Summary
Protokollen er beskrevet i dette dokumentet tar sikte på å forklare og forkorte de mange hindringer i veien for den intrikate rute som fører til endrede nukleosidtrifosfater. Derfor forenkler denne protokollen både syntesen av disse aktiverte byggeklosser og deres tilgjengelighet for praktiske anvendelser.
Abstract
Den tradisjonelle strategien for innføring av kjemiske funksjonalitet er bruk av fast-fase-syntese ved å tilføye passende modifisert fosforamiditt-forløpere til den begynnende kjede. Men de betingelser som brukes under syntesen, og begrensningen til ganske korte sekvenser hemme anvendelse av denne metodologi. På den annen side, er modifiserte nukleosidtrifosfater aktivert byggeklosser som er blitt anvendt for den milde innføring av mange funksjonelle grupper i nukleinsyrer, en strategi som legger til rette for bruk av modifiserte nukleinsyrer i en bred palett av praktiske anvendelser som funksjonell tagging og generering av ribozymes og DNAzymes. En av de store utfordringer ligger i det detaljerte metode som leder til isolering og karakterisering av disse nukleosidanaloger.
I denne videoen artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for syntese av these modifiserte analoger ved hjelp av fosfor (III)-baserte reagenser. I tillegg er fremgangsmåten for deres biokjemiske karakterisering røpet, med spesiell vekt på primer forlengelsesreaksjoner og TdT tailing polymerisasjon. Denne detaljerte protokollen vil være til nytte for laging av modifiserte dNTPs og deres videre bruk i kjemisk biologi.
Introduction
5'-nukleosidtrifosfater ((d) NTPS) representerer en klasse av viktige biomolekyler som er involvert i mange prosesser og funksjoner som varierer fra å være den universelle valutaen for energi til regulatorer av cellemetabolismen. I tillegg til sin rolle i disse fundamentale biologiske forandringer, har sine motstykker modifisert avansert som en allsidig og mild plattformen for innføring av funksjonelle grupper på oligonukleotider En metode som pent utfyller automatisert faststoff-fase syntese som vanligvis påføres 1,2. Faktisk, forutsatt at (d) NTPS kan fungere som underlag for RNA og DNA polymeraser 3, et vell av funksjonelle grupper, inkludert aminosyrer 4-13, boronic syrer 14,15, nornbornene 16, diamantoidkomponenter-lignende rester 17, side-kjeder organocatalysis 18, gallesyrer 19, og selv 20 oligonukleotider kan bli innført i oligonukleotider.
_content "> Utover representerer en passende vektor for funksjonalisering av nukleinsyrer, kan modifiserte dNTPs være engasjert i SELEX og andre beslektede kombinatoriske fremgangsmåter for in vitro-seleksjon for generering av modifiserte katalysa nukleinsyrer 21-30 og aptamerer for forskjellige praktiske anvendelser 10, 31-36. De ekstra side-kjeder som er innført ved polymerisering av de modifiserte dNTPs antas å øke den kjemiske mellomrom som kan bli undersøkt i løpet av et utvalg eksperiment og supplere heller dårlig funksjonelle arsenal av nukleinsyrer 37. Men til tross for disse attraktive egenskaper og den siste framgangen i utviklingen av både syntetiske og analytiske metoder, ingen universelt anvendelig og høytytende prosedyre foreligger for laging av modifiserte nukleosidtrifosfater 2,38.Målet med denne protokoll er å kaste lys inn i (noen ganger) intrikate prosedyrer ledende to syntese og biokjemisk karakterisering av disse aktiverte byggeklosser (figur 1B). Spesiell vekt vil bli gitt på alle de syntetiske detaljer som ofte er vanskelig å finne eller er fraværende i eksperimentelle seksjoner, men er likevel avgjørende for en vellykket gjennomføring av den syntetiske stien som førte til isolering av rene (d) NTPS (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Syntese av den modifiserte nukleosidtrifosfater
Den syntetiske metode valgt følger fremgangsmåten som er utviklet av Ludwig og Eckstein, siden denne fremgangsmåten er generelt pålitelig og fører til svært få side-produkter (Figur 1a) 39.
- Coevaporate den passende 3'-OAc-beskyttet nukleosid (typisk 0,1 mmol) to ganger med vannfri pyridin (2 ml) og tørk under vakuum over natten. På samme tid, tørr tributylammonium pyrofosfat (0,13 mmol) under vakuum over natten.
- Oppløs nukleosid i et minimum av tørr pyridin (0,2 ml) og tilsette tørr dioksan (0,4 ml) som en kosolvent. Til slutt legger 2-klor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) og la det reagere ved romtemperatur i 45 min.
Merk: Det er bemerkelsesverdig at særlig forsiktighet bør tas med 2-klor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-ett reagens. Ja, selv lagring av denne reagens under en inert gass atmosher er ikke tilstrekkelig til å forhindre dens dekomponering. Således, det hvite faste stoff som dannes i denne nedbryting kan og skal skrapes av før bruk. - Forbered en løsning av tributylammonium pyrofosfat i tørr DMF (0,17 ml) og nydestillert tributylamin (58 mL; aldri legge molekylære sikter). Til den resulterende løsning til reaksjonsblandingen (et hvitt bunnfall synes men raskt forsvinner), og tillates å reagere ved romtemperatur i 45 min.
- Tilbered en løsning av jod (0,16 mmol) i pyridin (0,98 ml) og H2O (20 mL) og tilsett til reaksjonsblandingen for å oksydere Pα (III) senter. Tillat den resulterende mørke oppløsningen omrøres ved romtemperatur i 30 min.
- Bruk en 10% vandig oppløsning av NAS 2 O 3 for å kvele overskuddet av I 2. Fjern løsningsmidlet under vakuum (temperaturen på vannbadet i rotasjonsfordamperen må holdes under 30 ° C). Legg H2O (5 ml), og la mixture til å stå ved romtemperatur i 30 minutter for å hydrolysere den sykliske trifosfat moiety.
- På dette stadium er de beskyttende grupper fjernes vanligvis (dvs. 3 '-OAc, og grupper på sidekjedene av nucleobase). Følgelig legger NH 4 OH (30% i H2O, 10 ml) for å råoljen og omrør i 1,5 timer ved romtemperatur og fjern løsningsmidlet under vakuum.
- Tilsett 2 ml H 2 O og delt inn i to rør. Tilsett 12 ml av en 2% løsning av NaClO 4 i aceton og sentrifuge (1.000 x g) i 30 min. Denne prosedyren gjentas en gang til. Denne ventet gir mulighet for separering av løsningsmidler og reagenser som brukes i syntesen fra trifosfat (som vil utfelle), og dermed forenkle den påfølgende RP-HPLC-rensing i det vesentlige.
- Etter lufttørking av det oljeaktige residuum, ta opp en 31 P-NMR-spekteret av det urene (følge standardfremgangsmåter, se også Liste over materialer og figur 3), ogoppløses i 4 ml H2O
Merk: Denne synteseprosedyre fokuserer hovedsakelig på genereringen av modifiserte deoxynucleosid trifosfater, men en svært lignende prosedyre kan bli anvendt for deres RNA-motstykker (ved å bruke 2 ', 3'-bis-O-acetylerte forløpere).
2. HPLC-rensing av den modifiserte nukleosidtrifosfater
- Fremstilling av en 1 M stamløsning av trietylammonium-bikarbonat (TEAB): 40
- Tilbered en løsning av 1 mol av trietylamin (139 ml) i ≈ 600 ml destillert og filtrert H 2 O.
- Boble CO 2 (via tørris, og en gass-boble) inn i oppløsningen under kraftig omrøring inntil en pH-verdi på 7,6 er nådd (det vil ta minst 10 timer). Denne stamløsning kan oppbevares i kjøleskapet i opptil en måned.
- Rensing:
- Forbered to bufferløsninger fra en M lager: 2 L av 50 mM TEAB i ultrarent vann (elueringsmiddel A) ennd 1 l 50 mM TEAB i 50% MeCN (elueringsmiddel B). Degas begge elueringsmidler under vakuum, og omrøring i 20 min (nøye oppmerksomhet er nødvendig for ikke å endre pH-ved å fjerne CO2 ved avgassing).
- Tilbered en analytisk prøve ved å oppløse 10 pl av den urene trifosfat i 300 mL destillert H2O og injisere inn i et HPLC-system utstyrt med en semi-preparativ RP-kolonne (C18) og anvendelse av en gradient som strekker seg fra 0-100% B i 40 min (Figur 4). Juster HPLC-en i henhold til R-t av trifosfat (som vanligvis er de viktigste topp på kromatogrammet) og difosfat (som har et noe lavere R-t). Rens det urene blanding ved hjelp av disse forhold og ved å fjerne tidligere fraksjoner som kan inneholde noe difosfat.
- Kombiner alle de fraksjoner som inneholder produktet og fryse-tørk (som er foretrukket for å inndampning på rotasjonsfordamper for å minimalisere hydrolyse til den uønskede diphosphspiste). Coevaporate flere ganger med ultrarent vann (for å fjerne rest trietylamin fra elueringsmidler). Bedømme renheten av trifosfat ved NMR (begge 1H-og 31 P NMR) og MALDI-TOF ved anvendelse av standardprotokoller (se figur 5). Typiske utbytter som oppnås ved anvendelse av denne protokollen typisk ligge i området fra 30 til 70%, avhengig av substratet.
Tre. Primer Extension Reaksjoner og TdT Polymerisering
- 5'-ende-merking av tennsatsen
- Bland 30 pmol av riktig primer (f.eks P1, List of Materials) med 4 mL av 10x polynukleotidkinase (PNK) buffer, 3 mL av γ-[32 P]-ATP, 1 mL av PNK, og DDH 2 O (for et totalt reaksjonsvolum på 40 ul). Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 30 min og ble deretter varme deaktivere kinase (10 min ved 70 ° C).
- Under merkingsreaksjon forberedeen G10 Sephadex kolonne ved å koble en 1 ml pipette med silanbehandlet glassull og fylle tuppen med G10-løsning (10% i DDH 2 O, autoklaveres). Spinn ned og vask tre ganger med 500 mL DDH 2 O og en siste vask med 50 mL DDH 2 O. Løpe reaksjonsblandingen gjennom G10 (for å fjerne den frie radioaktiv markør).
- Gel rensing (PAGE 20%) av radioaktivt merket primer og komme seg ved påføring av det knuse-og suge-metoden (dvs. eluering med 500 mL av en vandig løsning inneholdende 1% LiClO 4 og 1 mM netto 3 (pH 8) ved 72 ° C i 15 min). Etanol presipitat og G10 avsalte eluert oligonukleotidet.
- Primer forlengelse reaksjon
- Anneal en pmol av radiomerket primer P1, 10 pmol primer P1, og 10 pmol av mal T1 (List of Materials) i 10x reaksjonsbuffer (levert av leverandøren av polymerase som skal brukes) ved å plassere tube i varm (90-95 ° C) vann, og ved å tillate gradvis å avkjøle seg til romtemperatur (over 45 min).
- Sett røret på is og legge til (igjen) på dNTP cocktail (som inneholder både den modifiserte og de naturlige trifosfater, 100 mikrometer endelig konsentrasjon) og en U av DNA polymerase (Vent (exo -), Klenow, PWO eller 9 ° N m) og komplett med vann (for et totalt reaksjonsvolum på 20 ul). Inkuber ved optimal arbeidstemperatur av enzymet (f.eks 60 ° C i 30 min når Vent (ekso -) blir brukt).
- Tilsett 20 ul stoppløsning (formamid (70%), etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, 50 mM), bromfenol blue (0,1%), xylen cyanol (0,1%)), oppvarming av prøvene (95 ° C, 5 min), kule ned (0 ° C), og å løse ved denaturerende polyakrylamid-gelelektroforese. Visual etter phosphorimager.
- TdT polymerisasjon
- Fortynne 7 pmol av single-strandet, Umerket primer P2 (List of Materials), en pmol av radiomerket primer i en mL TdT buffer 10x.
- Plasser røret på is og tilsett (igjen) den dNTP cocktail (ved en tilstrekkelig konsentrasjon som ligger mellom 10 og 200 pM) og TdT-polymerase (4 U). Inkuber ved 37 ° C i 1 time. Tilsett 10 pl av stoppløsningen, oppvarme prøvene (95 ° C, 5 min), avkjølt (0 ° C), og å løse ved denaturerende polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE 15%). Visual etter phosphorimager.
4. PCR med Modifiserte nukleosidtrifosfater
- Bland 8 pmol av både forover og bakover primere med 0,5 pmol av malen til å bli forsterket. Legg 10x reaksjonsbuffer og dNTP cocktail (for en 200 pM sluttkonsentrasjon) og sette røret på is. Tilsett 1 U av DNA-polymerase og fullstendig med H2O for å nå et endelig volum på 20 pl. Overfør blandingen i en PCR-ampulle og utføre 30 PCR-sykluser.
- Tynn ut 6 mL med 6 mL av 2x sukrose lasting buffer og løse ved agarose 2% (farget med etidiumbromid) elektroforese. Visual etter phosphorimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modifiserte nukleosidtrifosfater er fristende syntetiske mål siden de gir mulighet for en lettvint innføring av et bredt spekter av funksjonelle grupper til nukleinsyrer 41. Det er imidlertid isolering og karakterisering av disse aktiverte byggeklosser ofte viser seg å være vanskelige. Følgelig er resultatene vist heri tenkt å tilveiebringe en hjelpende hånd å følge de forskjellige trinn i de tidligere nevnte syntetiske og biokjemiske prosedyrer (figur 1B).
Spesielt, figur 3 viser en typisk råolje 31 P-NMR-spekteret av en modifisert dNTP (i dette spesielle tilfellet, dU BPU TP (4) 18, figur 2), hvor de karakteristiske signaler av fosfor sentre kan observeres (dvs. en doublet ved -5,02 (P γ), en dublett ved -10,44 (P α) og en triplett ved -20,55 (P β) ppm). I tillegg, signals stammer for difosfatet (to dubletter på -4,84 og -10,63 ppm) og monofosfat (sing på -0,18 ppm) side-produkter sammen med høyere fosfater (signaler på -21,02 og -23,19 ppm) er alltid observert på dette stadiet. En første RP-HPLC analyse av den urene blanding er vist på figur 4 (for dU BPU TP (4)), hvor hovedtoppen (R t = 30,78 min) tilsvarer den 5'-trifosfat, mens hoved biprodukt, de 5 '-difosfat, viser en litt lavere retensjonstid (R-t = 30,03 min). Til slutt, etter en grundig RP-HPLC-rensing, må den modifiserte dNTP som skal kjennetegnes ved NMR-og MALDI-TOF (figur 5). Både 1 H-NMR-og 31 P-NMR-spektrene er avgjørende for å bedømme renheten av de modifiserte dNTPs, siden nærvær av uønsket di-og mono-fosfater gir karakteristiske signaler.
Etter å etablere renheten av nucleoside analog og vurdering av konsentrasjonen av stamløsningen enten ved masse eller ved UV-spektroskopi, kan den modifiserte dNTP brukes i primer forlengelsesreaksjoner for å vurdere dets substrat aksept kapasitet av forskjellige polymeraser. Figur 6 viser resultatet av primer forlengelsesreaksjoner med dU t P TP (2), dA Hs TP (6), og dC Val TP (7) som brukes enten som lone modifikasjoner (søyle 5-7), som kombinasjoner av to modifiserte dNTPs (kolonnene 8-10), eller mot hverandre sammen med den eneste naturlige dGTP (søyle 11).
Til slutt, figur 7 viser representative TdT-mediert polymerisasjons-reaksjoner med forskjellige modifiserte dUTP analoger. I denne sammenheng, dU c P TP (1) og dU FP TP (3) er de beste substrater for TdT (søyle 1 og 4), siden de tailing effektivitet er sammenlignbar eller overskride de av den naturlige dTTP (felt 6). I stedet dU BPU TP (4) (felt 5) er en heller dårlig substrat i denne sammenheng, siden liten polydisperse lenger store oligonukleotider kan observeres.
Figur 1. A) Ludwig-Eckstein tilnærming for syntese av (base) modifisert nukleosidtrifosfater 39. B) Skjematisk fremstilling av alle trinnene som kreves for syntesen og biokjemisk karakterisering av modifiserte dNTPs før deres bruk i applikasjoner som SELEX. Klikk her for å vise større bilde .
"Fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Kjemiske strukturer av de modifiserte nukleosidtrifosfater: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3), dU BPU TP (4), dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), og DC Val TP (7) 13. Klikk her for å se større bilde .
Fig. 3. 31. P-NMR-spektrum (121 0,4 MHz, D 2 O) av den rå reaksjonsblandingen av DU BPU TP (4). Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. RP-HPLC profil av råolje dU BPU TP (4): 0-100% elueringsmiddel B i 40 min, flow rate: 3,5 ml / min (elueringsmiddel A: 50 mM TEAB i H 2 O, elueringsmiddel B: 50 mm TEAB i H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Klikk her for å se større bilde .
/ 51385fig5.jpg "width =" 600px "/>
Figur 5. Karakterisering av det modifiserte nukleosid trifosfat dU B TP (5): A) 31 P-NMR-spektrum (121.4 MHz, D 2 O, 128 skanninger), 18 B) 1 H-NMR-spektrum (300 MHz, D 2 O, 128 skanninger );. C) MALDI-TOF spektrum Klikk her for å se større bilde .
Figur 6. Representant gel bilde (SIDE 15%) av primer extension reaksjoner med forskjellige grunn endret dNTP analoger Lane 1:. Primer; kjørefelt 2: naturlige dNTPs uten dUTP; kjørefelt 3: naturlige dNTPs uten dATP; kjørefelt 4: naturlige dNTPs uten dCTP; kjørefelt 5: dU <em> t P TP (2); kjørefelt 6: dA Hs TP (6); kjørefelt 7: DC Val TP (7); felt 8: dA Hs TP (6) og dU t P TP (2); kjørefelt 9: dA Hs TP (6) og DC Val TP (7); lane 10: dU t P TP (2) og DC Val TP (7); lane 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6), og DC Val TP (7); lane 12:. naturlige dNTPs Klikk her for å se større bilde .
Figur 7. Gel bilde (PAGE 20%) av TdT-polymerisasjons-reaksjoner med forskjellige grunn modifisert dUTP analoger Felt 1:. DU c P TP (1); felt 2: dU t P TP (2); kjørefelt 3: dU B TP (5); kjørefelt 4: dU FP TP (3); felt 5: dU BPU TP (4); kjørefelt 6: dTTP; kjørefelt 7: primer. Konsentrasjoner:. 10 mikrometer, 25 mikrometer, 50 mikrometer, 75 mikrometer, og 100 mikrometer Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkludering av endringer i nukleinsyrer er av interesse for mange praktiske bruksområder, inkludert utviklingen av antisense og antigeneffekt agenter 42,43, merking og funksjonell merking av oligonukleotider 41, og i arbeidet med å utvide den genetiske alfabetet 44-46. Kjemiske forandringer og funksjonelle grupper blir vanligvis innført i nukleinsyrer ved anvendelse av standard-og automatiserte fastfase-synteseprotokoller. Imidlertid fosforamiditt byggeklosser må være motstandsdyktige mot de heller harde betingelser som følger av denne metode, som i sin tur medfører en alvorlig begrensning på naturen av den kjemiske funksjonalitet 47.. I stedet for enzym-mediert polymerisasjon av modifiserte nukleosidtrifosfater gir mulighet for innføring av et bredere spekter av funksjoner, siden den eneste begrensningen er at de fungerer som substrater for polymeraser 1,2. Selv om det er en merkbar mangel på genrelt anvendbar metode, pålitelig og robust syntetiske og analytiske metoder har blitt utviklet for syntesen av modifiserte dNTPs. Dessuten, på grunn av sin naturlige beskaffenhet modifiserte trifosfater er ganske følsomme for forskjellige ytre betingelser (for eksempel pH, temperatur), og således er meget fordelaktig en detaljert protokoll for deres syntese og karakterisering.
Denne arbeidsflyten presentert heri omfatter den kjemiske syntese av modifiserte dNTPs, RP-HPLC-rensing, NMR-analyse, og enzymatiske analyser for den biokjemiske karakteriseringen av disse nukleosidanaloger. De mest kritiske trinn for en vellykket syntese og karakterisering av modifiserte dNTPs er analysen av det urene produkt (ved NMR), grundig HPLC-rensing, til analyse av det rensede materiale, og valg av en egnet DNA (RNA) polymerase.
For syntese av de modifiserte dNTPs vi anvendt den metode som er utviklet av Ludwig og Eckstein 39, ettersom færre biprodukter dannes i forhold til andre fremgangsmåter, riktignok på bekostning av en noe lengre syntetisk vei. Videre RP-HPLC-rensing representerer absolutt svinge trinn av hele syntetisk vei, da det vil muliggjøre separasjon av nukleosid diphosphates (dNDPs) som ofte er sterkt inhiberer DNA-og RNA-polymeraser 48.. Etter å oppnå syntese og rensing, må renheten av den resulterende trifosfat å bli vurdert både ved NMR-og MALDI-TOF å sikre at ingen polymerase-inhiberende diphosphate er til stede.
Inkorporeringen analysen er vist i figur 6. klart under nytten av denne fremgangsmåten. Faktisk er alle de dNTPs som anvendes i dette representativt eksempel vise seg å være gode substrater for DNA-polymerase (i dette spesielle tilfellet Vent (ekso -)), siden ingen raskere løpende bånd svarende til mindre fragmenter kunne observeres. Besides, tåler enzymet to substrater utsmykket med karboksyl-syrerester (dU t P TP (3) og dC Val TP (7)) og polymeriseringen av begge dNTPs resulterer i et oligonukleotid som bærer ikke mindre enn 39 flere negative ladninger. Et annet slående trekk er at de bandene som følge av inkorporeringen av modifiserte dNTPs ofte vise tregere elektro mobilitet enn de naturlige kontroller (sammenlign f.eks baner 11 og 12). Således primer forlengelsesreaksjoner representerer en kraftig og likevel enkel måte å vurdere substratet aksept av modifiserte dNTPs.
Dessuten er den TdT-mediert polymerisasjon av trifosfater på 3'-termini av enkelt-trådede oligonukleotider en tiltrekkende strategien for genereringen av høyst functionalized nukleinsyrer 49-52. Den representativt eksempel er vist i Figur 7 viser klart at fremgangsmåten for selekting de funksjonene som tolerert av Co 2 +-avhengige TdT 53. Faktisk dU c P TP (1) og dU FP TP (3), som er utstyrt med den proteinogenic aminosyren L-prolin, og dipeptidet α-Phe-Pro henholdsvis er de beste substrater for TdT, og ga opphav til tailing effektivitet som tåler sammenligning den umodifiserte dTTP kontroll, selv ved konsentrasjoner ned til 10 mikrometer (søyle 1 og 4). Overraskende, analog dU t P TP (2) hvor prolin-rester er forbundet med linkerarm i trans i forhold til den frie carboxylsyre, er ikke like godt som underlag som dens motstykke cis siden polydisperse lenger store oligonukleotider blir kun observert ved høyere dNTP-konsentrasjoner (> 100 uM, felt 2). Videre, sulfonamid-modifiserte dNTP 5 er en moderat substrat for TdT, og kan sammenlignes med dU
Til slutt, er den fremgangsmåte som er beskrevet for polymeriseringsreaksjoner i henhold til PCR-betingelser ved bruk av de modifiserte analoger ganske lik den som involverer naturlig dNTPs. Imidlertid er kompatibiliteten av modifiserte dNTPs med polymerases under disse forholdene av avgjørende betydning for den generasjon av high-density funksjonszed nukleinsyrer 7, spesielt med hensyn til deres anvendelse i in vitro-utvelgelsesforsøk.
For å oppsummere, ble fremgangsmåten for syntese og karakterisering av modifiserte nukleosidtrifosfater streket, og etablering av en slik protokoll vil sikkert hjelpe i utvikling og laging av nye analoger. Samtidig, vil fremveksten av slike nye dNTPs lette generasjon av functionalized oligonukleotider; spesielt, katalytiske nukleinsyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 og PZ00P2_144595). Prof C. Leumann er til stor hjelp med å gi laboratoriet plass og utstyr, samt for hans konstant støtte. Ms Sue Knecht er anerkjent for fruktbare diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
|||
References
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
- Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
- Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
- Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
- Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
- Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
- Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
- Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
- Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
- Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
- Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
- Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
- Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
- Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
- Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
- Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
- Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
- Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
- Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
- Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
- Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
- Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
- Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
- Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
- Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
- Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
- Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
- Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
- Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
- Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
- Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
- Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
- Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
- Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
- Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
- Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
- Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
- Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
- Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
- Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
- Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
- Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
- Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
- Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
- Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
- Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
- Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
