TOF spektrumu büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,
Şekil 6,. . Çeşitli baz modifiye edilmiş dNTP analoglarıyla Lane 1 ile primer uzatma reaksiyonları Temsilcisi jel görüntüsü (SAYFA 15%): primer; Şerit 2: dUTP vermeden doğal dNTP; şerit 3: dATP vermeden doğal dNTP; şerit 4: dCTP doğal dNTP; şerit 5: dU <em> t P TP (2); şerit 6: dA Hs TP (6); şerit 7: dC Val TP (7); şerit 8: dA Hs TP (6) ve dU t P TP (2); şerit 9: dA Hs TP (6) ve akım Val TP (7); şerit 10: dU t P TP (2) ve akım Val TP (7); şerit 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6) ve akım Val TP (7); Şerit 12:. doğal dNTPler büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. Çeşitli baz modifiye dUTP analoglarıyla TdT polimerizasyon reaksiyonlarının jel görüntüsü (SAYFA 20%) Lane 1:. DU c P TP (1); Şerit 2: dU t P TP (2); şerit 3: dU İşletmesi TP (5); şerit 4: dU FP TP (3); şerit 5: dU BPU TP (4); şerit 6: dTTP; şerit 7: astar. Konsantrasyonları:. 10 uM, 25 uM, 50 uM, 75 mM ve 100 mM büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nükleik asitlerin içine modifikasyonların dahil antisense ve antijen maddelerin geliştirilmesi 42,43, etiketleme ve oligonükleotidlerin 41 fonksiyonel etiketleme de dahil olmak üzere pek çok pratik uygulamalar için ilgi çekici olan ve genetik alfabe 44-46 genişletmek çabalarında. Kimyasal değişiklikler ve fonksiyonel gruplar genellikle, standart ve otomatik katı faz sentezi protokolleri uygulanmasıyla nükleik asitler dahil edilir. Bununla birlikte, fosforamidit yapı taşları da kimyasal işlevsellik 47 doğası üzerine ciddi bir sınırlama getirir, bu yöntem ile uygulanan oldukça sert koşullarına dayanıklı olması gerekir. Tek kısıtlama da 1,2 polimeraz için substratlar olarak hareket çünkü Bunun yerine, modifiye nükleosit trifosfat enzim aracılı polimerizasyon, işlevleri daha geniş bir aralığının katılmasına olanak sağlamaktadır. Gen gözle görülür bir eksikliği olmasına rağmenerally metodoloji uygulanabilir, güvenilir ve sağlam bir sentetik ve analitik yöntemler modifiye edilmiş dNTP'ler sentezi için geliştirilmiştir. Ayrıca, nedeniyle doğal doğası, modifiye edilmiş trifosfatlar farklı dış koşullar altında (örneğin, pH, sıcaklık) ve bu nedenle, bunların sentezi ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokoldür son derece faydalıdır oldukça duyarlıdır.

Burada sunulan akışı modifiye edilmiş dNTP, kimyasal sentez, RP-HPLC temizlenmesi, NMR analizi, bu nükleosid analoglarının biyokimyasal karakterizasyonu için enzimatik testleri içerir. Modifiye edilmiş dNTP'ler başarılı bir sentezi ve karakterizasyonu için en kritik adım (NMR ile) Ham ürünün analizi, tam HPLC saflaştırma, saf malzeme analizi ve uygun bir DNA (RNA) polimeraz seçimi bulunmaktadır.

Modifiye edilmiş dNTP'ler sentezi için biz Ludwig ve Eck tarafından geliştirilen yöntem uygulandıbiraz daha uzun bir sentetik yol pahasına da olsa, diğer işlemler, ile karşılaştırıldığında daha az yan ürünleri meydana gelirler 39. Stein,. Bundan başka, RP-HPLC temizlenmesi kesinlikle genellikle güçlü bir inhibe DNA ve RNA polimerazlar 48 nükleosid difosfatlar (dNDPs) ayrılması için sağlayacak yana tüm sentetik rotanın önemli bir adımı temsil etmektedir. Sentez ve arıtma elde edildikten sonra, elde edilen trifosfat saflığı no polimeraz inhibe difosfat mevcut olduğundan emin olmak için NMR ve MALDI-TOF ile iki değerlendirilmesi gerekmektedir.

Şekil 6'da gösterilen deney, açık bir şekilde dahil edilmesi, bu yaklaşımın faydasını altını çizmektedir. Herhangi bir hızlı küçük parçalara tekabül eden bantlar gözlenebilir çalışma süresinden - Gerçekten de, bu temsili örnekte kullanılan dNTP Tüm (), bu özel durumda ekzo (Vent) DNA polimerazı için substratlar iyi olduğu ortaya koymaktadır. Besamidler, enzim karboksilik asit artıklarının (dU t P TP (3) ve akım Val TP (7)) ve en az 39, ek bir negatif yük taşıyan bir oligonükleotid iki dNTP sonuç polimerizasyonu ile süslenmiş iki alt-tabakanın tolere eder. Diğer bir dikkat çeken özellik modifiye edilmiş dNTP dahil kaynaklanan grupları genellikle (karşılaştırma örneğin, 11 ve 12 şeritleri), doğal, kontrol grubuna göre daha yavaş bir elektroforetik mobilite görüntülemesidir. Bu nedenle, primer uzatma reaksiyonları, modifiye edilmiş dNTP'ler substrat kabul değerlendirmek için güçlü ve daha basit bir şekilde temsil etmektedir.

Ayrıca, tek sarmallı oligonükleotit 3'-uçlarının üzerinde trifosfatlann TdT aracılı polimerizasyon çok fonksiyonalize edilmiş nükleik asitler 49-52 üretimi için çok çekici bir stratejidir. Şekil 7 'de gösterilen temsili bir örneği açıkça selektin için prosedürü gösterirg Co 2 +-bağımlı TdT 53 tarafından tolere edilir işlevleri. Gerçekten de, dU c P TP (1) ve dU FP TP (3), burada α-Phe-Pro sırasıyla TdT için en iyi alt tabakalar olan proteinojenik amino asit L-prolin ve dipeptid ile donatılmış ve doğurdu edilir hatta 10 uM kadar düşük konsantrasyonlarda, değiştirilmemiş dTTP kontrol üstünlügümüz verimliliği atık (kuşak 1 ve 4). Çok yönlü dağılmış uzun boyutlu oligonükleotitler sadece yüksek gözlenir tarihi Şaşırtıcı bir şekilde, analog dU t P TP (2) proline tortu, serbest karboksilik asit ile karşılaştırıldığında trans olarak bağlayıcı kola bağlı olduğu, kendi cis muadili olarak iyi bir substrat olmadığı dNTP konsantrasyonları (> 100 uM, şerit 2). Ayrıca, modifiye edilmiş dNTP, sülfonamid-5 TdT ve DU karşılaştırılabilir için ortalama olarak bir substrattır t P TP (2) (yol 3). Buna ek olarak, dU BPU TP (4), güçlü bir hidrojen bağı verici motifi taşıyan TdT için oldukça kötü bir substrattır ve polimerizasyon reaksiyonu, modifiye edilmiş dNTP konsantrasyonuna kayıtsız olarak görünüyor. Böylece, alt tabaka kabul aşağıdaki sipariş Şekil 7 tefsir edilebilir: dU c P TP (1), dU FP TP (3)> dU t P TP (2), dU Kahvaltılar TP (5)> dU BPU TP (4 .)

Son olarak, modifiye edilmiş analogları kullanılarak PCR koşulları altında polimerizasyon reaksiyonları için anlatılan prosedür, doğal dNTP içeren edilene oldukça benzer. Bununla birlikte, bu koşullar altında polimeraz ile modifiye edilmiş dNTP uyumluluğu yüksek yoğunluklu functionali jenerasyonu için büyük bir önem taşımaktadırÖzellikle in vitro seçme deneylerde bunların kullanımı ile ilgili olarak zed nükleik asitler, 7.

Özet olarak, modifiye edilmiş nükleosit trifosfatın sentezi ve karakterizasyonu için bir yöntem vurgulanmıştır ve böyle bir protokol kurulması kesinlikle yeni analoglarının geliştirilmesi ve işçiliği de yardımcı olacaktır. Buna bağlı olarak, bu gibi yeni dNTP çıkması işlevselleştirilmiş oligonükleotitlerin üretilmesini kolaylaştıracak; özel olarak, katalitik nükleik asitler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Hibeler n PZ00P2_126430 / 1 ° ve PZ00P2_144595) tarafından desteklenmiştir. Prof C. Leumann minnetle laboratuvar alanı ve ekipman sağlayarak, hem de onun sürekli destek için için kabul edilmektedir. Bayan Sue Knecht verimli tartışmalar için kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Tags

Chemistry Sayı 86 nükleik asit analogları Bioorganic Chemistry PCR primer uzatma reaksiyonları organik sentez PAGE HPLC nükleosid trifosfatlar
Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hollenstein, M., Smith, C. C.,… More

Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter