Summary
Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.
Abstract
Vele cellulaire processen gestuurd door multisubunit eiwitcomplexen. Veel van deze complexen tijdelijk en vereisen natuurlijke omgeving te monteren. Daarom, om deze functionele eiwitcomplexen identificeren, is het belangrijk om stabilisatie in vivo voor cellysis en daaropvolgende zuivering. Hier beschrijven we een methode om grote bonafide eiwitcomplexen van Drosophila embryo's te isoleren. Deze methode is gebaseerd op embryo permeabilisatie en stabilisatie van de complexen in de embryo's door in vivo verknoping met een lage concentratie van formaldehyde, die gemakkelijk de celmembraan kan oversteken. Vervolgens wordt het eiwitcomplex plaats immuungezuiverd gevolgd door gel zuivering en geanalyseerd door massaspectrometrie. We illustreren deze methode gebruik zuivering van een Tudor eiwitcomplex, dat essentieel is voor kiemlijn ontwikkeling. Tudor is een groot eiwit, die meerdere Tudor domeinen bevat - kleinmodules die samenwerken met gemethyleerd arginines of lysinen van target eiwitten. Deze methode kan worden aangepast voor isolatie van natieve eiwitcomplexen van verschillende organismen en weefsels.
Introduction
Isolatie van multisubunit verzamelingen van eiwitten en DNA-of RNA-eiwitcomplexen wordt uitgevoerd om eiwitcomplexen, genomische loci die door DNA-bindende regulatorische eiwitten of RNA doelwitten RNA-bindende eiwitten te identificeren. Verschillende methoden is het mogelijk genoom-brede identificatie van DNA-sites herkend door transcriptiefactoren of chromatine-eiwitten (ChIP-seq) 1 en RNA targets gekoppeld aan een bepaalde RNA-bindend eiwit (CLIP-volgende) 2. De bibliotheken van RNA afkomstig cDNA of DNA doelen worden vervolgens diep sequentie. Deze methoden gebruiken chemische of UV geïnduceerde verknoping de complexen gevolgd door immunoprecipitatie (IP) stabiliseren met een antilichaam tegen een eiwit component van het onderzochte complex.
Tijdens de ontwikkeling van een organisme, veel eiwitcomplexen vormen transiënt. Daarom is het cruciaal om de samenstelling en functie van deze complexen in vivo analyse om de moleculaire mechanismen die dev beheersen begrijpeneling. Een dergelijke in vivo analyse superieur in vitro benadering is want het is vrijwel onmogelijk om natieve concentraties van de interagerende componenten en cellulaire biochemische omgeving vitro reproduceren. Hier laten we een in vivo benadering die we met succes gebruikt om grote eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's. In deze werkwijze worden eiwitcomplexen in levende embryo verknoopt met een lage concentratie van formaldehyde en vervolgens eiwitcomplexen plaats worden geïsoleerd door IP met een antilichaam tegen een bekende component van de complexen gevolgd door gel zuivering van de complexen en massaspectrometrie analyse identificeren onbekende complexe componenten. Aangezien formaldehyde kan de celmembraan doordringen en heeft een verknopende bereik van 2,3-2,7 A 3 kunnen eiwit complexen worden verknoopt in vivo en complexe componenten waarschijnlijk dicht bij elkaar bevinden. In dit artikel gaan webeschrijven deze werkwijze met de isolatie van Tudor (Tud) eiwitcomplex als voorbeeld. Tud een kiemlijn eiwit dat essentieel is voor kiembaan ontwikkeling 4-7. Dit eiwit bevat 11 Tud domeinen bekend om te interageren met brandspiritus arginines of lysinen van andere polypeptiden 8-10.
Eerder hebben we een transgene Drosophila lijn die uitdrukt HA-tag functionele Tud 5 en daarom wordt specifieke anti-HA-antistoffen gebruikt om pull-down Tud complex na verknoping gegenereerd.
Naast de eiwit-eiwit verknopingen kunnen formaldehyde nucleïnezuur-eiwit crosslinks genereren en wordt gebruikt ChIP-seq experimenten. Verder in Drosophila, in vivo verknoping met formaldehyde kon de identificatie van een RNA-doel van Vasa RNA helicase-eiwit 11.
Terwijl in dit artikel beschrijven we een methode voor in vivo verknoping en purcatie van eiwitcomplexen van Drosophila embryo, kan deze methode worden aangepast voor andere organismen en weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het bereiden van grote Appelsap-agar platen
- Om 4 borden, voeg 375 ml H 2 O, 11,25 g fly agar en een roerstaaf een 1000 ml fles. Dit is Mix A. Autoclaaf Mix A met de kolf deksel losjes afgedekt op een 30 min-sterilisatie cyclus voor vloeibare producten.
- Voeg 125 ml appelsap, 12,5 g tafelsuiker en een roerstaafje in een bekerglas van 500 ml. Dit is Mix B. Heat Mix B op een verwarmde platform roeren en de temperatuur te handhaven op ongeveer 70 ° C tot de autoclaaf van Mix A is voltooid.
- Na de voltooiing van Mix A autoclaaf, transfer Mix B naar Mix A. Blijf roeren het gecombineerde mengsel zachtjes en laat het afkoelen gedurende 15 minuten. Vermijd over-koeling en het resulteerde agar stollen vóór de toevoeging van conserveermiddel.
- Voeg 10% (gewicht / volume) methyl 4-hydroxybenzoaat opgelost in ethanol. Deze zal fungeren als conserveermiddel. Voeg 3,75 ml van de oplossing voor de hierboven appelsap agar-mengsel. Blijf roeren another 5 min.
- Giet 125 ml appelsap-agar mengsel met conserveringsmiddel in elk 300 cm 2 plastic of piepschuim plaat. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur en stollen. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het gieten.
Opmerking: Het appelsap-agar platen zijn klaar om direct te gebruiken. Bedek ongebruikte platen met heldere wraps en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
2. Drosophila Embryo Collection en Pre-verknopingsbehandeling
- Laad een bevolking kooi met ongeveer 40.000 tot 50.000 vliegen van waaruit embryo's worden verzameld.
- Maak twee platen die elk 125 ml standaard maïsmeel-melasse medium 12 en strooi ongeveer 4 g gist gedroogde bakkersgist op elk bord. Plaats deze platen in de kooi bevolking in een 25 ° C incubator gedurende 48 uur om de vliegen vet te mesten.
- 2 warme appelsap-agar platen tot 25 ° C. Strooi ongeveer 1 g gist gedroogde bakkersgist op elkeplaat. Plaats de 2 platen in de kooi bevolking te beginnen met het verzamelen 0-1 hr-oude embryo's.
- Haal de platen aan het einde van de 1 hr collectie. Vervangen door 2 nieuwe platen als een nieuwe ronde van de collectie nodig.
- Voeg genoeg water om de platen te bedekken en resuspendeer de embryo's voorzichtig met een fijn penseel. Giet de geresuspendeerd embryo's door middel van een twee lagen zeef gemaakt van roestvrij staal gaas.
Opmerking: De bovenste laag is gemaakt van middelgrote poriegrootte (850 micrometer) gaas waarin grote fly-onderdelen verzamelt terwijl het laten door embryo's. De onderste laag is gemaakt van fijn gaas (75 micrometer), die embryo's verzamelt terwijl het laten van door gist en water. - Gebruik de fijne kwast om de verzamelde embryo's te zetten in een verzameling mand gemaakt met een 50 ml buis en fijne nylon mesh. Spoel de embryo kort met water en vervolgens dep de maas op keukenpapier te drogen.
- Dompel de embryo's in 50% bleekwater met zachte wervelende gedurende 3 minuten. Spoel grondigly met water om alle resterende bleekmiddel te verwijderen. Dep het gaas op keukenpapier te drogen.
- Dompel de dechorionated embryo in isopropanol onder zacht schudden gedurende 15 seconden of totdat de afbraak van multi-embryo klonten (dit moet langer dan 30 seconden niet nemen). Dep het gaas op keukenpapier drogen.
- Dompel de embryo's in heptaan voor 5 min tijdens het gebruik van een pipet om heptaan streamen over de embryo's om ze geresuspendeerde houden. Dep het gaas op keukenpapier te drogen.
- Spoel de embryo's met stromen van fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS) die 0,1% Triton X-100 (PBST) gedurende 3 minuten.
- Demonteer de opvangbak en de overdracht van de embryo's, samen met de mesh om een 15 ml buis met 10 ml PBST. Keren de buis voorzichtig om de embryo's wassen de mesh.
- Verwijder het gaas van de buis. Zet de buis in een verticale positie en laat de embryo zinken naar de bodem van de buis door de zwaartekracht.
Opmerking: Ongeveer 100-300ul van embryo's wordt verwacht voor een 1 uur collectie van de ene kooi. - Verwijder de PBST en blijven presteren onmiddellijk verknopen.
3. In vivo verknoping van verzamelde embryo
- Bereid 0,2% formaldehyde in PBST onmiddellijk voor gebruik. Voeg 10 ml formaldehyde fixatief om de embryo's en incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 10 minuten. Gooi ongebruikte fixatief aan het eind van de dag.
- Doof de crosslinkingsreactie
- Aan het einde van de verknoping, laat de embryo zinken naar de bodem van de buis.
- Verwijder de formaldehyde oplossing. Voeg onmiddellijk 10 ml 0,25 M glycine in PBST de crosslinking reactie te blussen. Incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 5 minuten.
- Laat het embryo naar de bodem van de buis. Verwijder de demping oplossing. Was de embryo's met 10 ml PBST driemaal.
- Volledig verwijderen van de PBST was-oplossing met een pipet. WINKEL embryo bij -80 ° C tot gebruik.
4. Eiwitmonster Voorbereiding en Immunoprecipitatie
- Meng 500 ul verknoopte embryo met een Dounce homogenisator in 2 ml lysisbuffer (0,5 M ureum, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF] en protease inhibitor cocktail in PBS).
Opmerking: Voer deze en de volgende stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. - Breng de lysaat tot 1,5 ml centrifuge buizen en schud op een roterend platform voor 15 min om een grondige afbraak zorgen. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 5 minuten om celresten neer te slaan. Sla de bovenstaande vloeistof in een schone 15 ml buis.
- Voeg 40 ul anti-HA agarose korrels suspensie de supernatant en incubeer op een roterend platform gedurende 2,5 uur.
- Pellet de kralen door centrifugering bij 2500 g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, maar laat passendebatterijvak ongeveer 250 pi in de buis. Resuspendeer de kralen in de resterende supernatant en overbrengen in een 1,5 ml spinkolom met 10 urn poriën filter.
- Centrifugeer de spin kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en de stroom gooi door.
- Was de kralen door het toevoegen 200 ul wasbuffer (0,1 M glycine, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 in PBS). Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 sec en de was gooi. Herhaal de wasbeurt twee keer.
- Voeg 40 ul elutiebuffer (2 mg / ml HA-peptide in PBS) aan de kralen en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden om de 5 minuten. Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en vang het eluaat.
- Bevestig elutie van het complex door Western-blotanalyse met anti-HA antilichaam 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De effectiviteit van de verknoping en de succesvolle zuivering van het verknoopte Tud eiwit complex werden geanalyseerd door SDS-PAGE op een 3% - 7% stap gel (in figuur 1), gevolgd door Western blot (figuur 2).
Het doel van het gebruik van de 3% - 7% stap gel is gebaseerd op de effectieve scheiding van verknoopte Tud eiwitcomplex van de resterende niet-verknoopte Tud eiwit en concentratie van het complex. Onder onze in vivo verknoping bovengenoemde omstandigheden kan een groot deel van Tud eiwit nog steeds niet verknoopt. Deze gratis Tud eiwit zou met de verknoopte complex copurify tijdens IP tot scheiding door SDS-PAGE. Hoewel groot in omvang, verknoopte Tud eiwit (285 kDa) migreert in de 3% - 7% rand zonder duidelijke retentie. Overwegende verknoopt Tud eiwitcomplex met grotere molecuulgewicht moeite migreren over de gel grens, wat resulteert in th zou hebbene complex worden "gevangen" en geconcentreerd aan de grens of "tailing" vlakbij de grens en daarom scheiden van de vrije Tud eiwit.
De opname van een goede controle is van cruciaal belang om de specificiteit van deze verknoping protocol valideren. Daarom gebruikten we embryo tot expressie HA-gelabeld GFP eiwit 14 te zien op de mate van de verknoping. We hebben pilootexperimenten verschillende concentraties formaldehyde uitgevoerd (0,1% - 2%) op embryo tot expressie HA-gelabeld GFP en een deel van de resultaten (0,1% - 0,5%) hier getoond (Figuur 3). Het is duidelijk dat de absolute meerderheid van GFP eiwit in de behandelde embryo's (tot 0,5% formaldehyde) bleef verknoopte, die bevestigd dat onze verknoping protocol niet verknopen doeleiwit willekeurige omringende moleculen. In het bijzonder heeft de 0,2% formaldehyde behandeling (Figuur 3, baan 5 en 6) geen verknoopte producten laten zien in vergelijking met uncrosslinked controle (Figuur 3, baan 1 en 2), ondanks de verlengde belichtingstijd van de film, die verder gerechtvaardigd onze keuze van 0,2% formaldehyde in dit protocol. Echter, de GFP controle embryo altijd verknoopt parallel met de Tud complex verknoping onder dezelfde voorwaarden en controle GFP-eiwit monsters moeten worden uitgevoerd op de 3% - 7% stap gel met Tud complexe monsters na IP. Bovendien, zowel Tud complex en de overeenkomstige GFP controle 3% - 7% moet gel gebieden worden uitgesneden en massaspectrometrie ingediende vals positieve kandidaten die in beide Tud complex band en GFP controle zal bepalen.
De doeltreffendheid van de in vivo verknoping werd bepaald door vrije Tud eiwitten en Tud complex van niet-verknoopte en verknoopte controle embryo respectievelijk monsters (Figuur 2A). Gratis Tud eiwit uit onvermaasd controle embryo bijna exclusively gemigreerd over de 3% - grens van 7% met een minimum bedrag ingehouden buurt van het grensgebied (Figuur 2A, baan 1). Anders dan dat de verknoopte embryo toonde de aanwezigheid van grote molecuulgewicht Tud verknoopte complex in het 3% - 7% gel rand (Figuur 2A, laan 2). Dit toonde duidelijk aan dat onze crosslinking procedure succesvol ongeveer 50% van de totale Tud eiwit verknoopt met in vivo interactie partners (vergelijk Figuur 2A baan 1 en 2).
De competitieve elutie met HA-peptide bevestigde de succesvolle zuivering en versterkt de specificiteit van het gezuiverde Tud eiwitcomplex (Figuur 2B). De elutiefractie door HA-peptide bevatte het complex geconcentreerd rond de 3% - 7% grensgebied en ook gratis Tud eiwit (Figuur 2B, baan 1). De volgende SDS sample buffer geëlueerd meestal gratis Tud nog op de kralen en minimale hoeveelheid Tud complex (
. Figuur 1 Schema van de 3% -. 7% stap gel voor SDS-PAGE De 3% - 7% stap gel handmatig gegoten zodanig dat het bevat drie lagen. Van boven naar beneden, deze lagen 3% stacking gel, 3% scheiden gel en 7% gel scheiden. Om met de Mini-PROTEAN systeem (Bio-Rad) in dit manuscript, de hoogte van de 3% afscheiden gel werd ongeveer 1 cm zijn zoals weergegeven in het diagram.
Opmerking: De 3% stacking gel en de 3% te scheiden gel lagen zijn uiterst kwetsbaar dus extra voorzichtig bij het hanteren van de gel om vervorming van deze lagen te voorkomen.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. Figuur 2 Western blot resultaten van verknoopt embryo's en controle embryo lysates en zuivering van Tudor eiwitcomplex door IP Panel A, baan 1, ruw eiwit lysaat onvermaasd controle embryo's.; laan 2, ruw eiwit lysaat van formaldehyde verknoopt embryo's. Paneel B, baan 1, elutie door HA-peptide na IP uit verknoopt embryo lysaat; laan 2, elutie met 2 x SDS-monsterbuffer na de eerste HA-peptide elutie. SDS-PAGE werd uitgevoerd bij 200 V gedurende 3,5 uur. Anti-HA antilichaam (1:1000) werd gebruikt in western blot.
Figuur 3. Western blot resultaten van verknoopt embryo's en controle embryo uitdrukken HA-gelabeld GFP. Lane 1, ruw eiwit lysaat of onverknoopte controle embryo's; laan 2, hetzelfde als baan 1 maar twee keer het bedrag; laan 3, ruw eiwit lysaat van verknoopt embryo's met behulp van 0,1% formaldehyde; laan 4, hetzelfde als laan 3 maar twee keer het bedrag; laan 5, ruw eiwit lysaat van verknoopt embryo's met behulp van 0,2% formaldehyde; laan 6, hetzelfde als laan 5 maar twee keer het bedrag; laan 7, ruw eiwit lysaat van verknoopt embryo's met behulp van 0,3% formaldehyde; laan 8, hetzelfde als baan 7 maar twee keer het bedrag. Laan 9, ruwe lysaat van embryo verknoopt met 0,5% formaldehyde. SDS-PAGE werd uitgevoerd bij 200 V gedurende 45 minuten in 4% - 15% gradiënt gel. Anti-HA antilichaam (1:1000) werd gebruikt in western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formaldehyde is vaak gebruikt als een verknopende reagens voor het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties. De goede oplosbaarheid en celmembraan permeabiliteit, alsmede de verenigbaarheid met stroomafwaartse massaspectrometrie procedures maken formaldehyde een ideale kandidaat middel voor verknoping intracellulaire toepassingen 3,15-17. In het bijzonder werd met succes gebruikt om mRNA's geassocieerd met Vasa, een kritische kiemcel RNA helicase in Drosophila 11 identificeren. Daarnaast formaldehyde heeft een van de kortste spacer armen (2,3-2,7 A) onder de handel verkrijgbaar verknopingsmiddelen, hetgeen impliceert dat alleen moleculen die bestaan in de nabijheid worden verknoopt onder de juiste omstandigheden, het versterken van de specificiteit van de interagerende partners van het doeleiwit . Voor de hierboven genoemde redenen, werd formaldehyde gekozen als het verknopingsmiddel in ons protocol. Dit mag echter niet de u uitsluitensefulness andere verknoping agenten in in vivo toepassing voor Drosophila embryo's. Wij hebben echter geprobeerd dithiobis (succinimidylpropionaat) (DSP), een N-hydroxysuccinimide (NHS) ester familie verknopingsmiddel vaak in combinatie met formaldehyde in ChIP assays 17,18, formaldehyde vervangen in onze studie gebruiken, maar geen duidelijke Tud complex verkregen met dit verknopingsmiddel Anderzijds kan DSP effectief voor andere eiwitcomplexen die moeten worden bepaald op geval per geval basis. Naast in vivo verknoping aanpak zijn in vitro verknopingsmiddelen van bismaleimidohexane (BMH) family effectief gebleken bij het vastleggen eiwit-eiwit interacties in Drosophila embryo's 14,19 zijn, maar in deze experimenten de verknoping plaatsvond na embryo-extracten werden gemaakt.
De verknoping tijd, temperatuur en de formaldehyde concentratie zijn de drie belangrijkste factorenren dat verknopen efficiëntie beïnvloeden. Het protocol is conform pilootexperimenten voor elke factor, dus, is geoptimaliseerd voor het verknopen van Tud eiwit en zijn interactie partners in Drosophila embryo's in vivo, waarbij het evenwicht tussen de specificiteit van het verknoopte complex en het risico verknopen-specifieke moleculen. Niet-specifieke verknoping leidt tot de aanwezigheid van valse positieven in het complex en moet zorgvuldig worden geregeld met een niet verwant eiwit control, bijvoorbeeld GFP, dat gebruikt werd in onze experimenten. Bovendien kan de optimale verknopingsomstandigheden variëren met verschillende doelmoleculen. Daarom gebruiken ons protocol als uitgangspunt, het optimale verknoping tijd, temperatuur en de formaldehyde concentratie moet worden bepaald voor een bepaald eiwit complex plaats.
Zodra de optimale verknoping voorwaarden worden vastgesteld is het essentieel om folg ze precies elke keer dat de embryo's worden verknoopt om aspecifieke verknoping minimaliseren. Aanvullende cruciale stap wast de korrels na IP met een hoge concentratie van NaCl (1 M) en twee detergentia (IGEPAL CA-630 en Tween-20)-specifieke binding van niet-verwante eiwitten van embryonale extracten om de kralen te verminderen.
Ons protocol hangt af van de hoge affiniteit tussen het doelwit eiwit en het antilichaam gebruikt om het eiwitcomplex pull-down tijdens OT. Daarom moet epitoop van het antilichaam in het doeleiwit niet worden vernietigd door verknoping en toegankelijk voor het antilichaam in het tijdvak zijn. Bovendien moet het antilichaam-doeleiwit interactie weerstaan de strenge wasbeurten op vermindering van niet-specifieke achtergrond eiwitten. Deze eisen voor een succesvolle IP kan beletten een uit het gebruik van een specifiek antilichaam-epitoop combinatie echter, moet het mogelijk zijn om een geschikte antilichaam-epitoop paar voor een eiwit van belang te vinden. Met name HA-epitoop tag en de overeenkomstige antilichamen zijn met succes gebruikt in dit protocol.
De beschreven protocol kan worden gebruikt voor het isoleren van natieve eiwitcomplexen tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in verschillende weefsels. Hoewel we tonen deze methode Drosophila, kan ons protocol worden aangepast voor andere organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler en Jimiao Zheng voor hun technische hulp bij deze studie. Dit werk werd ondersteund door NSF CARRIERE verlenen MCB-1054962 om ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
