Summary
Den heri beskrevne protokol har til formål at forklare og forkorte de mange hindringer i vejen for den indviklede rute fører til modificerede nucleosidtriphosphater. Derfor denne protokol letter både syntesen af disse aktiverede byggesten og deres tilgængelighed for praktiske anvendelser.
Abstract
Den traditionelle fremgangsmåde til indførelse af kemiske funktionaliteter er brugen af fastfasesyntese ved at tilføje passende modificeret phosphoramidit forløbere for den spirende kæden. Men de betingelser, der anvendes under syntesen, og begrænsningen til temmelig korte sekvenser hæmmer anvendelsen af denne metode. På den anden side er modificeret nukleosidtriphosphater aktiveret byggesten, der har været ansat i den milde introduktion af talrige funktionelle grupper i nukleinsyrer, en strategi, der baner vejen for brug af modificerede nukleinsyrer i en bred palet af praktiske anvendelser såsom funktionel tagging og generering af ribozymer og DNAzymer. En af de største udfordringer ligger i den indviklet af den metode, der fører til isolering og karakterisering af disse nukleosidanaloger.
I denne video artikel præsenterer vi en detaljeret protokol til syntese af THESe modificerede analoger ved hjælp af phosphor (III)-baserede reagenser. Desuden er proceduren for deres biokemiske karakterisering videregives, med særlig vægt på primerforlængelsesreaktioner og TdT hale polymerisering. Denne detaljerede protokol vil være til nytte for skabelsen af modificerede dNTP'er og deres videre anvendelse i kemisk biologi.
Introduction
5'-nucleosidtriphosphater ((D) NTP) udgør en klasse af vitale biomolekyler, der er involveret i utallige processer og funktioner, der spænder fra at være den universelle valuta af energi til regulatorer af celle metabolisme. Ud over deres rolle i disse fundamentale biologiske forandringer, deres modificerede modstykker avanceret som en alsidig og mild platform for indførelsen af funktionelle grupper i oligonukleotider, en metode, pænt supplerer automatiserede fastfasesyntesen der normalt anvendes 1,2. Forudsat, at de (d) NTP'er kan fungere som substrater for RNA og DNA-polymerase 3, et væld af funktionelle grupper, herunder aminosyrer 4-13, boronsyrer 14,15, nornbornene 16 diamondoid-lignende rester 17, side-kæder til Organocatalysis 18 galdesyrer 19, og endda oligonukleotider 20 kan indføres i oligonukleotider.
_content "> Beyond repræsenterer en bekvem vektor til funktionalisering af nukleinsyrer kan modificerede dNTP'er være engageret i SELEX og andre beslægtede kombinatoriske metoder til in vitro-selektion til generering af modificerede katalytiske nukleinsyrer 21-30 og aptamere til forskellige praktiske anvendelser 10, 31-36. De yderligere sidekæder, der er indført ved polymerisation af de modificerede dNTPs menes at øge den kemiske plads, der kan udforskes i løbet af et valg eksperiment og supplerer temmelig dårlig funktionel arsenal af nukleinsyrer 37. Men trods disse attraktive træk og de seneste fremskridt i udviklingen af både syntetiske og analytiske metoder, ingen universelt anvendelig og højtydende procedure findes for skabelsen af modificerede nucleosidtriphosphater 2,38.Formålet med denne protokol er at kaste lys ind i (undertiden) indviklede procedurer, der fører to syntesen og biokemisk karakterisering af disse aktiverede byggesten (figur 1B). Vil blive lagt særlig vægt på samtlige syntetiske detaljer, som ofte er svære at finde eller er fraværende i eksperimentelle sektioner, men endnu afgørende for en vellykket gennemførelse af den syntetiske vej, der fører til isolation af rene (d) NTP'er (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Syntese af Modified nucleosidtriphosphater
Den syntetiske valgte fremgangsmåde følger proceduren udviklet af Ludwig og Eckstein da denne metode er generelt pålidelige og fører til meget få bivirkninger produkter (figur 1A) 39.
- Coevaporate den passende 3'-OAc-beskyttet nucleosid (typisk 0,1 mmol) to gange med vandfrit pyridin (2 ml) og tør under vakuum natten over. Samtidig, tør tributylammonium-pyrophosphat (0,13 mmol) under vakuum natten over.
- Nukleosidet opløses i et minimum af tør pyridin (0,2 ml), og der tilsættes tør dioxan (0,4 ml) som opløsningsmiddel. Endelig tilsættes 2-chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol), og gør det muligt at reagere ved stuetemperatur i 45 minutter.
Bemærk: Det er bemærkelsesværdigt, at særlig forsigtighed bør tages med 2-chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on reagens. Selv opbevaring af dette reagens under inaktiv gas atmospher er ikke tilstrækkelig til at forhindre nedbrydning. Således det hvide faststof, der dannes i denne nedbrydning kan og bør skrabes før brug. - Forbered en opløsning af tributylammonium pyrophosphat i tørt DMF (0,17 ml) og frisk destilleret tributylamin (58 ul, aldrig tilføje molekylsigter). Læg den resulterende opløsning til reaktionsblandingen (et hvidt bundfald, men forsvinder hurtigt), og gøre det muligt at reagere ved stuetemperatur i 45 minutter.
- Der fremstilles en opløsning af iod (0,16 mmol) i pyridin (0,98 ml) og H2O (20 ul), og der tilsættes til reaktionsblandingen med henblik på at oxidere Pα (III) centrum. Lad den resulterende mørke opløsning omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Anvend en 10% vandig opløsning af NaS 2 O 3 for at standse den overskydende I2. Opløsningsmidlet fjernes under vakuum (skal temperaturen af vandbadet af rotationsfordamperen holdes under 30 ° C). Tilføj H2O (5 ml) og tillade mixture at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter for at hydrolysere den cykliske triphosphat del.
- På dette tidspunkt er de beskyttende grupper fjernes normalt (dvs. 3'-OAc og grupper på kæder af nukleobase side). Følgelig tilsættes NH4OH (30% i H2O, 10 ml) til det rå og omrøres i 1,5 time ved stuetemperatur, og opløsningsmidlet fjernes under vakuum.
- Der tilsættes 2 ml H 2 O og opdelt i 2 rør. Der tilsættes 12 ml af en 2% opløsning af NaClO 4 i acetone og centrifugeres (1.000 xg) i 30 minutter. Denne procedure gentages en gang mere. Denne udfældning giver mulighed for adskillelse af de opløsningsmidler og reagenser, der anvendes i syntesen af triphosphat (som vil præcipitere), hvilket forenkler den efterfølgende RP-HPLC-oprensning betydeligt.
- Efter lufttørring af den olieagtige rest, optage en 31 P-NMR-spektret af rå (efter standardprocedurer, se også liste over materialer og figur 3), ogopløses i 4 ml H2O
Bemærk: Denne syntetisk procedure primært fokuserer på den generation af modificerede deoxynukleosidtriphosphater, men en meget lignende procedure kan anvendes for deres RNA kolleger (ved blot at bruge 2 ', 3'-bis-O-acetylerede forstadier).
2. HPLC Oprensning af Modified nucleosidtriphosphater
- Fremstilling af en 1 M stamopløsning af triethylammoniumbicarbonat (TEAB): 40
- Der fremstilles en opløsning af 1 mol triethylamin (139 ml) i ≈ 600 ml destilleret og filtreret H 2 O.
- Bubble CO 2 (via tøris og gasbobler) ind i opløsningen under kraftig omrøring, indtil en pH-værdi på 7,6 er nået (det vil tage mindst 10 timer). Denne stamopløsning kan opbevares i køleskabet i op til en måned.
- Oprensning:
- Forbered to bufferopløsninger fra 1 M lager: 2 l 50 mM TEAB i ultrarent vand (eluent A) ennd 1 liter 50 mM TEAB i 50% MeCN (eluent B). Afgasse både eluenter under vakuum og omrøring i 20 minutter (omhyggelig opmærksomhed er påkrævet for ikke at ændre pH-værdien ved at fjerne CO 2 under afgasning).
- Forbered en analytisk prøve ved at opløse 10 pi af det rå triphosphat i 300 pi destilleret H2O og tilføre et HPLC-system udstyret med en semi-præparativ RP-søjle (C18) og under anvendelse af en gradient i området fra 0-100% B i 40 min (figur 4). Juster HPLC program i henhold til R-t triphosphat (som normalt er hovedtoppen på kromatogrammet) og diphosphat (som har et lidt lavere Rt). Rens den rå blanding ved hjælp af disse betingelser og ved at fjerne tidlige fraktioner, der kan indeholde nogle diphosphat.
- Kombiner alle de fraktioner, der indeholder produktet og frysetørres (som foretrækkes til fordampning på rotationsinddamperen for at minimere hydrolyse til den uønskede diphosphspiste). Coevaporate flere gange med ultrarent vand (for at fjerne rest triethylamin fra eluenter). Vurdere renheden af trifosfat ved NMR (både 1 time og 31 P-NMR) og MALDI-TOF ved anvendelse af standard-protokoller (se figur 5). Typiske udbytter opnået ved anvendelse af denne protokol, typisk ligge i området 30-70%, afhængig af substratet.
3. Primerforlængelsesreaktioner og TdT Polymerisation
- 5'-ende mærkning af primeren
- Bland 30 pmol af den passende primer (fx P1, liste over materialer) med 4 pi 10x polynucleotidkinase (PNK) buffer, 3 pi γ-[32P]-ATP, 1 pi PNK og ddH2O (for et samlet reaktionsvolumen på 40 ul). Inkuberes reaktionsblandingen ved 37 ° C i 30 minutter og derefter varme-deaktivere kinase (10 minutter ved 70 ° C).
- Under mærkning reaktion forberedeen G10 Sephadex-søjle ved at tilslutte en 1 ml pipettespids med silaniseret glasuld og fylde spidsen med G10-opløsning (10% i ddH2O, autoklaveret). Spin ned og vaskes tre gange med 500 ul ddH2O og en afsluttende vask med 50 ul Hedeselskabet 2 O. Kør reaktionsblandingen gennem G10 (for at fjerne den frie radioaktivt mærke).
- Geloprens (SIDE 20%) den radioaktivt mærkede primer og genvinde ved anvendelse af knuse-og suge-metoden (dvs. eluering med 500 pi af en vandig opløsning indeholdende 1% LiClO 4 og 1 mM NEt3 (pH 8) ved 72 ° C i 15 min). Ethanolpræcipitat og G10 afsalte elueret oligonukleotid.
- Primerforlængelsesreaktion
- Anneal 1 pmol af radioaktivt mærket primer P1, 10 pmol primer P1, og 10 pmol af skabelon T1 (liste over materialer) i 10x reaktion buffer (leveres af leverandøren af polymerase skal anvendes) ved at placere tUbe i varmt (90-95 ° C) vand, og ved at tillade gradvis at køle ned til stuetemperatur (i løbet af 45 min.)
- Sæt røret på is, og der tilsættes (igen) dNTP cocktail (indeholdende både modificerede og naturlige triphosphater, 100 pM slutkoncentration) og 1 U af DNA-polymerase (Vent (exo -), Klenow Pwo eller 9 ° N m) og komplet med vand (til et samlet reaktionsvolumen på 20 ul). Inkuberes ved den optimale arbejdstemperatur for enzymet (f.eks 60 ° C i 30 minutter, når Vent (exo -) bliver brugt).
- Tilsæt 20 gl stopopløsning (formamid (70%), ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 50 mM), bromphenolblåt (0,1%), xylencyanol (0,1%)), opvarmes prøverne (95 ° C, 5 min), afkøles ned (0 ° C), og løse ved denaturerende polyacrylamidgelelektroforese. Visualiser ved phosphorimager.
- TdT polymerisering
- Fortynd 7 pmol af single-strandede, Umærket primer P2 (liste over materialer), 1 pmol af radioaktivt mærket primer i 1 pi TdT-buffer 10x.
- Sæt røret på is, og der tilsættes (igen) dNTP cocktail (ved en passende koncentration mellem 10 og 200 uM) og TdT polymerase (4 U). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Der tilsættes 10 ul af stop-løsning opvarmes prøverne (95 ° C, 5 min), afkøles (0 ° C) og løse ved denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE 15%). Visualiser ved phosphorimager.
4.. PCR med modificerede nucleosidtriphosphater
- Bland 8 pmol både forward og reverse primere med 0,5 pmol template skal amplificeres. Tilføj 10x reaktion buffer og dNTP cocktail (for en 200 uM slutkoncentration) og læg røret på is. Tilsæt 1 U af DNA-polymerase og komplet med H 2 O til at nå et endeligt volumen på 20 ul. Overfør blandingen i en PCR-hætteglas og udføre 30 PCR-cykler.
- Fortynd 6 pi med 6 pi 2x saccharose påsætningsbuffer og løse ved agarose 2% (farvet med ethidiumbromid) elektroforese. Visualiser ved phosphorimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modificerede nucleosidtriphosphater er lokkende syntetiske mål, da de giver mulighed for facile indførelse af en bred vifte af funktionelle grupper i nukleinsyrer 41. Imidlertid er isolering og karakterisering af disse aktiverede byggesten ofte viser sig at være vanskelig. Følgelig er resultaterne vist heri menes at give en hjælpende hånd til at følge de forskellige trin i de førnævnte syntetiske og biokemiske procedurer (figur 1B).
Især Figur 3 viser en typisk rå 31 P-NMR-spektrum af en modificeret dNTP (i dette særlige tilfælde, dU BPU TP (4) 18, figur 2), hvor der kan ses de karakteristiske signaler af fosfor centre (dvs. et dublet ved -5,02 (P γ), en dublet ved -10,44 (P α) og en triplet ved -20,55 (P β) ppm). Desuden erignals følger for difosfat (to dubletter på -4,84 og -10,63 ppm) og monophosphat (singlet ved -0,18 ppm) biprodukter sammen med højere fosfater (signaler på -21,02 og -23,19 ppm) altid overholdes på dette stadium. En første RP-HPLC-analyse af den rå blanding er vist i figur 4 (for dU BPU TP) (4), hvor den primære top (Rt = 30,78 min) svarer til 5'-triphosphat, mens de vigtigste biprodukt, 5 '-diphosphat, viser en lidt lavere retentionstid (Rt = 30,03 min.) Endelig, efter en grundig RP-HPLC-oprensning, skal være kendetegnet ved NMR og MALDI-TOF (figur 5) den modificerede dNTP. Både 1H-NMR og 31 P-NMR-spektre er afgørende for at vurdere renheden af de modificerede dNTPs, da tilstedeværelsen af uønskede di-og mono-fosfater giver markante signaler.
Efter etablering af renheden af nucleoside analog og vurdering af koncentrationen af stamopløsningen enten masse eller ved UV-spektroskopi kan det modificerede dNTP anvendes i primerforlængelsesreaktioner for at vurdere dets substrat accept kapacitet af forskellige polymeraser. Figur 6 illustrerer resultatet af primerforlængelsesreaktioner med dU t P TP (2), dA Hs TP (6), og DC Val TP (7), anvendes enten som enlige modifikationer (bane 5-7), kombinationer af to modificerede dNTPs (bane 8-10), eller sammen sammen med den enlige naturlige dGTP (bane 11).
Endelig viser figur 7 repræsentative TdT-medieret polymerisationsreaktioner med forskellige modificerede dUTP analoger. I denne sammenhæng dU c P TP (1) og dU FP TP (3) er de bedste substrater for TdT (bane 1 og 4), da slaggerbunker effektivitetsgevinster er sammenlignelige eller bedre end de af naturlige dTTP (bane 6). I stedet dU BPU TP (4) (bane 5) er en temmelig dårligt substrat i denne sammenhæng, da lille polydisperse længere mellemstore oligonukleotider kan observeres.
Figur 1. A) Ludwig-Eckstein tilgang til syntese af (basis) modificeret nucleosidtriphosphater 39. B) Skematisk repræsentation af alle de nødvendige skridt for syntesen og biokemisk karakterisering af modificerede dNTPs forud for deres anvendelse i applikationer såsom SELEX. Klik her for at vise større billede .
"Fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Kemiske strukturer af de modificerede nucleosidtriphosphater: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3), dU BPU TP (4), dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), og DC Val TP (7) 13.. Klik her for at se større billede .
Figur 3. 31P-NMR-spektrum (121 .4 MHz, D 2 O) af den rå reaktionsblanding af dU BPU TP (4). Klik her for at se større billede .
Figur 4.. RP-HPLC-profil af råolie dU BPU TP (4): 0-100% eluent B i 40 min, flow rate: 3,5 ml / min (eluent A: 50 mM TEAB i H 2 O; eluent B: 50 mm TEAB i H 2 O / CH3CN (1/1)). Klik her for at se større billede .
/ 51385fig5.jpg "width =" 600px "/>
Figur 5. Karakterisering af den modificerede nucleosidtriphosphat dU B TP (5): A) 31 P-NMR-spektrum (121,4 MHz, D2O, 128 scanninger), 18 B) 1H-NMR-spektrum (300 MHz, D2O, 128 scanninger ). C) MALDI-TOF-spektrum Klik her for at se større billede .
Figur 6. Repræsentative gelbillede (PAGE 15%) af primerforlængelsesreaktioner med forskellige baser modificeret dNTP analoger Bane 1:. Primer; bane 2: naturlige dNTPs uden dUTP; bane 3: naturlige dNTPs uden dATP; bane 4: naturlige dNTPs uden dCTP; bane 5: dU <em> t P TP (2); bane 6: Da Hs TP (6); bane 7: dC Val TP (7); bane 8: Da Hs TP (6) og dU t P TP (2); bane 9: dA Hs TP (6) og DC Val TP (7); bane 10: dU t P TP (2) og dC Val TP (7); bane 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6), og DC Val TP (7); bane 12:. naturlige dNTPs Klik her for at se større billede .
Figur 7. Gelbillede (PAGE 20%) af TdT polymerisationsreaktioner med forskellige baser modificeret dUTP analoger Bane 1:. DU c P TP (1); bane 2: dU t P TP (2); bane 3: dU B TP (5); bane 4: dU FP TP (3); bane 5: dU BPU TP (4.); bane 6: dTTP; bane 7: primer. Koncentrationer:. 10 uM, 25 mM, 50 mM, 75 um og 100 um Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inddragelsen af ændringer i nukleinsyrer er af interesse for mange praktiske anvendelser, herunder udvikling af antisense-og antigenmidler 42,43, mærkning og funktionel tagging af oligonukleotider 41, og i bestræbelserne på at udvide den genetiske alfabet 44-46. Kemiske ændringer og funktionelle grupper er normalt indført i nukleinsyrer ved anvendelse af standard-og automatiserede fastfasesyntese protokoller. Men phosphoramiditfremgangsmåden byggesten har brug for, for at kunne modstå de temmelig barske betingelser, som denne metode, hvilket igen medfører en alvorlig begrænsning på arten af den kemiske funktionalitet 47.. I stedet enzymmedieret polymerisation af modificerede nucleosidtriphosphater muliggør indførelsen af en bredere vifte af funktioner, idet den eneste begrænsning er, at de virker som substrater for polymeraser 1,2. Selv om der er en mærkbar mangel på genrelt gældende metode, pålidelig og robust syntetiske og analytiske metoder er blevet udviklet til syntese af modificerede dNTP'er. Som følge af deres art modificerede triphosphaterne er temmelig følsomme over for forskellige eksterne forhold (f.eks pH, temperatur), og dermed en detaljeret protokol for deres syntese og karakterisering er yderst gavnligt.
Arbejdsgangen præsenteret heri indbefatter kemisk syntese af modificerede dNTP'er RP-HPLC-oprensning, NMR-analyse, og enzymatiske assays for den biokemiske karakterisering af disse nukleosidanaloger. De mest kritiske trin for en vellykket syntese og karakterisering af modificerede dNTP'er er analysen af det rå produkt (ved NMR), den grundige HPLC-oprensning, analyse af det oprensede materiale, og valget af en passende DNA (RNA) polymerase.
Til syntese af de modificerede dNTPs vi anvendt den metode udviklet af Ludwig og Eckstein 39, da færre biprodukter dannes i forhold til andre procedurer, også på bekostning af en lidt længere syntetisk rute. Endvidere RP-HPLC-oprensning bestemt udgør den centrale trin i den samlede syntesevej, da det vil give mulighed for separation af nukleosid diphosphater (dNDPs), som ofte stærkt inhibere DNA og RNA polymeraser 48. Efter opnåelse af syntese og oprensning, renheden af den resulterende triphosphat skal vurderes både ved NMR-og MALDI-TOF at ingen polymerase-inhiberende diphosphat er til stede.
Inkorporeringen assay er vist i figur 6 klart understreger nytten af denne fremgangsmåde. Faktisk alle de dNTP'erne beskæftiget i denne repræsentativt eksempel afsløre at være gode substrater for DNA-polymerase (i dette tilfælde Vent (exo -)), da ikke hurtigere kører bånd svarende til mindre fragmenter kunne observeres. BesIDES, enzymet tolererer to substrater prydet med carboxylsyrerester (dU t P TP (3) og DC Val TP (7)), og polymerisering af både dNTP'er resulterer i en oligonukleotid bærer ikke mindre end 39 yderligere negative ladninger. Et andet slående træk er, at de bånd, der følger af indarbejdelsen af modificerede dNTPs ofte vise langsommere elektroforetiske mobiliteter end de naturlige kontroller (sammenlign f.eks bane 11 og 12). Således repræsenterer primerforlængelsesreaktioner en kraftfuld og alligevel enkel måde at vurdere substratet accept af modificerede dNTP'er.
Desuden TdT-medieret polymerisation af triphosphater på 3'-terminalerne af enkeltstrengede oligonukleotider er en dragende strategi for udvikling af højt funktionaliserede nukleinsyrer 49-52. Det repræsentative eksempel vist i figur 7 viser klart proceduren for selecting de funktionaliteter, der tolereres af Co 2 +-afhængige TdT 53. Faktisk dU c P TP (1) og dU FP TP (3), som er udstyret med den proteinogeniske aminosyren L-prolin og dipeptidet α-Phe-Pro, henholdsvis er de bedste substrater for TdT og gav anledning til hale effektivitetsgevinster, som tåler sammenligning med den umodificerede dTTP kontrol, selv ved koncentrationer så lave som 10 uM (bane 1 og 4). Overraskende, analoge dU t P TP (2), hvor prolinrest er forbundet til linkerarm i trans i forhold til den frie carboxylsyre, er ikke så godt et substrat som dens cis-modstykke, eftersom polydispers længere mellemstore oligonucleotider kun observeres ved højere dNTP-koncentrationer (> 100 uM, bane 2). Endvidere sulfonamid-modificerede dNTP 5 er et moderat substrat for TdT og kan sammenlignes med dU
Endelig fremgangsmåden beskrevet for polymerisationsreaktioner under PCR-betingelser ved anvendelse af de modificerede analoger er temmelig beslægtede med naturlige dNTP'er. Men foreneligheden af modificerede dNTPs med polymeraser under disse betingelser er af afgørende betydning for generation af high-density functionalized nukleinsyrer 7, især med hensyn til deres anvendelse i in vitro-selektion eksperimenter.
Sammenfattende blev metoden for syntese og karakterisering af modificerede nukleosidtriphosphater fremhæves og etableringen af en sådan protokol vil helt sikkert hjælpe i udviklingen og skabelsen af nye analoger. Samtidig vil fremkomsten af sådanne nye dNTPs lette generation af funktionaliserede oligonukleotider; især katalytiske nukleinsyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (Tilskud n ° PZ00P2_126430 / 1 og PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann er modtaget med tak for at give laboratoriet plads og udstyr, samt for hans konstante støtte. Sue Knecht er anerkendt for frugtbare diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
|||
References
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
- Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
- Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
- Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
- Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
- Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
- Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
- Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
- Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
- Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
- Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
- Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
- Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
- Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
- Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
- Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
- Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
- Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
- Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
- Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
- Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
- Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
- Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
- Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
- Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
- Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
- Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
- Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
- Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
- Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
- Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
- Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
- Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
- Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
- Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
- Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
- Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
- Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
- Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
- Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
- Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
- Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
- Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
- Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
- Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
- Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
- Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
