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Chemistry

न्यूक्लीओसाइड Triphosphates - संश्लेषण से बायोकेमिकल विशेषता को

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

यहाँ बताया प्रोटोकॉल संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates के लिए प्रमुख जटिल मार्ग के रास्ते में कई बाधाएं समझा और संक्षेपण करना है. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल इन सक्रिय इमारत ब्लॉक के संश्लेषण और व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए उनकी उपलब्धता दोनों की सुविधा.

Abstract

रासायनिक functionalities के परिचय के लिए पारंपरिक रणनीति नवजात श्रृंखला के लिए उपयुक्त संशोधन phosphoramidite व्यापारियों जोड़कर ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग है. हालांकि, बल्कि कम दृश्यों के लिए संश्लेषण और प्रतिबंध के दौरान इस्तेमाल की स्थिति में इस पद्धति के लागू बाधा हैं. दूसरी ओर, संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates न्यूक्लिक एसिड, व्यावहारिक अनुप्रयोगों के एक व्यापक पैलेट में संशोधित न्यूक्लिक एसिड के उपयोग के लिए मार्ग प्रशस्त कि एक रणनीति में कई कार्य समूहों के हल्के परिचय के लिए नियोजित किया गया है कि इमारत ब्लॉकों सक्रिय कर रहे हैं ऐसे ribozymes और DNAzymes के कार्यात्मक टैगिंग और पीढ़ी के रूप में. प्रमुख चुनौतियों में से एक इन न्यूक्लीओसाइड analogues के अलगाव और लक्षण वर्णन करने के लिए अग्रणी पद्धति की जटिलता में रहता है.

इस वीडियो लेख में, हम thes के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेशई फॉस्फोरस (तृतीय) आधारित अभिकर्मकों का उपयोग analogues संशोधित. इसके अलावा, उनके जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए प्रक्रिया प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं और TdT पीछा polymerization पर एक विशेष जोर देने के साथ, खुलासा है. यह विस्तृत प्रोटोकॉल संशोधित dNTPs की क्राफ्टिंग और रासायनिक जीवविज्ञान में उनके आगे उपयोग के लिए काम का हो जाएगा.

Introduction

5'न्यूक्लीओसाइड triphosphates ((डी) NTPs) ऊर्जा के सार्वभौमिक मुद्रा होने से सेल चयापचय के नियामकों को लेकर अनगिनत प्रक्रियाओं और कार्यों में शामिल कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण biomolecules के एक वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन मौलिक जैविक परिवर्तनों में उनकी भूमिका के अलावा, उनके संशोधित समकक्षों oligonucleotides में कार्य समूहों की शुरूआत के लिए एक बहुमुखी और हल्के मंच, अच्छी तरह से आमतौर पर 1,2 लागू किया जाता है कि स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण पूरक एक पद्धति के रूप में उन्नत किया है. दरअसल, (घ) NTPs आरएनए और डीएनए पीसीआर 3 के लिए substrates, अमीनो एसिड 4-13, boronic एसिड 14,15, nornbornene 16, diamondoid तरह के अवशेष 17, के लिए पक्ष की चेन सहित कार्य समूहों की एक धन के रूप में कार्य कर सकते हैं प्रदान की organocatalysis 18, पित्त अम्ल 19, और यहां तक कि oligonucleotides 20 oligonucleotides में पेश किया जा सकता है.

_content "> न्यूक्लिक एसिड की functionalization के लिए एक सुविधाजनक वेक्टर का प्रतिनिधित्व करने के अलावा, संशोधित dNTPs, SELEX और संशोधित उत्प्रेरक न्यूक्लिक एसिड 21-30 और विभिन्न व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए 10 aptamers की पीढ़ी के लिए इन विट्रो चयन के अन्य संबंधित मिश्रित तरीकों में लगे हुए किया जा सकता है 31-36. संशोधित dNTPs के polymerization से पेश कर रहे हैं कि अतिरिक्त पक्ष की चेन एक चयन प्रयोग के दौरान पता लगाया और न्यूक्लिक एसिड 37 के बजाय गरीब कार्यात्मक शस्त्रागार के पूरक हो सकते हैं कि रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि करने के लिए लगा रहे हैं. हालांकि, इन के बावजूद आकर्षक लक्षण और सिंथेटिक और विश्लेषणात्मक तरीकों दोनों के विकास में किए गए हाल की प्रगति, कोई सार्वभौमिक रूप से लागू करने और अधिक उपज वाली प्रक्रिया संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates 2,38 के क्राफ्टिंग के लिए मौजूद है.

इस वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य (कभी कभी) जटिल प्रक्रियाओं के प्रमुख टी में प्रकाश डाला हैओ संश्लेषण और इन सक्रिय इमारत ब्लॉकों (चित्रा 1 बी) के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन. विशेष जोर अक्सर मुश्किल से मिल रहे हैं या प्रयोगात्मक वर्गों में अनुपस्थित रहे हैं लेकिन शुद्ध (डी) NTPs के अलगाव (चित्रा 1) के प्रमुख के लिए सिंथेटिक मार्ग के सफल समापन के लिए अभी तक महत्वपूर्ण हैं कि सभी कृत्रिम विवरण पर दिया जाएगा.

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Protocol

1. संशोधित न्यूक्लीओसाइड Triphosphates का संश्लेषण

चुना सिंथेटिक दृष्टिकोण इस विधि आम तौर पर विश्वसनीय है और बहुत कुछ पक्ष उत्पादों (चित्रा 1 ए) 39 करने के लिए सुराग के बाद से लुडविग और Eckstein द्वारा विकसित की प्रक्रिया इस प्रकार है.

  1. दो बार निर्जल pyridine (2 मिलीग्राम) के साथ और रात में शून्य के नीचे तो सूखी उपयुक्त रूप 3'-OAC की रक्षा की न्यूक्लीओसाइड (आमतौर पर 0.1 mmol) Coevaporate. इसी समय, रात भर वैक्यूम के तहत शुष्क tributylammonium पाइरोफॉस्फेट (0.13 mmol).
  2. शुष्क pyridine (0.2 मिलीग्राम) की एक न्यूनतम में न्यूक्लीओसाइड भंग और एक cosolvent के रूप में सूखी dioxane (0.4 मिलीलीटर) जोड़ें. अंत में, 2-क्लोरो -1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-एक (0.11 mmol) जोड़ने के लिए और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं.
    नोट: यह विशेष देखभाल 2 क्लोरो -1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-एक अभिकर्मक के साथ लिया जाना चाहिए कि उल्लेखनीय है. दरअसल, एक आभ्यांतरिक गैस वातावरण के तहत इस अभिकर्मक का भी भंडारणयहाँ अपने अपघटन को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं है. इस प्रकार, इस अपघटन में बनता है कि सफेद ठोस और उपयोग करने से पहले बंद scraped किया जाना चाहिए सकता है.
  3. एक सूखी DMF (0.17 मिलीग्राम) में tributylammonium पाइरोफॉस्फेट का समाधान और हौसले से आसुत tributylamine तैयार (58 μl, आणविक sieves जोड़ने कभी नहीं). प्रतिक्रिया मिश्रण (एक सफेद वेग दिखाई देता है लेकिन जल्दी से गायब हो जाता है) के लिए जिसके परिणामस्वरूप समाधान जोड़ें और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. एक आयोडीन के घोल pyridine में (0.16 mmol) (0.98 मिलीग्राम) और एच 2 ओ (20 μl) तैयार करें और (iii) केन्द्र Pα oxidize करने के क्रम में प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें. परिणामस्वरूप अंधेरे समाधान 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हलचल की अनुमति दें.
  5. मैं 2 अतिरिक्त बुझाने के लिए NAS 2 ओ 3 के एक 10% जलीय घोल का प्रयोग करें. वैक्यूम के अंतर्गत विलायक निकालें (रोटरी बाष्पीकरण का पानी स्नान का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखा जाना चाहिए). एच 2 ओ (5 एमएल) जोड़ें और मील की अनुमतिचक्रीय triphosphate आधा भाग hydrolyze को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े करने के लिए xture.
  6. इस स्तर पर, रक्षा समूहों आमतौर पर (3'-OAC और nucleobase के पक्ष श्रृंखला पर समूहों आईई) को हटा रहे हैं. नतीजतन, कच्चे तेल के लिए राष्ट्रीय राजमार्ग 4 OH (एच 2 ओ, 10 मिलीलीटर में 30%) जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए हलचल, और वैक्यूम के अंतर्गत विलायक हटा दें.
  7. 2 ट्यूबों में एच 2 हे और विभाजन के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 30 मिनट के लिए एसीटोन और अपकेंद्रित्र (1000 XG) में NaClO 4 का 2% समाधान के 12 एमएल जोड़ें. यह प्रक्रिया एक बार और दोहराया है. इस वर्षा इस प्रकार काफी आगामी आर.पी. HPLC शोधन सरल बनाने, (वेग होगा) triphosphate से संश्लेषण में प्रयोग किया जाता विलायकों और अभिकर्मकों के अलग होने के लिए अनुमति देता है.
  8. तेल अवशेषों की हवा सुखाने के बाद, (, मानक प्रक्रियाओं का पालन माल और चित्रा 3 की भी सूची देखें) कच्चे तेल की एक 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड और4 एमएल एच 2 ओ में भंग
    नोट: इस कृत्रिम प्रक्रिया मुख्य रूप से संशोधित deoxynucleoside triphosphates की पीढ़ी पर केंद्रित है, लेकिन एक बहुत ही इसी तरह की प्रक्रिया (बस, 3'-बीआईएस-O-acetylated व्यापारियों '2 का उपयोग करके) अपने आरएनए समकक्षों के लिए लागू किया जा सकता है.

2. संशोधित न्यूक्लीओसाइड Triphosphates की HPLC शोधन

  1. Triethylammonium बाइकार्बोनेट (TEAB) के एक 1 एम स्टॉक समाधान की तैयारी: 40
    1. आसुत और फ़िल्टर एच 2 ओ की ≈ 600 मिलीलीटर में triethylamine का 1 मोल (139 मिलीलीटर) की एक समाधान तैयार
    2. बुलबुला सीओ 2 (सूखी बर्फ और एक गैस bubbler) के माध्यम से जोरदार सरगर्मी के तहत समाधान में 7.6 की एक पीएच (यह कम से कम 10 घंटे का समय लगेगा) तक पहुँच जाता है. यह स्टॉक समाधान करने के लिए एक महीने के लिए फ्रिज में संग्रहित किया जा सकता है.
  2. शुद्धीकरण:
    1. Ultrapure पानी में 50 मिमी TEAB के 2 एल (eluent ए) एक: 1 एम स्टॉक से दो बफर समाधान तैयारएन डी 50% MeCN (eluent बी) में 50 मिमी TEAB का 1 एल. दोनों eluents वैक्यूम के तहत और 20 मिनट के लिए सरगर्मी देगास (सावधान ध्यान degassing के दौरान सीओ 2 को हटाने से पीएच में परिवर्तन करने के लिए नहीं तो के रूप में) की आवश्यकता है.
    2. 300 μl आसुत एच 2 ओ में कच्चे तेल की triphosphate के 10 μl भंग करके एक विश्लेषणात्मक नमूना तैयार है और एक अर्द्ध प्रारंभिक आरपी स्तंभ (C18) के साथ सुसज्जित और लेकर एक ढाल का उपयोग कर एक HPLC प्रणाली में सुई 40 मिनट में 0-100% बी से (चित्रा 4). Triphosphate के आर टी (आमतौर पर वर्णलेख पर मुख्य शिखर है) और (एक से थोड़ा कम आर टी है) diphosphate के अनुसार HPLC कार्यक्रम को समायोजित करें. इन स्थितियों के और कुछ diphosphate शामिल हो सकता है कि जल्दी अंशों को हटाने के द्वारा उपयोग कर कच्चे मिश्रण शुद्ध.
    3. उत्पाद शामिल सभी अंशों का मिश्रण है और फ्रीज शुष्क (अवांछित diphosph को हाइड्रोलिसिस कम करने के लिए रोटरी बाष्पीकरण पर वाष्पीकरण को पसंद किया जाता है जो) खा लिया. (Eluents से बचे triethylamine दूर करने के लिए) ultrapure पानी के साथ कई बार Coevaporate. एनएमआर द्वारा triphosphate की शुद्धता मानक प्रोटोकॉल का आवेदन (1 एच और 31 पी एनएमआर दोनों) और MALDI-TOF (चित्रा 5) का आकलन करें. इस प्रोटोकॉल के आवेदन के द्वारा प्राप्त ठेठ पैदावार आमतौर पर सब्सट्रेट पर निर्भर करता है, 30-70% की सीमा में झूठ बोलते हैं.

3. प्राइमर एक्सटेंशन प्रतिक्रियाओं और TdT Polymerization

  1. प्राइमर की 5'-अंत लेबलिंग
    1. उचित प्राइमर की 30 pmol मिक्स (जैसे P1, माल की सूची) 10x polynucleotide kinase (पी एन) बफर, γ-[32 पी]-एटीपी, पी एन 1 μl, और DDH 2 ओ 3 μl (के लिए 4 μl के साथ 40 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा). 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं और फिर kinase (70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) गर्मी निष्क्रिय.
    2. लेबलिंग प्रतिक्रिया तैयार दौरानsilanized गिलास ऊन के साथ एक 1 एमएल पिपेट टिप plugging और G10 समाधान (DDH 2 ओ में 10%, autoclaved) के साथ टिप भरने के द्वारा एक G10 Sephadex स्तंभ. स्पिन और 500 μl DDH 2 हे और 50 μl DDH 2 ओ के साथ एक अंतिम धोने के साथ तीन बार धोने (मुक्त रेडियोधर्मी लेबल हटाने के लिए) G10 के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण चलाएँ.
    3. जेल (पेज 20%) radiolabeled प्राइमर को शुद्ध और कुचलने के आवेदन से उबरने के लिए और 15 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 1% LiClO 4 और 1 मिमी निवल 3 (पीएच 8) युक्त एक जलीय समाधान के 500 μl के साथ विधि (यानी क्षालन सोख मिनट). इथेनॉल वेग और G10 eluted oligonucleotide फीका बनाना.
  2. प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया
    1. पानी रखना 1 radiolabeled प्राइमर P1 के pmol, 10 pmol प्राइमर P1, और 10 (प्रयोग की जाने वाली पोलीमर्स के सप्लायर द्वारा प्रदान की) 10x प्रतिक्रिया बफर में टेम्पलेट T1 (माल की सूची) के pmol टी रखकरUbe गर्म (90-95 डिग्री सेल्सियस) पानी में है और धीरे धीरे (45 मिनट से अधिक) कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति देकर.
    2. बर्फ पर ट्यूब डाल दिया और (बदले में) dNTP कॉकटेल जोड़ने (संशोधित और दोनों युक्त प्राकृतिक triphosphates, 100 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) और डीएनए पोलीमरेज़ का 1 यू (Exo (वेंट - Klenow, PWO या 9 ° एन,) एम) और 20 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए पानी () के साथ पूरा हो गया. (-) का उपयोग किया जा रहा है वेंट (Exo जब 30 मिनट के लिए जैसे 60 डिग्री सेल्सियस) एंजाइम का इष्टतम काम कर रहे तापमान पर सेते हैं.
    3. बंद समाधान (formamide (70%), ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 50 मिमी), bromophenol नीला (0.1%), xylene cyanol (0.1%)) के 20 μl जोड़ें, नमूने (95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) गर्मी, शांत नीचे (0 डिग्री सेल्सियस), और polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा हल. Phosphorimager द्वारा कल्पना.
  3. TdT polymerization
    1. एकल असहाय की 7 pmol पतला, Unlabeled प्राइमर P2 (माल की सूची), 1 μl TdT बफर 10x में radiolabeled प्राइमर के 1 pmol.
    2. बर्फ पर ट्यूब डाल दिया और (बदले में) (10 और 200 माइक्रोन के बीच शामिल एक पर्याप्त एकाग्रता में) dNTP कॉकटेल और TdT पोलीमर्स (4 यू) जोड़ने. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. रोकने के समाधान के 10 μl जोड़ें, नमूने (95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) गर्मी (0 डिग्री सेल्सियस) शांत, और (पेज 15%) polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा हल. Phosphorimager द्वारा कल्पना.

4. संशोधित न्यूक्लीओसाइड Triphosphates साथ पीसीआर

  1. दोनों को आगे की 8 pmol मिक्स और परिलक्षित हो टेम्पलेट के 0.5 pmol साथ प्राइमरों रिवर्स. 10x प्रतिक्रिया बफर और (एक 200 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता के लिए) dNTP कॉकटेल जोड़ने और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया. 20 μl के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए 1 डीएनए पोलीमरेज़ यू और एच 2 ओ के साथ पूरा जोड़ें. एक पीसीआर शीशी में मिश्रण स्थानांतरण और 30 पीसीआर चक्र से बाहर ले.
  2. 2x सुक्रोज लोड हो रहा है बफर के 6 μl के साथ 6 μl पतला और वैद्युतकणसंचलन (ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग) agarose द्वारा 2% हल. Phosphorimager द्वारा कल्पना.

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Representative Results

वे न्यूक्लिक एसिड 41 में कार्य समूहों की एक विशाल सरणी के सरल परिचय के लिए अनुमति देने के बाद संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates सिंथेटिक लक्ष्य आकर्षक हैं. हालांकि, इन सक्रिय इमारत ब्लॉकों का अलगाव और लक्षण अक्सर कठिन होने का पता चला है. नतीजतन, इस के साथ साथ दिखाया गया है परिणामों aforementioned सिंथेटिक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं (चित्रा 1 बी) के भीतर विभिन्न चरणों का पालन करने के लिए एक हाथ में मदद प्रदान करने के लिए लगा रहे हैं.

विशेष रूप से, चित्रा 3 फॉस्फोरस केन्द्रों की विशेषता संकेत (यानी एक मनाया जा सकता है, जहां एक संशोधित dNTP का एक विशिष्ट कच्चे तेल की 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रम (इस विशेष मामले में, ड्यू BPU टी.पी. (4) 18, चित्रा 2), से पता चलता है -5.02 (पी γ) में नक़ल, -10.44 (पी α) में एक नक़ल, और -20.55 (पी β) पीपीएम पर एक triplet). इसके अलावा, Sdiphosphate (-4.84 पर दो दोहरी और -10.63 पीपीएम) और monophosphate (-21.02 पर संकेतों और -23.19 पीपीएम) उच्च फॉस्फेट के साथ पक्ष उत्पादों (-0.18 पीपीएम पर स्वेटर) के लिए stemming ignals हमेशा इस स्तर पर मनाया जाता है. कच्चे तेल के मिश्रण का एक पहला आर.पी. HPLC विश्लेषण करते हुए मुख्य प्रतिफल, 5 (ड्यू BPU टी.पी. के लिए (4)) मुख्य शिखर (आर टी = 30.78 मिनट), 5'-triphosphate से मेल खाती है, जहां 4 चित्र पर दिखाया गया है '-diphosphate, एक से थोड़ा कम प्रतिधारण समय (आर टी = 30.03 मिनट) को प्रदर्शित करता है. अंत में, एक पूरी तरह आर.पी. HPLC शोधन के बाद, संशोधित dNTP एनएमआर और MALDI-TOF (चित्रा 5) की विशेषता की जरूरत है. अवांछित डि और मोनो फॉस्फेट की उपस्थिति विशिष्ट संकेत देता है के बाद से 1 एच एनएमआर और 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा, संशोधित dNTPs की पवित्रता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं दोनों.

Nucleos की शुद्धता की स्थापना के बादआईडीई एनालॉग और जन द्वारा या यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा या तो शेयर समाधान की एकाग्रता का आकलन करने, संशोधित dNTP विभिन्न पीसीआर द्वारा अपने सब्सट्रेट स्वीकृति क्षमता का आकलन करने के क्रम में प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है. 6 प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं का परिणाम दिखाता है चित्रा डीयू टी पी टी.पी. (2), डा एच एस टी.पी. (6), और डीसी वैल टी.पी. (7) दो संशोधित dNTPs (गलियों 8-10) के संयोजन के रूप में अकेला संशोधनों (गलियों 5-7), के रूप में या एक साथ भी इस्तेमाल किया लोन प्राकृतिक dGTP (लेन 11) के साथ.

अंत में, चित्रा 7 अलग संशोधित dUTP analogues के साथ प्रतिनिधि TdT की मध्यस्थता polymerization प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. इस संदर्भ में, ड्यू सी पी टी.पी. (1) और ड्यू एफपी टी.पी. (3) TdT के लिए सबसे अच्छा substrates हैं (1 गलियों और 4) पीछा क्षमता तुलना कर रहे हैं के बाद से या प्राकृतिक dTTP (6 लेन) के उन लोगों से अधिक है. थोड़ा polydisperse अब आकार oligonucleotides मनाया जा सकता है, क्योंकि इसके बजाय, ड्यू BPU टी.पी. (4) (5 लेन) इस संदर्भ में एक नहीं बल्कि गरीब सब्सट्रेट है.

चित्रा 1
चित्रा 1. ए) (आधार के संश्लेषण के लिए लुडविग Eckstein दृष्टिकोण)) से पहले इस तरह के SELEX के रूप में आवेदन में उनके उपयोग के लिए संशोधित dNTPs के संश्लेषण और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक सभी कदम के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व न्यूक्लीओसाइड triphosphates 39. बी संशोधित. देखने के लिए यहां क्लिक करें बड़ी छवि .

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चित्रा 2. डीयू सी पी टी.पी. (1), ड्यू टी पी टी.पी. (2), ड्यू एफपी टी.पी. (3), ड्यू BPU टी.पी. (4), ड्यू बी एस टी.पी. (5), 18 डीए एच एस टी.पी. (संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates की रासायनिक संरचना 6), और डीसी वैल टी.पी. (7) 13. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रम (121 0.4 मेगाहर्ट्ज, ड्यू BPU टी.पी. के कच्चे प्रतिक्रिया मिश्रण के डी ओ 2) (4). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. कच्चे तेल की ड्यू BPU टी.पी. का आर.पी. HPLC प्रोफाइल (4): एच 2 ओ में 50 मिमी TEAB; eluent बी: 3.5 मिलीग्राम / मिनट (eluent एक: 40 मिनट में 0-100% eluent बी, दर प्रवाह एच में 50 मिमी TEAB 2 हे / CH 3 सीएन (1/1)). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 5. ; 18 बी) ​​1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम (300 मेगाहर्ट्ज, डी 2 हे, 128 स्कैन एक) 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रम (121.4 मेगाहर्ट्ज, डी 2 हे, 128 स्कैन): संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphate ड्यू बी एस टी.पी. (5) की विशेषता );. सी) MALDI-TOF स्पेक्ट्रम बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. . विभिन्न आधार संशोधित dNTP analogues लेन 1 के साथ प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं के प्रतिनिधि जेल छवि (पेज 15%): प्राइमर; 2 लेन: dUTP बिना प्राकृतिक dNTPs; 3 लेन: dATP बिना प्राकृतिक dNTPs; लेन -4: dCTP बिना प्राकृतिक dNTPs; लेन 5: डीयू <उन्हें> टी पी टी.पी. (2); 6 लेन: दा एच एस टी.पी. (6); लेन 7: डीसी वैल टी.पी. (7); 8 लेन: दा एच एस टी.पी. (6) और ड्यू टी पी टी.पी. (2); लेन 9: दा एच एस टी.पी. (6) और डीसी वैल टी.पी. (7); 10 लेन: डीयू टी पी टी.पी. (2) और डीसी वैल टी.पी. (7); लेन 11: डीयू टी पी टी.पी. (2), डा एच एस टी.पी. (6), और डीसी वैल टी.पी. (7); लेन 12:. प्राकृतिक dNTPs बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7चित्रा 7. विभिन्न आधार संशोधित dUTP analogues के साथ TdT polymerization प्रतिक्रियाओं की जेल छवि (पेज 20%) लेन 1:. ड्यू सी पी टी.पी. (1); 2 लेन: डीयू टी पी टी.पी. (2); 3 लेन: डीयू बी एस टी.पी. (5); लेन -4: डीयू एफपी टी.पी. (3); लेन 5: डीयू BPU टी.पी. (4); 6 लेन: dTTP; लेन 7: प्राइमर. सांद्रता:. 10 माइक्रोन, 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, 75 माइक्रोन, और 100 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

न्यूक्लिक एसिड में संशोधनों को शामिल किए जाने antisense और antigene एजेंटों के विकास 42,43, लेबलिंग और oligonucleotides 41 के कार्यात्मक टैगिंग सहित कई व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए ब्याज की है, और आनुवंशिक वर्णमाला 44-46 का विस्तार करने के प्रयास में. रासायनिक परिवर्तन और कार्य समूहों आमतौर पर मानक और स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण प्रोटोकॉल के आवेदन के द्वारा न्यूक्लिक एसिड में पेश कर रहे हैं. हालांकि, phosphoramidite इमारत ब्लॉकों बारी में रासायनिक कार्यक्षमता 47 की प्रकृति पर एक गंभीर प्रतिबंध लगाता है जो इस पद्धति द्वारा लगाए गए बल्कि कठोर परिस्थितियों से उबरने की क्षमता होना चाहिए. एकमात्र प्रतिबंध वे पीसीआर 1,2 के लिए substrates के रूप में कार्य करता है के बाद से इसके बजाय, संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates के एंजाइम की मध्यस्थता polymerization, functionalities के एक व्यापक रेंज की शुरूआत के लिए अनुमति देता है. जनरल की नजर कमी हालांकि वहाँमौखिक रूप से लागू कार्यप्रणाली, विश्वसनीय और मजबूत सिंथेटिक और विश्लेषणात्मक तरीके संशोधित dNTPs के संश्लेषण के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा, के कारण अपने निहित प्रकृति के संशोधित triphosphates अलग बाह्य परिस्थितियों (जैसे पीएच, तापमान) और इस प्रकार उनके संश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल बेहद फायदेमंद है बल्कि संवेदनशील हैं.

इस के साथ साथ प्रस्तुत कार्यप्रवाह संशोधित dNTPs की रासायनिक संश्लेषण, आर.पी. HPLC शोधन, एनएमआर विश्लेषण, और इन न्यूक्लीओसाइड analogues के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए enzymatic assays शामिल हैं. संशोधित dNTPs की एक सफल संश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम (एनएमआर) द्वारा कच्चे तेल उत्पाद का विश्लेषण, पूरी तरह से HPLC शोधन, शुद्ध सामग्री का विश्लेषण, और एक उपयुक्त डीएनए (आरएनए) पोलीमर्स का चुनाव कर रहे हैं.

संशोधित dNTPs के संश्लेषण के लिए हम लुडविग और Eck द्वारा विकसित की पद्धति लागूएक थोड़ा अब सिंथेटिक मार्ग की कीमत पर हालांकि अन्य प्रक्रियाओं की तुलना में उत्पादों द्वारा कम बनते हैं क्योंकि स्टीन 39,. इसके अलावा, आर.पी. HPLC शोधन निश्चित रूप से यह अक्सर दृढ़ता से डीएनए को बाधित और आरएनए 48 पीसीआर जो न्यूक्लीओसाइड diphosphates (dNDPs) के अलग होने के लिए अनुमति देगा के बाद से पूरे सिंथेटिक मार्ग की निर्णायक कदम का प्रतिनिधित्व करता है. संश्लेषण और शुद्धि प्राप्त करने के बाद, जिसके परिणामस्वरूप triphosphate की पवित्रता कोई पोलीमर्स बाधा diphosphate मौजूद है यह सुनिश्चित करने के लिए एनएमआर और MALDI-TOF द्वारा दोनों मूल्यांकन किया जाना चाहिए.

6 चित्र में दिखाया समावेश परख स्पष्ट रूप से इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को रेखांकित करता है. कोई तेजी से छोटे टुकड़ों को इसी बैंड मनाया जा सकता है चल रहा है - वास्तव में, यह प्रतिनिधि उदाहरण में कार्यरत dNTPs के सभी () इस विशेष मामले में Exo (वेंट) डीएनए पोलीमरेज़ के लिए अच्छा substrates होने का पता चलता है. Besइडस, एंजाइम कार्बोक्जिलिक एसिड के अवशेष (ड्यू टी पी टी.पी. (3) और डीसी वैल टी.पी. (7)) और कम से कम 39 अतिरिक्त शुल्क नकारात्मक असर एक oligonucleotide में दोनों dNTPs परिणाम के polymerization से सजी दो substrates बर्दाश्त. एक और मुख्य विशेषता संशोधित dNTPs के समावेश से उत्पन्न बैंड अक्सर (तुलना जैसे 11 और 12 गलियों) प्राकृतिक नियंत्रण की तुलना में धीमी electrophoretic mobilities प्रदर्शित करता है. इस प्रकार, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं संशोधित dNTPs की सब्सट्रेट स्वीकृति का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और अभी तक आसान तरीका का प्रतिनिधित्व करते हैं.

इसके अलावा, एकल असहाय oligonucleotides के 3'-टर्मिनी पर triphosphates की TdT की मध्यस्थता polymerization अत्यधिक functionalized न्यूक्लिक एसिड 49-52 की पीढ़ी के लिए एक आकर्षक रणनीति है. 7 चित्र में दिखाया प्रतिनिधि उदाहरण स्पष्ट रूप से selectin के लिए प्रक्रिया को दर्शाता हैजी सह 2 + निर्भर TdT 53 से बर्दाश्त कर रहे हैं कि functionalities. दरअसल, डीयू सी पी टी.पी. (1) और ड्यू एफपी टी.पी. (3), जो α-Phe समर्थक, क्रमशः, tdt के लिए सबसे अच्छा substrates हैं proteinogenic एमिनो एसिड एल Proline और dipeptide से लैस और को जन्म दिया है रहे हैं यहां तक ​​कि 10 माइक्रोन के रूप में के रूप में कम मात्रा में, असंशोधित dTTP नियंत्रण के लिए अनुकूल तुलना क्षमता है कि पीछा (1 गलियों और 4). Polydisperse अब आकार oligonucleotides ही उच्च स्तर पर मनाया जाता है के बाद से हैरानी की बात है, एनालॉग ड्यू टी पी टी.पी. (2) प्रोलाइन अवशेषों मुक्त कार्बोक्जिलिक एसिड की तुलना में ट्रांस में लिंकर बांह से जुड़ा है जहां अपने सीआईएस समकक्ष के रूप में रूप में अच्छा एक सब्सट्रेट नहीं है dNTP सांद्रता (> 100 माइक्रोन, 2 लेन). इसके अलावा, सल्फोनामाइड संशोधित dNTP 5 TdT और ड्यू के लिए तुलनीय के लिए एक उदारवादी सब्सट्रेट है टी पी टी.पी. (2) (3 लेन). इसके अलावा, ड्यू BPU टी.पी. (4), एक मजबूत हाइड्रोजन बांड दान आकृति भालू TdT के लिए एक नहीं बल्कि गरीब सब्सट्रेट है और polymerization प्रतिक्रिया संशोधित dNTP की एकाग्रता के प्रति उदासीन होने लगता है. इस प्रकार, सब्सट्रेट स्वीकृति के निम्न आदेश चित्रा 7 से लगाया जा सकता है: डीयू सी पी टी.पी. (1), ड्यू एफपी टी.पी. (3)> ड्यू टी पी टी.पी. (2), ड्यू बी एस टी.पी. (5)> ड्यू BPU टी.पी. (4 ).

अंत में, संशोधित analogues का उपयोग पीसीआर परिस्थितियों में polymerization प्रतिक्रियाओं के लिए वर्णित प्रक्रिया प्राकृतिक dNTPs शामिल है कि बल्कि समान है. हालांकि, इन परिस्थितियों में पीसीआर के साथ संशोधित dNTPs की अनुकूलता उच्च घनत्व functionali की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण महत्व का हैविशेष रूप से इन विट्रो चयन प्रयोगों में उनके उपयोग के संबंध के साथ जेड न्यूक्लिक एसिड 7,.

संक्षेप में, संशोधित न्यूक्लीओसाइड triphosphates के संश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए विधि पर बल दिया गया और इस तरह के एक प्रोटोकॉल की स्थापना निश्चित रूप से उपन्यास analogues के विकास और क्राफ्टिंग में मदद मिलेगी. समन्वित रूप से, इस तरह के उपन्यास dNTPs के उद्भव क्रियाशील oligonucleotides की पीढ़ी की सुविधा होगी; विशेष रूप से, उत्प्रेरक न्यूक्लिक एसिड.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान n PZ00P2_126430 / 1 ° और PZ00P2_144595) द्वारा समर्थित किया गया. प्रो सी. Leumann कृतज्ञता अंतरिक्ष प्रयोगशाला और उपकरण उपलब्ध कराने, साथ ही उनके निरंतर समर्थन के लिए के लिए स्वीकार किया है. सुश्री मुकदमा Knecht उपयोगी विचार विमर्श के लिए स्वीकार किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

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Hollenstein, M., Smith, C. C.,… More

Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

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