Summary
Mehrkomponenten-Protein-Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren verwendet, um native Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen isoliert nach in vivo Vernetzung durch Reinigung der vernetzten Komplexe für die nachfolgende Struktur-Funktions-Analyse.
Abstract
Viele zelluläre Prozesse werden von mehreren Unterproteinkomplexe gesteuert. Häufig werden diese Komplexe zu bilden vorübergehend und erfordern nativen Umgebung zu montieren. Deshalb, um diese funktionellen Protein-Komplexe zu identifizieren, ist es wichtig, sie in vivo vor der Zell-Lyse und anschließender Reinigung stabilisieren. Hier beschreiben wir eine Methode verwendet, um große Bona-fide-Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen zu isolieren. Dieses Verfahren wird auf den Embryo Permeabilisierung und Stabilisierung der Komplexe in den Embryonen von in vivo Vernetzung unter Verwendung einer niedrigen Konzentration an Formaldehyd, die leicht überqueren die Zellmembran beruht. Anschließend wird die Proteinkomplex von Interesse immungereinigt, gefolgt von der Gelreinigung und durch Massenspektrometrie analysiert. Wir veranschaulichen dieses Verfahren unter Verwendung eines Reinigungs Tudor-Protein-Komplex, die für die Keimbahn-Entwicklung ist. Tudor ist ein großes Protein, das mehrere Tudor-Domänen enthält - kleinModule, die mit methylierte Lysine oder Arginine von Zielproteinen wechselwirken. Diese Methode kann für die Isolierung von nativen Proteinkomplexe aus verschiedenen Organismen und Geweben angepasst werden.
Introduction
Isolierung von Protein aus mehreren Unterbaugruppen und DNA-oder RNA-Protein-Komplexen durchgeführt, um Proteinkomplexe, genomische Loci von DNA-bindenden regulatorischen Proteine oder RNA-Targets von RNA-bindenden Proteinen erkannt identifizieren. Verschiedene Methoden ermöglichen genomweiten Identifizierung von DNA-Stellen von Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-Proteine (ChIP-Seq) 1 und RNA-Targets mit einer bestimmten RNA-bindenden Protein (CLIP-Seq) 2 zugeordnet anerkannt. Die Bibliotheken der RNA-oder DNA-cDNAs abgeleiteten Ziele werden dann tief sequenziert. Diese Verfahren verwenden chemische oder UV-induzierte Vernetzung, um die Komplexe, gefolgt von Immunopräzipitation (IP) mit einem Antikörper gegen ein Protein-Komponente des Komplexes untersucht stabilisieren.
Während der Entwicklung eines Organismus bilden viele Proteinkomplexe transient. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zur Analyse der Zusammensetzung und Funktion dieser Komplexe in vivo, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Entwickler zu steuernelopment. Solch ein in vivo-Analyse überlegen wäre in vitro-Ansatz, da es praktisch unmöglich ist, nativen Konzentrationen der zusammenwirkenden Komponenten und zelluläre biochemische Umgebung in vitro zu reproduzieren. Hier zeigen wir eine in vivo-Ansatz, den wir verwenden, erfolgreich auf großen Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen zu isolieren. In diesem Verfahren werden Protein-Komplexe in den lebenden Embryonen mit einer niedrigen Konzentration von Formaldehyd und anschließender Proteinkomplexe von Interesse werden von IP mit einem Antikörper isoliert gegen eine bekannte Komponente des Komplexes, gefolgt von der Gelreinigung der Komplexe und Massenspektrometrie-Analyse zu vernetzenden identifizieren unbekannt komplexe Bauteile. Da Formaldehyd in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen und eine Vernetzungs Bereich von 2,3-2,7 Å 3, können Protein-Komplexen in vivo, vernetzt werden und die komplexen Bauteilen, die nahe zueinander zu sein. In diesem Artikel werden wirbeschreiben dieses Verfahren mit der Isolierung von Tudor (TUD) Proteinkomplex als Beispiel. Tud ist eine Keimbahn-Protein, die für die Entwicklung der Keimbahn 4-7 ist. Dieses Protein enthält 11 Tud Domains bekannt, mit methylierte Arginine Lysine oder von anderen Polypeptiden 8-10 interagieren.
Früher haben wir eine transgene Drosophila-Linie, die HA-markierte Funktions Tud 5 drückt, und daher wird spezifische Anti-HA-Antikörper verwendet, um komplexe Tud nach Vernetzung Pulldown generiert haben.
Zusätzlich zu Protein-Protein-Quervernetzungen können Formaldehyd Nukleinsäure-Protein-Vernetzungen zu erzeugen, und wird in der Chip-seq Experimente verwendet. Ferner ist in Drosophila, in vivo Vernetzung mit Formaldehyd hat die Identifizierung eines RNA-Ziel-RNA-Helicase-Protein Vasa 11 erlaubt.
Während in diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren für die In-vivo-und Vernetzungs purifizierung von Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen, kann dieses Verfahren für andere Organismen und Gewebe angepasst werden.
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Protocol
1. Vorbereiten Große Apfelsaft-Agar-Platten
- Um 4 Platten zu machen, fügen 375 ml H 2 O, 11,25 g Agar und Fliege einen Rührstab zu einem 1000-ml-Kolben. Dies ist A. Autoklav Mix Mix A mit dem Kolben Deckel lose auf einem 30 min-Sterilisationszyklus für flüssige Güter begrenzt.
- In 125 ml Apfelsaft, 12,5 g Haushaltszucker und einen Rührstab in einen 500-ml-Becherglas. Dies ist Mix B. Wärme Mix B auf einer Plattform unter Rühren erhitzt und die Temperatur bei ungefähr 70 ° C bis zum Autoklavieren der Mischung A ist abgeschlossen.
- Nach Abschluss der Mix Ein Autoklavieren übertragen Mix zu Mix B A. Halten Rühren der kombinierten Mischung vorsichtig und lassen Sie es 15 Minuten abkühlen. Vermeidung von Überkühlung und der Folge Agar Verfestigung vor der Zugabe des Konservierungsmittels.
- Machen Sie 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat Lösung in Ethanol. Dies wird als Konservierungsmittel dienen. Hinzufügen 3,75 ml der Lösung des oben Apfelsaft-Agar-Mischung. Halten Rühren another 5 min.
- Gießen Sie 125 ml Apfelsaft-Agar-Mischung mit Konservierungsmittel in jeweils 300 cm 2 Kunststoff-oder Styroporplatte. Lassen Sie es auf RT abkühlen und sich verfestigen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen beim Gießen.
Hinweis: Die Apfelsaft-Agar-Platten sind sofort einsatzbereit. Unbenutzte Platten mit klaren Wraps und lagern bei 4 ° C bis zu einer Woche.
2. Drosophila Embryo Sammlung und Pre-Vernetzungsbehandlung
- Legen Sie eine Bevölkerung Käfig mit etwa 40.000 bis 50.000 Fliegen aus dem Embryonen werden nicht erhoben.
- Machen Sie zwei Platten, die jeweils 125 ml von Standard-Maismehl-Melassen Medium 12 bestreuen und ca. 4 g getrocknete Bäckerhefe auf jeder Platte. Legen Sie diese Platten in der Bevölkerung Käfig in einem 25 ° C-Inkubator für 48 Stunden, um die Fliegen zu mästen.
- Warm 2 Apfelsaft-Agar-Platten auf 25 ° C Streuen Sie ca. 1 g getrocknete Bäckerhefe auf jedemPlatte. Legen Sie die 2 Platten in der Bevölkerung Käfig zu sammeln 0-1 h alten Embryonen.
- Nehmen Sie die Platten am Ende des 1 h-Sammlung. Ersetzen mit 2 neuen Platten, wenn eine weitere Runde der Sammlung benötigt.
- Fügen Sie genug Wasser, um die Platten bedeckt und resuspendieren Embryonen vorsichtig mit einem feinen Pinsel. Gießen Sie die resuspendiert Embryonen durch eine Zweischicht-Sieb aus Edelstahl-Drahtgewebe.
Hinweis: Die oberste Schicht ist von mittlerer Porengröße (850 um), die große Fliegengitterteile sammelt während der Vermietung durch Embryonen hergestellt. Die untere Schicht ist aus feinem mesh (75 um), die Embryonen sammelt während der Vermietung durch Hefe und Wasser hergestellt. - Verwenden Sie den feinen Pinsel, um die gesammelten Embryonen in einer Sammlung Korb mit einem 50-ml-Tube und feinen Nylongewebe übertragen. Mit Wasser spülen die Embryonen dann kurz trocknen Sie die Masche auf Küchenpapier trocknen.
- Tauchen die Embryonen in 50% Bleichmittel unter leichtem Schwenken für 3 min. Spülen Sie gründlichlich mit Wasser, um alle verbleibenden Bleichmittel entfernen. Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier trocknen lassen.
- Tauchen Sie die dechorionated Embryonen in Isopropanol unter leichtem Schütteln für 15 Sekunden oder bis zum Zusammenbruch der Multi-Embryo Klumpen (dies sollte nicht länger als 30 Sekunden dauern). Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier gut trocknen lassen.
- Tauchen die Embryonen in Heptan für 5 min, während mit einer Pipette, Heptan in den Embryonen zu streamen, um sie resuspendierten halten. Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier trocknen lassen.
- Ströme mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS), enthaltend 0,1% Triton X-100 (PBST) für 3 min Spülen der Embryonen.
- Zerlegen Sie den Sammelkorb und die Übertragung der Embryonen zusammen mit dem Mesh zu einem 15-ml-Tube mit 10 ml PBST. Das Röhrchen vorsichtig, um die Embryonen aus dem Netz zu waschen.
- Das Gitter aus der Tube. , Das Glas in einer vertikalen Position und ließ die Embryonen sinken auf den Boden des Rohres durch Schwerkraft.
Anmerkung: Etwa 100 bis 300ul von Embryonen für eine 1 Stunde Sammlung von einem Käfig erwartet. - Entfernen Sie die PBST und weiter zu führen sofort Vernetzung.
3. In vivo Vernetzung der gesammelten Embryonen
- Bereiten 0,2% Formaldehyd in PBST unmittelbar vor der Verwendung. 10 ml Formaldehyd-Fixierungsmittel, um die Embryonen und Inkubation bei 25 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Rundschüttler für 10 min. Nicht verbrauchte Fixierlösung bis zum Ende des Tages.
- Stillen Sie die Vernetzungsreaktion
- Am Ende der Vernetzung können die Embryonen sinken auf den Boden des Röhrchens.
- Entfernen Sie die Formaldehyd-Lösung. Sofort 10 ml 0,25 M Glycin in PBST hinzufügen, um die Vernetzungsreaktion zu quenchen. Inkubieren bei 25 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Rotationsschüttler für 5 min.
- Lassen die Embryonen sinken auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie den Löschlösung. Mit 10 ml PBST dreimal Waschen der Embryos.
- Vollständig entfernen Sie die PBST Waschlösung mit einer Pipette. Speicher Embryonen bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4. Protein-Probenvorbereitung und Immunpräzipitation
- Homogenisieren 500 ul vernetzten Embryonen mit einem Dounce Homogenisator in 2 ml Lyse-Puffer (0,5 M Harnstoff, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF] und Protease-Inhibitor-Cocktail in PBS).
Hinweis: Führen Sie dieses und die folgenden Schritte bei RT sofern nicht anders angegeben. - Transfer des Lysats in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen und schaukeln auf einer rotierenden Plattform 15 Minuten lang, um eine gründliche Lyse sicherzustellen. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren. Speichern Sie den Überstand in ein sauberes 15-ml-Tube.
- 40 &mgr; l Anti-HA-Agarosekügelchen Aufschlämmung in den Überstand und Inkubation auf einer rotierenden Plattform für 2,5 Stunden.
- Pellet die Kügelchen durch Zentrifugation bei 2.500 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, aber lassen Sie entximately 250 ul in die Röhre. Resuspendieren der Perlen in der verbleibenden Überstand und Transfer in ein 1,5-ml-Spin-Säule mit 10-um Porenfilter.
- Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 12.000 g für 10 sec und verwerfen die Strömung durch.
- Waschen der Kügelchen durch Zugabe von 200 ul Waschpuffer (0,1 M Glycin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 in PBS). Zentrifugieren Sie die Spalte bei 12.000 g für 10 sec und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie den Wasch zwei weitere Male.
- 40 &mgr; l Elutionspuffer (2 mg / ml HA-Peptid in PBS) zu den Kügelchen und Inkubation bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln alle 5 min. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 12.000 g für 10 sec und sammeln das Eluat.
- Elution des Komplexes durch Western-Blot-Analyse Bestätigen Sie mit Anti-HA-13.
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Representative Results
Schritt 7% Gel (in 1 dargestellt), gefolgt von Western-Blot (Fig. 2) - die Wirksamkeit der Vernetzung und die erfolgreiche Reinigung des vernetzten Tud Protein-Komplex wurden durch SDS-PAGE auf einem 3% analysiert.
Der Zweck der Verwendung von 3% - 7% Schritt Gel auf die wirksame Trennung von vernetzten Tud Proteinkomplex aus dem verbleibenden unvernetzten Tud Protein und Konzentration des Komplexes beruht. Unter unseren oben erwähnten in vivo Vernetzungsbedingungen, könnte ein großer Teil der Tud Protein immer noch unvernetzt. Dieser kostenlose Tud Protein würde mit dem vernetzten IP-Komplexes während copurify bis zur Trennung durch SDS-PAGE. Obwohl groß, unvernetzt Tud Protein (285 kDa) wandert über die 3% - 7% Grenze ohne offensichtliche Bindung. Während vernetzten Tud Proteinkomplex mit größeren Molekulargewicht würde Schwierigkeiten der Migration über das Gel Grenze, was th habenE-Komplex ist "gefangen" und an der Grenze oder "Tailing" in der Nähe der Grenze konzentriert und daher der Trennung von der freien Tud Protein.
Die Aufnahme einer ordnungsgemäßen Kontrolle ist entscheidend, um die Spezifität dieses Vernetzungsprotokoll zu überprüfen. Daher verwendeten wir Embryonen HA-markierte GFP-Protein exprimieren, 14, um das Ausmaß der Vernetzung zu überwachen. (- 2% 0,1%) an Embryonen HA-markierte GFP und ein Teil der Ergebnisse (0,1% - 0,5%) exprimieren Wir haben Modellversuche verschiedener Formaldehyd-Konzentrationen durchgeführt werden, da (Fig. 3) gezeigt. Es ist klar, dass die absolute Mehrheit der GFP-Protein in den behandelten Embryonen (bis zu 0,5% Formaldehyd) blieb unvernetzten, was bestätigt, dass unser Vernetzungsprotokoll nicht vernetzen Zielprotein, um zufällige umgebenden Moleküle. Insbesondere die 0,2% Formaldehyd-Behandlung (Abbildung 3, Spur 5 und 6) brachte keine vernetzten Produkten im Vergleich zu uncr zeigenosslinked Steuerung (Fig. 3, Spur 1 und 2) trotz der längeren Expositionszeit des Films, die weiter gerechtfertigt unserer Wahl von 0,2% Formaldehyd in diesem Protokoll. Schritt 7% Gel zusammen mit Tud komplexen Proben folgende IP - Allerdings sollten die GFP-Kontrolle Embryonen immer parallel mit der TUD komplexe Vernetzung unter den gleichen Bedingungen und Kontrolle GFP-Protein-Proben vernetzt werden sollte auf der 3% betrieben werden. Darüber hinaus sind sowohl Tud komplex und die entsprechenden GFP-Kontrolle 3% - 7% Gel sollte Bereiche ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie-Analyse unterzogen, um falsch-positive Kandidaten, die sowohl in der Tud komplexe Band und dem GFP-Kontrolle vorhanden sein wird zu bestimmen.
Die Wirksamkeit der in vivo Vernetzung wurde durch Vergleich kostenlos Tud Protein und Tud Komplex aus unvernetzten und vernetzten Steuer Embryonen Proben bzw. (2A) bestimmt. Kostenlose Tud Protein aus unvernetzten Steuer Embryonen fast exclusively wanderten über die 3% - 7% Grenze in der Nähe der Grenzbereich (2A, Spur 1) beibehalten minimale Menge. Im Gegensatz dazu zeigten die vernetzten Embryonen das Vorhandensein großer Molekulargewicht Tud vernetzten Komplex an der 3% - 7% Gel Rand (2A, Spur 2). Dies zeigt deutlich, dass unsere Vernetzungsverfahren erfolgreich vernetzt etwa 50% der Gesamt Tud Protein mit seiner in vivo Interaktionspartner (vgl. 2A Spur 1 und 2).
Die Wettbewerbs Elution mit HA-Peptid bestätigte die erfolgreiche Reinigung und verstärkt die Spezifität des gereinigten Tud Protein-Komplex (Abbildung 2B). Die Elution Fraktion durch HA-Peptid enthielt den Komplex, der um 3% konzentriert - 7% Grenzgebiet und auch frei Tud Protein (2B, Spur 1). Die folgende SDS-Probenpuffer eluiert meist kostenlos Tud übrigen auf den Perlen und minimalen Menge von Tud Komplex (
. Abbildung 1 Schematische Darstellung der 3% -. Schritt 7% Gel für die SDS-PAGE verwendet, das 3% - 7% Gel Schritt wird manuell in einer Weise, dass es drei Schichten enthält gegossen. Von oben nach unten sind die Schichten 3% Sammelgel 3% Trenngel und 7% Trenngel. Um mit dem Mini-PROTEAN System (Bio-Rad) in diesem Manuskript verwendet arbeiten, wurde die Höhe des 3% Trenngel, um ca. 1 cm sein, wie in der Grafik dargestellt.
Hinweis: Die 3% Sammelgel und die 3% Trenngel Schichten sind extrem empfindlich, so besonders vorsichtig beim Umgang mit dem Gel, um Verzerrungen zu dieser Schichten zu verhindern.
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. Abbildung 2 Western-Blot-Ergebnisse von vernetzten Steuer Embryonen und Embryonen Lysaten und Aufreinigung von Protein-Komplex von Tudor IP Panel A, Spur 1, Rohprotein Lysat von nicht-vernetzten Steuer Embryonen. Spur 2, Rohprotein Lysat aus Formaldehyd vernetzten Embryonen. Feld B, Spur 1, Elution durch HA-Peptid nach IP von vernetzten Embryo-Lysat; Spur 2, Elution mit 2 x SDS-Probenpuffer nach der ersten HA-Peptid-Elution. SDS-PAGE wurde bei 200 V für 3,5 Stunden laufen. Anti-HA-Antikörper (1:1000) wurde im Western-Blot eingesetzt.
Abbildung 3. Western-Blot-Ergebnisse von vernetzten Steuer Embryonen und Embryonen HA-markierte GFP-exprimierenden. Lane 1, Rohprotein Lysat of unvernetzten Steuer Embryonen; Spur 2, genau wie Spur 1, aber die doppelte Menge; Spur 3, Rohprotein Lysat von vernetzten Embryonen mit 0,1% Formaldehyd; Spur 4, gleich wie Spur 3, aber die doppelte Menge; Spur 5, Rohprotein Lysat von vernetzten Embryonen mit 0,2% Formaldehyd; Spur 6, genau wie Spur 5, aber die doppelte Menge; Bahn 7, Rohprotein Lysat von vernetzten Embryonen mit 0,3% Formaldehyd; Bahn 8, gleich wie Bahn 7, aber die doppelte Menge. Lane 9, Rohlysat von vernetzten Embryonen mit 0,5% Formaldehyd. 15% Gradienten-Gel - SDS-PAGE wurde bei 200 V für 45 min in 4% führen. Anti-HA-Antikörper (1:1000) wurde im Western-Blot eingesetzt.
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Discussion
Formaldehyd wurde üblicherweise als Vernetzungsmittel für die Identifizierung von Protein-Protein-und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Seine gute Löslichkeit und Permeabilität der Zellmembran, zusammen mit der Kompatibilität mit nachgeschalteter Massenspektrometrie Verfahren machen Formaldehyd ein idealer Kandidat für die intrazelluläre Vernetzungsmittel Anwendungen 3,15-17. Insbesondere wurde es erfolgreich eingesetzt, um mRNAs mit Vasa, einen kritischen Keimzelle RNA-Helikase in Drosophila 11 zu identifizieren. Zusätzlich hat Formaldehyd eine der kürzesten Abstandsarme (2,3 bis 2,7 Å) bei kommerziell erhältlichen Vernetzungsmittel, was bedeutet, dass nur Moleküle, die in der Nähe vorhanden sein würden unter geeigneten Bedingungen vernetzt werden, die Stärkung der Spezifität der Interaktionspartner des Zielproteins . Aus den oben genannten Gründen wurde Formaldehyd als Vernetzungsmittel in unserem Protokoll ausgewählt. Dies sollte jedoch nicht ausschließen, die usefulness andere Vernetzungsmittel in in vivo-Anwendung für Drosophila-Embryonen. Allerdings haben wir versucht, Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), eine N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester Familie Vernetzer in ChIP-Tests 17,18 häufig in Kombination mit Formaldehyd verwendet, um Formaldehyd in unserer Studie ersetzen zu verwenden, aber keine offensichtliche Tud Komplex wurde mit dieser Vernetzer Auf der anderen Seite erhalten, können DSP wirksam für andere Protein-Komplexe, die müssen auf Fall-zu-Fall-Basis bestimmt werden kann. Zusätzlich zur in vivo Vernetzungsansatz in vitro Vernetzer aus Bismaleimidohexan (BMH)-Familie haben sich als wirksam bei der Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Drosophila-Embryonen 14,19 jedoch, die in diesen Experimenten die Vernetzung erfolgte nach Embryo Extrakte wurden.
Die Vernetzungszeit, der Temperatur und der Formaldehyd-Konzentration sind die drei Hauptfaktorentoren, die Vernetzungseffizienz beeinflussen. Unser Protokoll wurde unter Verwendung von Pilotversuchen für jede einzelne Faktor, daher ist es für die Vernetzung von Tud Proteins und seiner Interaktionspartner in Drosophila-Embryos in vivo optimiert, während die Balance zwischen der Spezifität des vernetzten Komplexes und der Gefahr der getesteten Vernetzungs unspezifische Moleküle. Unspezifische Vernetzung zum Vorhandensein von falschen Positiven im Komplex und sorgfältig mit einem nicht verwandten Protein gesteuert werden, z. B. GFP, die in unseren Experimenten verwendet wurde. Zusätzlich kann die optimale Vernetzungsbedingungen mit verschiedenen Zielmolekülen variieren. Daher ist die Verwendung unser Protokoll als Ausgangspunkt, die optimale Vernetzungszeit, der Temperatur und der Formaldehyd-Konzentration muss für eine gegebene Proteinkomplex von Interesse bestimmt werden.
Sobald die optimale Vernetzungsbedingungen festgelegt werden, ist es wichtig, follow sie jedes Mal genau die Embryonen werden vernetzt, um unspezifische Vernetzung zu minimieren. Weitere entscheidende Schritt ist die Perlen nach dem Waschen IP mit hoher Konzentration von NaCl (1 M) und zwei Detergenzien (IGEPAL CA-630 und Tween-20) unspezifische Bindung von nicht verwandten Proteinen aus embryonalen Extrakten an die Perlen zu reduzieren.
Unser Protokoll hängt von der hohen Affinität zwischen dem Zielprotein und dem verwendet, um den Proteinkomplex während IP Pull-Down-Antikörper. Daher sollte Epitop in dem Zielprotein des Antikörpers nicht durch Vernetzung zerstört werden und sind für den Antikörper in IP zugänglich sein. Darüber hinaus sollte das Antikörper-Target-Protein-Wechselwirkung die strengen Waschgänge bei der Reduzierung der unspezifischen Hintergrundproteine gerichtet zu widerstehen. Diese Anforderungen für eine erfolgreiche IP könnte man von der Inanspruchnahme eines bestimmten Antikörper-Epitop-Kombination zu verhindern, sollte es jedoch möglich sein, einen geeigneten Antikörper-Epitop-Paar für ein Protein von Interesse. Insbesondere HA-Epitop-Tag und die entsprechenden Antikörper wurden erfolgreich in diesem Protokoll verwendet.
Das beschriebene Protokoll kann zur Isolierung von nativem Protein-Komplexe in unterschiedlichen Entwicklungsphasen und in verschiedenen Geweben verwendet werden. Obwohl wir zeigen, diese Methode für Drosophila, kann unser Protokoll für andere Organismen angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler und Jimiao Zheng für ihre technische Hilfe zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde von der NSF CAREER unterstützt gewähren MCB-1054962 ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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