Summary
多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。
Abstract
多くの細胞プロセスは、マルチサブユニットタンパク質複合体によって制御される。頻繁にこれらの複合体は、一過性に形成し、組み立てるためにネイティブ環境が必要です。したがって、これらの機能性タンパク質複合体を同定するためには、細胞溶解およびその後の精製の 前に、生体内でそれらを安定化することが重要である。ここでは、 ショウジョウバエの胚から大真正タンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。この方法はin vivoで容易に細胞膜を通過することができ、低濃度のホルムアルデヒドを用いて架橋することによって、胚の内側の複合体の胚の透過化と安定化に基づいている。続いて、関心対象のタンパク質複合体は、ゲル精製し、そして質量分析によって分析免疫精製される。我々は、生殖系列発達のために必須であるチューダータンパク質複合体の精製を使用してこの方法を説明する図である。チューダーは、複数のチューダードメインを含む大規模なタンパク質である - 小さな標的タンパク質のメチル化アルギニンまたはリジンと対話モジュール。この方法は、異なる生物及び組織由来の天然タンパク質複合体の単離のために適合させることができる。
Introduction
マルチサブユニットタンパク質アセンブリおよびDNA-又はRNA-タンパク質複合体の単離は、タンパク質複合体、DNA結合性調節タンパク質又はRNA結合タンパク質のRNA標的によって認識される、ゲノム遺伝子座を同定するために行われる。別の方法は、転写因子またはクロマチンタンパク質（のChIP-seqの）1と所与のRNA結合タンパク質（CLIP-seqの）2に関連するRNA標的によって認識されるDNA部位のゲノムワイドな同定を可能にする。 RNA由来のcDNAまたはDNA標的のライブラリーは、その後、深く配列決定される。これらの方法には、化学的またはUV誘導に研究複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いて免疫沈降（IP）に続いて複合体を安定させるために、架橋を使用しています。
生物の開発中に、多くのタンパク質複合体を一過形成する。したがって、デベロッパーを制御する分子メカニズムを理解するために、インビボでのこれらの複合体の組成および機能を分析することが重要であるelopment。それは、in vitroで相互作用する成分の本来の濃度と細胞生化学的環境を再現することは事実上不可能であるため、このようなin vivoでの解析は、in vitroでのアプローチよりも優れているでしょう。ここでは、我々は成功してショウジョウバエの胚から、大きなタンパク質複合体を分離するために使用して、生体内のアプローチを示しています。この方法では、生きている胚におけるタンパク質複合体は、低濃度のホルムアルデヒドで架橋され、続いて、目的のタンパク質複合体は、複合体のゲル精製に続いて複合体の既知の成分と質量分析を用いてIPに対する抗体によって単離される未知の複雑なコンポーネントを識別します。ホルムアルデヒドは、細胞膜を透過することができ、2.3〜2.7オングストローム3の架橋範囲を有するので、タンパク質複合体は、 インビボで架橋することができ、複雑な構成要素は、互いに近い可能性が高い。この記事の我々にある一例としてチューダー（TUD）タンパク質複合体の単離を使用してこの方法を説明する。 TUDは生殖細胞の発達4-7に不可欠である生殖細胞タンパク質である。このタンパク質は、他のポリペプチド8月10日のメチル化アルギニンまたはリジンと相互作用することが知られ11 TUDドメインを含む。
先に、我々は、機能TUD 5 HA-タグ化発現し、従って、特異的な抗HA抗体を架橋後TUD錯体をプルダウンするために用いられるトランスジェニックショウジョウバエ株を生成されている。
タンパク質 - タンパク質架橋に加えて、ホルムアルデヒドは、核酸 - タンパク質架橋を生成することができるとのChIP-seqの実験で使用されている。さらに、 ショウジョウバエにおいて、ホルムアルデヒドと架橋インビボでヴァーサRNAヘリカーゼタンパク質11のRNA標的の同定を可能にした。
この記事では、生体内架橋およびPURのための方法を説明しながら、ショウジョウバエ胚由来のタンパク質複合体のification、この方法は、他の生物および組織に適合させることができる。
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Protocol
1。大アップルジュース - 寒天プレートの準備
- 4板を作るために、千ミリリットルのフラスコに375ミリリットルをH 2 O、11.25グラムフライ寒天と攪拌棒を追加します。これは緩く、液体品の1 30分 - 滅菌サイクルに蓋をしたフラスコの蓋をミックスA.オートクレーブミックスAである。
- 500ミリリットルのビーカーに125ミリリットルのリンゴジュース、12.5グラムの砂糖と攪拌棒を追加します。ミックスAのオートクレーブ処理が終了するまで、約70℃で攪拌し、温度を維持しつつ、加熱されたプラットフォーム上ミックスB.ヒート·ミックスBである。
- ミックスが完了し、オートクレーブ処理すると、A.優しく合わせた混合物を攪拌してくださいミックスにミックスBを転送し、それを15分間冷ます。保存料の添加前過冷却となった寒天固化は避けてください。
- エタノール中10％（重量/体積）の4 - ヒドロキシ安息香酸メチル溶液を作る。これは防腐剤として機能します。上記のリンゴジュース寒天混合溶液の3.75ミリリットルを追加します。 anothe攪拌しておくR 5分。
- 各300センチメートル2プラスチックや発泡スチロールの板状に防腐剤を125ミリリットルのリンゴジュース寒天混合物を注ぐ。それを室温に冷却して固化してみましょう。注ぎながら、気泡の形成を避けてください。
参考：アップルジュース寒天プレートはすぐに使用する準備が整いました。クリアーラップで使用されていないプレートをカバーし、一週間まで4℃で保存する。
2。 ショウジョウバエ胚収集と前架橋処理
- 胚を収集することができる、そこから約4万〜5万ハエで人口ケージをロードします。
- ミディアム標準コーンミール、糖蜜の125ミリリットル12を含む2枚ずつ作成し、それぞれのプレート上で乾燥パン酵母の約4グラムを振りかける。ハエを太らせるために48時間25℃のインキュベーター内で人口ケージにこれらのプレートを置きます。
- 25℃まで昇温さ2リンゴジュース寒天プレートそれぞれの上に乾燥したパン酵母の約1グラムを振りかけるプレート。 0-1 HR-齢の胚の収集を開始する人口ケージに2枚を配置します。
- 1時間のコレクションの最後に、プレートを取り出します。コレクションの別のラウンドが必要な場合は、2の新しいプレートを交換してください。
- プレートをカバーし、細かいペイントブラシで軽く胚を再懸濁するために十分な水を追加します。ステンレス製の金網からなる2層の篩を再懸濁した胚を注ぐ。
注：最上位層は、胚経由せながら、大きなフライパーツを収集中程度の孔サイズ（850ミクロン）のメッシュで作られています。最下層は、酵母と水を通過させる、一方、胚を収集し、細かいメッシュ（75ミクロン）で作られています。 - 50ミリリットルチューブと細かいナイロンメッシュで作られたコレクションバスケットに集めた胚を転送するために細かいペイントブラシを使用してください。水で簡単に胚をすすぎ、その後乾燥させるために紙タオル上でメッシュをブロット。
- 3分間穏やかに旋回して、50％の漂白剤で胚を浸す。徹底的なすすぎ残りの漂白剤を除去するために水でLY。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。
- （これはより長い30秒を取るべきではありません）15秒間、穏やかに攪拌しながら、イソプロパノールまたは多胚塊の崩壊まで、絨毛膜を除去した胚を浸す。完全に乾燥さペーパータオルの上でメッシュをブロット。
- 再懸濁し、それらを維持するために胚の上にヘプタンをストリーミングするピペットを使用しながら、5分間のヘプタン中の胚を浸す。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。
- 3分間0.1％トリトンX-100（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中（PBS）のストリームに胚をすすぐ。
- コレクションバスケットを分解し、10ミリリットルのPBSTを含む15mlチューブにメッシュと一緒に胚を移す。メッシュから胚を洗浄するために静かにチューブを反転させる。
- チューブからメッシュを削除します。垂直にチューブを入れて、胚は重力によって、チューブの底に沈むましょう。
注記：約100から300胚のμlを1ケージから1時間の収集のために期待されている。 - PBSTを取り外し、すぐに架橋実行し続けています。
収集された胚の3。 インビボ架橋
- 使用直前に、PBST中の0.2％ホルムアルデヒドを準備します。胚へのホルムアルデヒド固定液10ミリリットルを加え、10分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。一日の終わりまでに、未使用の固定液を捨てます。
- 架橋反応をクエンチ
- 架橋の終了時に、胚は、チューブの底に沈むう。
- ホルムアルデヒド溶液を除去します。すぐに架橋反応を停止させ、PBST中0.25Mグリシンの10ミリリットルを追加。 5分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。
- 胚は、チューブの底に沈むましょう。クエンチ溶液を除去します。 PBSTの10ミリリットルで3回胚を洗浄します。
- 完全にPを削除ピペットを用いてBST洗浄溶液。使用するまで-80℃で保存胚。
4。タンパク質試料の調製と免疫沈降
- 2ミリリットルの溶解緩衝液中でDounceホモジナイザーを用いて500μlの架橋された胚を均質化する（0.5 M尿素、0.01％SDS、2％トリトン-X 100、PBS中の2mMのフッ化フェニルメタンスルホニル[PMSF]、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）。
注意：特に指定のない限り、このRTで、次の手順を実行します。 - 1.5ミリリットル遠心管に溶解液を移し、ゆっくりと徹底的な溶解を確実にするために15分間の回転台に揺する。細胞破片をペレット化し、5分間16,000×gで溶解液を遠心分離する。清潔な15mlチューブに上清を保存します。
- 40μlの抗HAアガロースビーズを上清にスラリー化し、2.5時間、回転プラットフォーム上でインキュベート追加する。
- 5分間2500×gで遠心分離することにより、ビーズを沈殿。上清を除去しますが、適切を残すチューブ内のximately 250μL。残りの上清中にビーズを再懸濁し、10μmの孔のフィルターを用いて1.5ミリリットルスピンカラムに移す。
- 10秒間12,000×gでスピンカラムを遠心して、フロースルーを捨てる。
- 200μlの洗浄緩衝液（0.1 Mグリシン、1 MのNaCl、1％のIGEPAL CA-630、0.1％のTween-20、PBS中）を添加することによりビーズを洗浄する。 10秒間12,000×gでカラムを遠心し、洗浄を捨てる。洗浄を2回繰り返します。
- ビーズに40μlの溶出緩衝液（2 mg / mlのPBS中のHA-ペプチド）を追加し、穏やかに撹拌しながら15分間37℃で5分毎にインキュベートする。 10秒間、12,000×gでカラムを遠心し、溶出液を収集します。
- 抗HA抗体13を用いたウエスタンブロット解析により複合体の溶出を確認してください。
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Representative Results
ウェスタンブロット（ 図2）、続いて（ 図1に示されている）、7％工程ゲル-架橋および架橋TUDタンパク質複合体の精製に成功したの有効性は3％でSDS-PAGEにより分析した。
3％の使用目的 - 7％ステップゲルを複合体の残りの未架橋TUDタンパク質および濃度の架橋TUDタンパク質複合体の効果的な分離に基づいている。上述した我々のインビボ架橋条件で、TUDタンパク質の大部分は依然として残っている未架橋の可能性がある。これ自由TUDタンパク質は、SDS-PAGEによる分離するまで、IPの間に架橋された複合体と同時精製でしょう。明らかに保持することなく、7％のボーダー - サイズが大きくても、未架橋TUDタンパク質（285 kDa）は、3％を越え移行されます。大きな分子量を有する架橋TUDタンパク質複合体は、目に得られた、難易ゲル国境を越えて移行を有するのに対しE複合体は、「トラップ」との国境に近い境界線や「テーリング」に集中しているため、自由TUDタンパク質から分離されている。
適切な制御を含めることは、この架橋プロトコルの特異性を検証することが重要です。したがって、我々は、架橋の程度を監視するためにHA-タグ化GFPタンパク質を発現する14の胚を使用した。結果（0.1％ - 0.5％）のHAタグ、GFPとの部分を表現する胚に- （2％、0.1％）、我々は別のホルムアルデヒド濃度のパイロット実験を行った（ 図3）ここに表示されます。それが私たちの架橋プロトコルはランダム周囲の分子に架橋標的タンパク質をしないことを検証する、処理された胚におけるGFPタンパク質（最大0.5％ホルムアルデヒド）の絶対的大部分が架橋されていないままであることは明らかである。 uncrと比較した場合、特に、0.2％ホルムアルデヒド処理（ 図3、レーン5および6）は、任意の架橋生成物を示さなかったさらに、このプロトコルでは、0.2％のホルムアルデヒドの我々の選択を正当化フィルムの長時間露光時間にもかかわらず、osslinked制御（ 図3、レーン1および2）。しかし、GFPコントロール胚は、常に同じ条件でTUD複雑な架橋と並行して架橋されたGFPタンパク質サンプルを制御する必要がある3パーセントで実行する必要があります。 - IPを次のTUD複雑なサンプルと一緒に7％ステップゲル。また、TUD複合体及び対応するGFPコントロールの両方の3％ - TUD複素バンドおよびGFPコントロールの両方に存在することになる偽陽性候補を決定するために、7％ゲルの領域を切除する必要があり、質量分析のために提出した。
インビボでの架橋の有効性は、（ 図2A）は、それぞれ未架橋および架橋コントロール胚試料から遊離TUDタンパク質およびTUD複合体を比較することによって決定した。ほとんどexclusivel非架橋対照胚から自由TUDタンパク質境界領域（ 図2A、レーン1）の近くに保持し、最小限の量の7％のボーダー- yが3％間で移行。 7％のゲル境界線（ 図2A、レーン2） -それに反して、架橋された胚を3％大きい分子量TUD架橋複合体の存在を示した。これは明らかに、我々の架橋処理が正常（ 図2Aレーン1を比較し、2）そのインビボ相互作用パートナーとTUD総タンパク質の約50％が架橋されたことを示した。
HA-ペプチドとの競合溶出が成功し、精製を確認し、精製されたTUDタンパク質複合体（ 図2B）の特異性を強化しました。 7％の境界領域にも自由TUDタンパク質（ 図2B、レーン1） - HA-ペプチドによる溶出画分は3％付近に集中し、複雑を含んでいた。以下のSDSサンプル緩衝液を溶出TUDが（ビーズおよびTUD錯体を最小量の残りの大部分は遊離に
図1は、3％のダイアグラム- SDS-PAGEに用いる7％工程ゲルを 3％ - 7％ステップゲルを手動で3層を含むように鋳造される。上から下に、これらの層は3％のスタッキングゲル、3％分離ゲルと7％分離ゲルである。本稿で使用ミニPROTEANシステム（Bio-Rad）を用いて動作するように、3％分離ゲルの高さは、図に示したように約1cmとした。
注 ：3％スタッキングゲルと3％の分離ゲル層がゲルを処理するときにそのように、これらの層の歪みを防止するために余分な注意して非常に脆弱である。
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。。図2に架橋胚および対照胚溶解物およびIPパネルA、レーン1 によるチューダータンパク質複合体の精製の ウエスタンブロットの結果 、非架橋対照胚の粗タンパク質溶解物;レーン2、ホルムアルデヒド架橋した胚からの粗タンパク質溶解物。パネルB、レーン1、架橋胚溶解物からIP後のHA-ペプチドによる溶出;レーン2は、初期HA-ペプチド溶出後2×SDSサンプルバッファーによる溶出。 SDS-PAGEを、3.5時間、200 Vで泳動した。抗HA抗体（1:1,000）を、ウェスタンブロットに使用した。
図3。HA標識GFPを発現する架橋した胚と対照胚のウエスタンブロットの結果。レーン1、粗タンパク質溶解物OF非架橋対照胚;レーン1が、倍の量と同じレーン2;レーン3、0.1％のホルムアルデヒドを用いて架橋された胚の粗タンパク質溶解物;レーン3が、倍の量と同じレーン4;レーン5、0.2％ホルムアルデヒドを用いて架橋された胚の粗タンパク質溶解物;レーン5が、倍の量と同じレーン6;レーン7、0.3％ホルムアルデヒドを用いて架橋された胚の粗タンパク質溶解物;レーン7が、倍の量と同じレーン8、。レーン9、0.5％ホルムアルデヒドを用いて架橋された胚の粗溶解物。 15％の勾配ゲル - SDS-PAGEを、4％で45分間、200 Vで泳動した。抗HA抗体（1:1,000）を、ウェスタンブロットに使用した。
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Discussion
ホルムアルデヒドは、一般的に、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用を同定するための架橋剤として使用されている。一緒に下流の質量分析手法との互換性との良好な溶解性および細胞膜透過性は、ホルムアルデヒド、細胞内架橋アプリケーション3,15-17のための理想的な候補薬剤を作る。特に、正常ヴァーサ、 ショウジョウバエ 11において重要な生殖細胞RNAヘリカーゼに関連付けられたmRNAを同定するために使用した。近接して存在する唯一の分子は、標的タンパク質の相互作用パートナーの特異性を強化する、適当な条件下で架橋されることを意味し、市販の架橋剤のうち、 - （2.7オングストローム、2.3）、さらに、ホルムアルデヒドは最短のスペーサーアームのいずれかを有する。上述の理由により、ホルムアルデヒドは、我々のプロトコルにおいて、架橋剤として選択した。しかしながら、これは、uと除外すべきではないショウジョウバエの胚のためのin vivoアプリケーション内の他の架橋剤のsefulness。しかし、明らかなTUDはジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、しばしば我々の研究でホルムアルデヒドを置き換えるために、ChIP解析17,18ホルムアルデヒドと組み合わせて使用されるN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルファミリーの架橋剤を使用しようとしないが、き複合体は、一方この架橋剤を用いて得られた、DSPは、ケースバイケースで決定する必要がある他のタンパク質複合体に有効であるかもしれない。胚抽出が行われた後のin vivoの架橋アプローチに加えて、ビスマレイミドヘキサン（BMH）ファミリー由来のインビトロ架橋剤は、 ショウジョウバエの胚14,19におけるタンパク質-タンパク質相互作用を捕捉するのに有効であることが示されているが、これらの実験において架橋が起こった。
架橋時間、温度およびホルムアルデヒド濃度は三つの主要なファクある架橋効率に影響を与える役。我々のプロトコルは、架橋複合体の特異性とリスクとのバランスを維持しつつ、従って、それは、 インビボで TUDタンパク質の架橋およびショウジョウバエ胚におけるその相互作用パートナーのために最適化された、それぞれの個々の要因のために、パイロット実験を用いて試験されている非特異的な分子を架橋する。非特異的架橋は、我々の実験で使用された例、GFP、のために、複合体における偽陽性の存在につながり、慎重に無関係なタンパク質コントロールで制御されなければならない。また、最適な架橋条件は、異なる標的分子によって変わり得る。従って、出発点としてのプロトコルを使用して、最適な架橋時間、温度およびホルムアルデヒド濃度は、対象の所与のタンパク質複合体について決定されなければならない。
最適な架橋条件が確立されると、それはfoのに重要である正確に胚を、非特異的架橋を最小限にするために架橋されるたびに、それらをLLOW。追加の重要なステップは、胚抽出物からビーズへの無関係なタンパク質の非特異的結合を減少させるために、高NaCl濃度（M 1）と二つの界面活性剤（IGEPAL CA-630およびTween-20）で洗浄した後にIPビーズを洗浄する。
我々のプロトコルは、標的タンパク質との間にIPタンパク質複合体をプルダウンするために使用される抗体との間の高い親和性に依存する。したがって、標的タンパク質中の抗体のエピトープは、架橋によって破壊されるべきでないとIPの間、抗体のためのアクセス可能でなければなりません。加えて、抗体 - 標的タンパク質相互作用は、非特異的バックグラウンドタンパク質の減少を目的としたストリンジェントの洗浄に耐えるべきである。成功したIPのためのこれらの要件は、特定の抗体 - エピトープの組み合わせを採用するから1を防ぐかもしれない、しかし、それは、目的のタンパク質に対する適切な抗体 - エピトープ対を見つけることが可能であるべきである。特に、HA-タグエピトープおよび対応する抗体は、正常にこのプロトコルで使用されてきた。
記載されたプロトコルは、異なる発生段階の間および異なる組織における天然のタンパク質複合体の単離のために使用することができる。我々はショウジョウバエのためにこの方法を実証しているが、我々のプロトコルは、他の生物に適合させることができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、この研究とその技術のヘルプはジョーダン·デイビス、ヤンヤン林、エリックSchadlerさんとJimiao鄭に感謝します。この作品は、AlaへのMCB-1054962を付与NSFのキャリアによってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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