Summary
De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.
Abstract
De traditionele strategie voor de introductie van chemische functionaliteiten is het gebruik van vaste-fase synthese door het toevoegen van geschikte gemodificeerde fosforamidiet precursors naar het ontluikende keten. Echter, de gebruikte tijdens de synthese en de beperking tot vrij korte sequenties omstandigheden belemmeren de toepasbaarheid van deze methodiek. Anderzijds worden gemodificeerd nucleoside trifosfaten geactiveerd bouwstenen die zijn gebruikt voor de licht invoering van talrijke functionele groepen in nucleïnezuren, een strategie die de weg vrijmaakt voor het gebruik van gemodificeerde nucleïnezuren in een breed palet van praktische toepassingen zoals functionele tagging en genereren van ribozymen en DNAzymen. Een van de grote uitdagingen bevindt in de complexiteit van de methode leidt tot de isolatie en karakterisering van deze nucleoside analogen.
In deze video artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de synthese van These gemodificeerde analogen met fosfor (III)-gebaseerde reagentia. Bovendien is de procedure voor de biochemische karakterisatie openbaar gemaakt, met bijzondere aandacht voor primerverlengingsreacties en TdT tailing polymerisatie. Deze gedetailleerde protocol zal van nut zijn voor het vervaardigen van gemodificeerde dNTPs en het gebruik daarvan in de chemische biologie.
Introduction
5'-nucleoside trifosfaten ((d) NTP's) vormen een klasse van belangrijke biomoleculen die betrokken zijn bij talloze processen en functies vinden dat de universele valuta van energie regelaars van celmetabolisme. Naast hun rol in deze fundamentele biologische veranderingen, hun gemodificeerde tegenhangers geavanceerd als veelzijdig en milde platform voor de introductie van functionele groepen in oligonucleotiden, een methodologie die goed vult de geautomatiseerde vaste-fase synthese die meestal wordt toegepast 1,2. Inderdaad, mits de (d) NTP's kunnen als substraten voor RNA en DNA polymerasen 3, een schat aan functionele groepen zoals aminozuren 4-13, boorzuren 14,15 nornbornene 16, diamondoid-achtige residuen 17, zijketens voor Organokatalyse 18, galzuren 19 en zelfs 20 oligonucleotiden kunnen worden geïntroduceerd in oligonucleotiden.
_content "> Voorbij die een geschikte vector voor de functionalisering van nucleïnezuren kunnen gemodificeerd dNTP worden betrokken bij SELEX en andere verwante combinatorische werkwijzen voor in vitro selectie voor het genereren van gemodificeerde katalytische nucleïnezuren 21-30 en aptameren voor verschillende praktische toepassingen 10, 31-36. De extra zij ketens die worden geïntroduceerd door de polymerisatie van de gemodificeerde dNTP's worden beschouwd als de chemische ruimte die kunnen worden onderzocht in een selectie-experiment en vult de vrij slechte functionele arsenaal van nucleïnezuren 37 verhogen. Ondanks deze aantrekkelijke eigenschappen en de recente vooruitgang in de ontwikkeling van zowel synthetische en analytische methoden, geen universeel toepasbaar en hoogrentende procedure bestaat voor het vervaardigen van gemodificeerde nucleosidetrifosfaten 2,38.Het doel van deze huidige protocol is licht te werpen op de (soms) ingewikkelde procedures die to de synthese en biochemische karakterisatie van deze geactiveerde bouwstenen (Figuur 1B). Speciale aandacht zal worden gegeven op alle synthetische details die vaak moeilijk te vinden zijn of afwezig zijn in de experimentele afdelingen maar nog cruciaal voor de succesvolle afronding van de synthetische weg die leidt tot de isolatie van zuiver (d) NTP's (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van de Modified nucleosidetrifosfaten
De synthetische aanpak gekozen volgt de procedure ontwikkeld door Ludwig en Eckstein, aangezien deze methode over het algemeen betrouwbaar en leidt tot zeer weinig bijwerkingen-producten (Figuur 1A) 39.
- Coevaporate de geschikte 3'-OAc-beschermde nucleoside (typisch 0,1 mmol) tweemaal met watervrij pyridine (2 ml) en vervolgens drogen onder vacuüm gedurende de nacht. Tegelijkertijd, droge tributylammonium pyrofosfaat (0,13 mmol) onder vacuüm gedurende de nacht.
- Los het nucleoside in een minimale droge pyridine (0,2 ml) en voeg droge dioxaan (0,4 ml) als hulpoplosmiddel. Voeg als 2-chloor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) en laten reageren bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
Opmerking: Het is opmerkelijk dat bijzondere aandacht moet worden genomen met de 2-chloor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-een reagens. Sterker nog, zelfs de opslag van dit reagens onder een inert gas atmosphier niet voldoende is om de ontleding te voorkomen. Aldus, de witte vaste stof die wordt gevormd in deze ontwikkeling kan en moet worden afgeschraapt voor gebruik. - Bereid een oplossing van tributylammonium pyrofosfaat in droge DMF (0,17 ml) en vers gedestilleerd tributylamine (58 pl; nooit toe moleculaire zeven). Voeg de resulterende oplossing aan het reactiemengsel (een wit neerslag verschijnt maar snel verdwijnt) en laten reageren bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
- Bereid een oplossing van jood (0,16 mmol) in pyridine (0,98 ml) en H2O (20 pl) en voeg toe aan het reactiemengsel teneinde oxideren Pα (III) centrum. Laat de verkregen donkerrode oplossing geroerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Gebruik een 10% oplossing van NaS 2 O 3 om de overmaat I 2 blussen. Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm (de temperatuur van het waterbad van de roterende verdamper wordt onder 30 ° C gehouden). H 2 O (5 ml) toe te voegen en laat de mixture bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten staan om de cyclische trifosfaat groep hydrolyseren.
- In dit stadium worden de beschermende groepen meestal verwijderd (de 3'-OAc en groepen op de zijketens van de nucleobase). Bijgevolg voeg NH4OH (30% in H2O, 10 ml) om het ruwe en roer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd, en verwijder het oplosmiddel onder vacuüm.
- Voeg 2 ml H 2 O en opgesplitst in 2 buizen. Voeg 12 ml van een 2% oplossing van NaClO 4 in aceton en gecentrifugeerd (1000 x g) gedurende 30 minuten. Deze procedure herhaalt zich nog een keer. Dit neerslag kan voor de scheiding van de oplosmiddelen en reagentia die bij de synthese van de trifosfaat (die precipiteren), waardoor vereenvoudiging van de daaropvolgende RP-HPLC zuivering aanzienlijk.
- Na droging aan de lucht van de olieachtige residu, het opnemen van een 31P-NMR-spectrum van het ruwe (volgens standaardprocedures, zie ook Lijst van Materialen en figuur 3) enoplossen in 4 ml H2O
Opmerking: Deze synthetische procedure richt zich voornamelijk op de productie van gemodificeerde desoxynucleosidetrifosfaten, maar een zeer gelijkaardige procedure kan worden toegepast voor hun RNA tegenhangers (door simpelweg met 2 ', 3'-bis-O-geacetyleerd voorlopers).
2. HPLC Zuivering van de Modified nucleosidetrifosfaten
- Bereiding van een 1 M voorraadoplossing van triethylammoniumbicarbonaat (TEAB): 40
- Bereid een oplossing van 1 mol triethylamine (139 ml) bij ≈ 600 ml gedestilleerd en gefiltreerd H2O
- Bubble CO 2 (via droogijs en een gas bubbler) in de oplossing onder krachtig roeren tot een pH van 7,6 is bereikt (dit ten minste 10 uur duren). Deze voorraadoplossing kan in de koelkast worden bewaard tot een maand.
- Zuivering:
- Bereid twee bufferoplossingen van de 1 M voorraad: 2 L van 50 mM TEAB in ultrapuur water (eluens A) eennd 1 liter 50 mM TEAB in 50% MeCN (eluens B). Ontgas beide eluaten onder vacuüm en roeren gedurende 20 min (aandacht vereist teneinde de pH niet te wijzigen door CO2 te verwijderen tijdens ontgassing).
- Bereid een analytisch monster door het oplossen van 10 ul van de ruwe trifosfaat in 300 pl gedestilleerd H2O en injecteren in een HPLC systeem uitgerust met een semi-preparatieve RP-kolom (C18) en met een gradiënt variërend van 0-100% B in 40 min (Figuur 4). Stel de HPLC programma overeenkomstig de Rt van de trifosfaat (die meestal de hoofdpiek op het chromatogram) en difosfaat (die een iets lagere Rt is). Zuiver het ruwe mengsel met behulp van deze voorwaarden en door het verwijderen van de vroege fracties dat sommige difosfaat kunnen bevatten.
- Combineer alle fracties die het product bevatten en vriesdrogen (die de voorkeur verdamping op de roterende verdamper om hydrolyse te minimaliseren ongewenste diphosphaten). Coevaporate meerdere malen met ultrapuur water (om overblijfsel triethylamine verwijderen uit de eluenten). Beoordeel de zuiverheid van het trifosfaat door NMR (zowel 1H en 31P NMR) en MALDI-TOF door toepassing van standaard protocollen (zie figuur 5). Typische opbrengsten verkregen door toepassing van dit protocol kenmerkend liggen in het traject van 30-70%, afhankelijk van de ondergrond.
3. Primerverlengingsreacties en TdT Polymerisatie
- 5'-uiteinde van de primer labeling
- Meng 30 pmol van de juiste primer (bijv. P1, lijst van materialen) met 4 pi 10x polynucleotidekinase (PNK) buffer, 3 pl γ-[32P]-ATP, 1 ui PNK en DDH 2 O (voor een totaal reactievolume van 40 pi). Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 30 min en vervolgens warmte deactiveren kinase (10 min bij 70 ° C).
- Tijdens de labelingsreactie voorbereidingeen column G10 Sephadex door de stekker een 1 ml pipet tip met gesilaneerde glaswol en het vullen van de tip met G10-oplossing (10% in DDH 2 O, geautoclaveerd). Spin down en was driemaal met 500 ul DDH 2 O en een laatste wasbeurt met 50 ul DDH 2 O. Voer het reactiemengsel door de G10 (de vrije radioactieve label te verwijderen).
- Gel zuiveren (PAGE 20%) het radioactief gemerkte primer en herstellen door toepassing van de crush en geniet werkwijze (bijvoorbeeld elutie met 500 ul van een waterige oplossing die 1% LiClO 4 en 1 mM NEt3 (pH 8) bij 72 ° C gedurende 15 min). Ethanol neerslag en G10 ontzouten de geëlueerd oligonucleotide.
- Primerverlengingsreactie
- Anneal 1 pmol van radioactief gelabelde primer P1, 10 pmol primer P1, en 10 pmol template T1 (Lijst van Materialen) in 10x reactie buffer (geleverd door de leverancier van de polymerase te gebruiken) door het plaatsen van de tube in heet (90-95 ° C) water en doordat geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur (meer dan 45 min).
- Zet de tube op ijs en voeg (op zijn beurt) de dNTP cocktail (die zowel de gewijzigde en de natuurlijke trifosfaten, 100 uM uiteindelijke concentratie) en 1 U van het DNA-polymerase (Vent (exo -), Klenow, Pwo of 9 ° N m) en compleet met water (voor een totaal reactievolume van 20 pi). Incubeer bij de optimale werktemperatuur van het enzym (bv. 60 ° C gedurende 30 min bij Vent (exo -) wordt gebruikt).
- Voeg 20 gl stopoplossing (formamide (70%), ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 50 mM), broomfenol blauw (0,1%), xyleencyanol (0,1%)), verhit de monsters (95 ° C, 5 min), koel omlaag (0 ° C) en lossen denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Visualiseren door fosforimager.
- TdT polymerisatie
- Verdunnen 7 pmol van enkelstrengs, Ongelabelde primer P2 (Lijst van Materialen), 1 pmol van radioactief gelabelde primer in 1 pl TdT buffer 10x.
- Zet de tube op ijs en voeg (op zijn beurt) de dNTP cocktail (op een voldoende concentratie tussen 10 en 200 uM) en de TdT polymerase (4 U). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 10 ul van de stopoplossing, verwarm de monsters (95 ° C, 5 min), afgekoeld (0 ° C) en lossen door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE 15%). Visualiseren door fosforimager.
4. PCR met Gewijzigde nucleosidetrifosfaten
- Mix 8 pmol van zowel de voorwaartse en achterwaartse primers met 0,5 pmol van de template te amplificeren. Voeg 10x reaction buffer en de dNTP cocktail (voor een 200 uM uiteindelijke concentratie) en plaats de buis op ijs. Voeg 1 U van het DNA polymerase en compleet met H2O tot een eindvolume van 20 pl te bereiken. Breng het mengsel in een PCR flesje en uitvoeren 30 PCR cycli.
- Verdun 6 pl met 6 pi 2x sucrose laadbuffer en lossen 2% agarose (gekleurd met ethidiumbromide) elektroforese. Visualiseren door fosforimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gemodificeerde nucleosidetrifosfaten zijn verleidelijke synthetische doelen, omdat zij zorgen voor de gemakkelijke invoering van een breed scala van functionele groepen in nucleïnezuren 41. Echter, de isolatie en karakterisering van deze geactiveerde bouwstenen vaak lastig blijkt te zijn. Bijgevolg is de hierin getoonde resultaten worden verondersteld om een helpende hand te bieden aan de verschillende stappen binnen de genoemde synthetische en biochemische procedures (Figuur 1B) te volgen.
In het bijzonder toont figuur 3 een typisch ruw 31P-NMR spectrum van een gemodificeerd dNTP (in dit geval, dU BPU TP (4) 18, figuur 2), waarbij de kenmerkende signalen van de fosfor centra worden waargenomen (dwz doublet bij -5,02 (P γ), een doublet bij -10,44 (P α) en een triplet bij -20,55 (P β) ppm). Bovendien isignals gevolg van het difosfaat (twee doubletten bij -4,84 en -10,63 dpm) en monofosfaat (singlet bij -0,18 ppm) bijproducten samen met hogere fosfaten (signalen bij -21,02 en -23,19 dpm) worden altijd waargenomen in dit stadium. Een eerste RP-HPLC analyse van het ruwe mengsel wordt getoond in Figuur 4 (van Du BPU TP (4)) waarbij de hoofdpiek (Rt = 30,78 min) overeenkomt met de 5'-trifosfaat, terwijl de belangrijkste bijproduct, de 5 '-difosfaat, geeft een iets lagere retentietijd (R t = 30.03 min.). Uiteindelijk, na een grondige RP-HPLC zuivering, de gemodificeerde dNTP moet worden gekarakteriseerd met NMR en MALDI-TOF (Figuur 5). Zowel de 1H-NMR en 31P-NMR-spectra zijn cruciaal voor de beoordeling van de zuiverheid van de gemodificeerde dNTP, aangezien de aanwezigheid van ongewenste di-en mono-fosfaten geeft herkenningsseinen.
Na vaststelling van de zuiverheid van de nucleosideanalogen en beoordeling van de concentratie van de voorraadoplossing hetzij volgens gewicht of UV-spectroscopie, kan de gemodificeerde dNTP worden gebruikt primerverlengingsreacties teneinde het substraat aanvaarden capaciteit te bepalen van verschillende polymerasen. Figuur 6 illustreert de resultaten van primerverlengingsreacties met dU Tp TP (2), dA Hs TP (6), en dC Val TP (7) gebruikt als enige modificaties (lanen 5-7), als combinaties van twee gemodificeerde dNTPs (lanen 8-10), of samen samen met de eenzame natuurlijke dGTP (baan 11).
Tenslotte toont figuur 7 representatieve TdT-gemedieerde polymerisatie reacties met verschillende gemodificeerde dUTP analogen. In dit verband dU c P TP (1) en dU FP TP (3) zijn de beste substraten voor TdT (lanen 1 en 4), omdat de staart efficiëntie vergelijkbaar of hoger zijn dan die van de natuurlijke dTTP (baan 6). In plaats daarvan, dU BPU TP (4) (laan 5) een vrij slechte substraat in dit verband omdat kleine polydisperse langer formaat oligonucleotiden kunnen worden waargenomen.
Figuur 1. A) Ludwig-Eckstein benadering voor de synthese van (basis) gemodificeerd nucleoside trifosfaten 39 B.) Schematische weergave van de stappen die nodig zijn voor de synthese en biochemische karakterisering van gemodificeerde dNTP vóór het gebruik in toepassingen zoals SELEX. Klik hier om te bekijken Afbeelding vergroten .
"Fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 2. Chemische structuren van het gemodificeerde nucleoside trifosfaten: dU c P TP (1), dU Tp TP (2), dU FP TP (3), dU BPU TP (4), dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), en dC Val TP (7) 13. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. 31P-NMR spectrum (121 0,4 MHz, D 2 O) van het ruwe reactiemengsel van dU BPU TP (4). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. RP-HPLC-profiel van ruw dU BPU TP (4): 0-100% eluens B in 40 min, stroomsnelheid: 3,5 ml / min (elutiemiddel A: 50 mM TEAB in H2O, eluent B: 50 mM TEAB in H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Klik hier voor grotere afbeelding .
/ 51385fig5.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 5. Karakterisering van het gemodificeerde nucleoside trifosfaat dU B TP (5): A) 31P-NMR spectrum (121,4 MHz, D2O, 128 scans), 18 B) 1H-NMR spectrum (300 MHz, D 2 O, 128 scans );. C) MALDI-TOF spectrum Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Beeld Representatieve gel (PAGE 15%) van primerverlengingsreacties met verschillende basegemodificeerde dNTP-analogen Lane 1:. Primer; laan 2: natuurlijke dNTPs zonder dUTP; laan 3: natuurlijke dNTPs zonder dATP; laan 4: natuurlijke dNTPs zonder dCTP; laan 5: dU <em> t P TP (2); laan 6: dA Hs TP (6); laan 7: DC Val TP (7); laan 8: dA Hs TP (6) en dU t P TP (2); laan 9: dA Hs TP (6) en dC Val TP (7); laan 10: dU t P TP (2) en dC Val TP (7); laan 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6), en dC Val TP (7); laan 12:. natuurlijke dNTPs Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 7. Beeld gel (PAGE 20%) van de TdT polymerisatiereacties met verschillende basegemodificeerde dUTP analogen Lane 1:. DU c P TP (1); laan 2: dU t P TP (2); laan 3: dU B TP (5); laan 4: dU FP TP (3); laan 5: dU BPU TP (4); laan 6: dTTP; laan 7: primer. Concentraties:. 10 uM, 25 uM, 50 uM, 75 uM, en 100 uM Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De opname van veranderingen in nucleïnezuren van belang voor tal van praktische toepassingen waaronder de ontwikkeling van antisense en antigeen middelen 42,43, etikettering en functionele tagging oligonucleotiden 41, en pogingen om de genetische alfabet 44-46 breiden. Chemische veranderingen en functionele groepen zijn meestal ingebracht in nucleïnezuren door toepassing van standaard en geautomatiseerde vaste-fase synthese protocollen. Echter, de fosforamidiet bouwblokken bestand tegen de nogal ruwe voorwaarden van deze methode, die op zijn beurt legt een strenge beperking op de aard van de chemische functionele 47 zijn. In plaats daarvan, het enzym gemedieerde polymerisatie gemodificeerd nucleoside trifosfaten mogelijk maakt de invoering van een breder scala van functies, aangezien de enige beperking is dat zij als substraat voor polymerasen 1,2. Ook al is er een merkbaar gebrek aan genmeen passen methodiek, betrouwbaar en robuust synthetische en analytische methoden ontwikkeld voor de synthese van gemodificeerde dNTPs. Bovendien, vanwege hun aard, bewerkt trifosfaten nogal gevoelig voor verschillende externe omstandigheden (bijvoorbeeld pH, temperatuur) en dus een gedetailleerd protocol voor de synthese en karakterisatie is zeer gunstig.
De hierin gepresenteerde workflow omvat de chemische synthese van gemodificeerde dNTP, RP-HPLC zuivering, NMR analyse en enzymatische assays voor de biochemische eigenschappen van deze nucleoside analogen. De meest kritische stappen voor een succesvolle synthese en karakterisering van gemodificeerde dNTP zijn de analyse van het ruwe product (via NMR), de grondige HPLC zuivering, de analyse van het gezuiverde materiaal en keuze van een geschikte DNA (RNA) polymerase.
Voor de synthese van de gemodificeerde dNTP pasten wij de methode ontwikkeld door Ludwig en Eckstein 39, omdat minder bijproducten worden gevormd in vergelijking met andere procedures, zij het ten koste van een iets langere syntheseroute. Bovendien is de RP-HPLC zuivering vertegenwoordigt zeker cruciale stap van het gehele synthetische route sinds het laat de scheiding van de nucleoside difosfaten (dNDPs) die vaak sterk remmen DNA en RNA polymerasen 48. Na het bereiken van de synthese en zuivering, de zuiverheid van het verkregen trifosfaat moet worden beoordeeld zowel NMR en MALDI-TOF zodat geen-polymerase remmen difosfaat aanwezig is.
De opname assay figuur 6 onderstreept duidelijk de bruikbaarheid van deze benadering. Inderdaad, alle dNTP's gebruikt in deze representatief voorbeeld openbaren goede substraten voor het DNA polymerase (in dit geval Vent (exo -)) aangezien niet sneller lopen banden die overeenkomen met kleinere fragmenten worden waargenomen. Besides, het enzym verdraagt twee substraten versierd met carboxylzuurresten (Du t P TP (3) en dC Val TP (7)) en de polymerisatie van zowel dNTPs resultaten in een oligonucleotide waarop niet minder dan 39 extra negatieve ladingen. Een ander opvallend kenmerk is dat de banden door de incorporatie van gemodificeerde dNTPs vaak langzamer elektroforetische mobiliteiten weergegeven dan de natuurlijke controles (vergelijk bijvoorbeeld lanen 11 en 12). Aldus primerverlengingsreacties vormen een krachtige en toch eenvoudige manier om het substraat aanvaarden van gemodificeerde dNTP beoordelen.
Bovendien is de TdT-gemedieerde polymerisatie van trifosfaten aan het 3'-uiteinden van enkelstrengs oligonucleotiden is een aantrekkelijke strategie voor het genereren van sterk gefunctionaliseerde nucleïnezuren 49-52. De representatief voorbeeld getoond in figuur 7 toont duidelijk de wijze selectineg de functionaliteiten die worden getolereerd door de Co 2 +-afhankelijke TdT 53. Inderdaad, dU c P TP (1) en dU FP TP (3), die zijn uitgerust met de proteinogenic aminozuur L-proline en het dipeptide α-Phe-Pro, respectievelijk zijn de beste substraten voor de TdT en aanleiding gaf tot tailing efficiëntie die gunstig vergelijken met de ongemodificeerde dTTP controle, zelfs bij concentraties zo laag als 10 uM (lanen 1 en 4). Verrassend, analoog dU t P TP (2) indien het proline residu is verbonden met de koppelarm in trans ten opzichte van het vrije carbonzuur, niet zo goed substraat als cis tegenhanger sinds polydisperse langer formaat oligonucleotiden alleen waargenomen bij hogere dNTP concentraties (> 100 uM, laan 2). Bovendien is de sulfonamide-gemodificeerde dNTP 5 is een gematigd substraat voor TdT en vergelijkbaar dU
Ten slotte beschreven polymerisatiereacties onder PCR-omstandigheden met de gemodificeerde analogen procedure is eerder lijken op de zaak natuurlijke dNTPs. Echter, de compatibiliteit van gemodificeerde dNTPs met polymerase onder deze omstandigheden is van cruciaal belang voor de generatie van high-density functionaliteitenzed nucleïnezuren 7, vooral met betrekking tot hun gebruik in in vitro selectie-experimenten.
Kortom, de methode voor de synthese en karakterisering van gemodificeerde nucleosidetrifosfaten werd benadrukt en de oprichting van een dergelijk protocol zal zeker helpen bij het ontwikkelen en vervaardigen van nieuwe analogen. Daarmee samenhangend zal de opkomst van dergelijke nieuwe dNTPs de generatie van gefunctionaliseerde oligonucleotiden te vergemakkelijken; bijzonder katalytische nucleïnezuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (Subsidies n ° PZ00P2_126430 / 1 en PZ00P2_144595). Prof C. Leumann wordt hartelijk bedankt voor het verstrekken van het lab ruimte en apparatuur, evenals voor zijn voortdurende steun. Ms Sue Knecht is erkend voor vruchtbare discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
|||
References
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
- Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
- Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
- Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
- Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
- Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
- Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
- Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
- Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
- Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
- Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
- Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
- Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
- Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
- Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
- Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
- Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
- Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
- Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
- Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
- Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
- Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
- Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
- Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
- Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
- Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
- Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
- Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
- Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
- Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
- Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
- Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
- Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
- Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
- Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
- Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
- Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
- Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
- Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
- Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
- Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
- Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
- Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
- Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
- Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
- Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
- Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
