Summary
세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.
Abstract
조직 형태를 유지하기 위해 물리적 지지체되는 외에, 세포 외 기질 (ECM)가 활발히 개발과 기관의 항상성 동안 세포 및 조직 기능 조절에 관여한다. 그것은, 생리 활성 ECM 단백질 조각의 출시를 통해 같은 생화학 생체 역학 및 생물 물리학 적 신호 전달 경로를 통해 작용하는 조직의 장력을 조절하고, 세포의 이동에 대한 경로를 제공함으로써 그렇게한다. 종양 미세 환경의 세포 외 기질을 분해, 증착 및 원 섬유 및 비 섬유 성 기질 단백질의 조직을 특징으로 상당한 개조를 겪는다. 종양 미세 환경의 기질 보강은 종양의 성장과 침윤을 촉진하고, 혈액과 림프 혈관의 리모델링을 일으킬 수 있습니다. 기질 단백질의 라이브 영상은, 그러나,이 점에 매트릭스 성분의 대다수 L 떠나는 다 광자 현미경을 사용하여 제 고조파 발생에 의해 검출 될 수있는 섬유 성 콜라겐에 한정argely 보이지 않는. 여기에서 우리는 세포 외 기질 단백질과 표면 형광 및 두 광자 현미경을 사용하여 살아있는 생쥐에 노출 된 조직의 intravital 이미징의 immunolabeling, 얇은 지느러미 귀 피부 종양 접종에 대한 절차를 설명합니다. 우리의 intravital 촬상 방법은 성장하는 피부 종양의 맥락에서 원 섬유 및 비 - 섬유 성 매트릭스 단백질 양의 직접 검출을 허용한다. 우리는 지역의 매트릭스 수축에 의한 혈관 리모델링의 예를 보여줍니다. 우리는 또한 두 번째 고조파 발생 검출 종양 섬유 성 매트릭스 우리는 또한 종양 세포 및 종양 세포와 T-세포 상호 작용의 장기간 (13 시간) 이미징을 보여 그러한 테나의 C.로서 새롭게 증착 행렬 요소로부터 공간적으로 구별되는 것으로 발견 기저막의 콜라겐 IV를 따라 이동. 종합적으로,이 방법은 고유 수 prov 수도 종양 세포의 동시 검출, 물리적 미세 시간 이상의 내인성 조직 면역 반응을 허용종양의 진행 및 궁극적 인 성공 또는 치료에 저항을 기본 메커니즘에 IDE 중요한 통찰력.
Introduction
염증, 전이 행렬 리모델링 과정의 intravital 이미징 연구의 중요한 영역이다 형광 단백질 1,2을 표현하는 다수의 유전자 변형 기자의 마우스 모델을 만드는 동기를 부여하고있다. 인해 이미지 품질을 감소시키고 제한 조직을 통해 침투 빛 포커스 아웃 형광 신호에, 촬상 두꺼운 티슈는 공 초점 또는 다중 광자 주사 현미경 3 가능. 빠른을 사용하여 저렴하고 복잡한 표면 형광 현미경은 같은 닭 리오 - 뇨 막 (4) 또는 마우스 귀 진피 5로 거의 2 차원의 조직이 가능합니다. 대부분의 이미징 시스템은 세포 유형 특정 방식으로 다양한 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 활용. 이들 단백질이 약한 광독성을 제공하더라도, 이들은 면역 반응 6을 유도한다. 더욱이, 특정 세포 아형 전환하거나 표 어렵다이러한 변화에 따라 IR의 기초 또는 활성화 된 상태는 새로운 유전 모델의 준비가 필요합니다. 형광 단백질의 발현은 일반적으로 세포 내 구획으로 제한 될 때 또, 통상 기저막 단백질 또는 조직 케모카인 예금 7 같은 화상 세포 구조하는 것은 불가능하다. 대신, 세포 항원에 대한 항체를 간접 표시는 거의 모든 세포 형 또는 매트릭스 특정 구성 요소 8,9를위한 유연성을 제공합니다. 그러나,이 라벨 방식의 가장 큰 단점은 보완 시스템에 의존 세포 독성 및 세포와 세포 외 구조 (10)의 식균 작용을 트리거 할 수있는 항원 - 항체 면역 복합체에 의해 매개되는 면역 독성과 관련이 있습니다.
염증이나 상처 치유 동안 세포 종양 미세 환경의 매트릭스뿐만 아니라 정상 조직으로는 상당한 개조를 겪는다. 종양 미세 환경의 기질 보강은 프로모션 할 수스트레스로 인해 유발 신호 전달 메커니즘과 혈액과 림프 혈관 (11)의 원인이 리모델링에 테 종양의 성장과 침략. 그러나, 매트릭스 단백질의 라이브 영상은 다중 광자 현미경을 사용하여 제 고조파 발생에 의해 검출 될 수있는 섬유 성 콜라겐에 한정된다. 최근 우리는 묘화 세포 및 조직 구조 (5)에 광 및 면역 독성 손상의 위험을 최소화하는 신규의 intravital 촬상 방법을 발표 하였다. 연속의 intravital 시각화 한 라운드 2 시간 12-17 30 분의 범위이다 설립 이미징 기술과 비교하면, 우리의 intravital 면역 형광 (IF) 기술은 12 시간 (장기 8) 촬상 허용. 이는 촬상 시간은 우리 동물 프로토콜에 정의 된 한계로 인해 12 시간 제한 만 연장 될 수 없다는 기술적 이의 징후가 없다는 것을 유의하는 것이 중요하면 혈압과 심장 같은 동물의 임계 상태 변수,환율 8을 제어합니다. 또한, 자동화 된 형광 실체 현미경을 이용하여, 우리는 하나의 실험 기간 동안 다수의 분야에서 이미지를 수집 할 수 있었다 기능적 혈액 및 림프관에 의해 지원 피부의 생리 컨텍스트에서 발생한 희귀 면역 및 리모델링 과정을 관찰했다. stereomicroscopic 렌즈는 비교적 큰, 2cm의 작동 거리를 가지며 이광자 현미경 광학 대조적 수침 기화 필요로하지 않기 때문에, 장기간의 촬상은 형광 실체 현미경을 이용하여 수행 하였다. 의 intravital IF는 정상적인 피부의 세포 외 기질 성분의 면역 표지 및 검출을 허용했다. 이 기술의 디자인은 유해 immunotoxic 효과에게 5를 유발하지 않고 살아있는 세포 및 수술 노출 된 마우스 진피에 조직 매트릭스 요소에 대한 면역 염색을 사용하는 혁신적인 개념을 기반으로합니다. 수술 자체가 진피에 안전그것은 단지 독립적으로 자율적으로 혈액에 의해 공급 및 별도의 림프 순환에 의해 배수, 신경 지배하는 귀에 두 개의 피부 층의 분리에 의존로 혈관. 우리의 실험 장치는 허용 혈액과 림프 혈관과 상처 치유 과정과 백혈구의 인신 매매를 포함하여 최소 12 시간 이상 중요한 병리 생리 학적 이벤트의 범위의 영상. 해당 출판물, 우리는의 intravital 이미징의 다양한 분야에서 최첨단의 기준에 우리의 기술을 비교했다. 결과적으로, 우리는 초기 림프관 15수록 대신 예상들이 면역 세포의 고유 시각화 백혈구 등의 다양한 유형에 의해 혈관 외 유출 및 림프 intravasation 이벤트를 관찰했다. 또한, 다른 그룹 9,18 수행 관찰을 보완, 우리는 생체 CCL21의 수집에 있지만 자주 초기 림프관에 강한 불연속 예금을 형성 할 수있는 것으로 나타났습니다.
19로 크게 미개척는이다 테나의 C와 같은 매트릭스의 분자를 포함하는 동적 종양 미세 환경의 맥락에서 영상 암 세포의 침공에 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 종양의 섬유의 행렬은, 두 번째 고조파 발생 검출, 또한, 우리는 지역의 매트릭스 수축에 의한 혈관 리모델링의 예를 설명하는 긴 테나 C. 구성 새로 입금 매트릭스보다 종양 미세 환경의 서로 다른 위치를 차지하는 발견 종양 세포 기저막의 콜라겐 IV를 따라 종양 세포의 이동과 함께 T-세포 상호 작용의 기간 (13 시간) 촬상. 동시에 이러한 혈관 PE 등 지역 생리적 파라미터를 기록하는 동안 이러한 이벤트가 몇 군데 있습니다rmeability 및 림프 배수.
Protocol
동물에서 수행되는 모든 절차는 스위스 동물 보호법, 동물 보호에 관한 조례 및 동물 실험의 조례에 따라 설치했다. 구체적으로 본 연구를 승인 : 우리는위원회의 감시 카메라 드 난 일으키려는 데 Vaud의 (2687 허가 번호)라는 이름의 우리의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)이 있음을 확인합니다.
귀 1. 종양 접종
- DMEM + 10 % FBS 미디어를 사용하여 10cm 배양 접시에있는 문화 B16-F10-GFP 흑색 종 세포.
- 세포를 80 ~ 90 % 년 합류 때, PBS로 씻어 트립신에 의해 그들을 분리. 4 ° C에서 5 분 1,500 XG에서 세포를 스핀 다운 1 ㎖ 링거액에 펠렛을 재현 탁하고 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. 다시 스핀 그냥 펠렛 위 유지 매체의 얇은 층을 제외한 모든 뜨는을 제거합니다. 두꺼운 세포 슬러리 결국 세포를 Resuspend.
- KET의 혼합물로 마우스를 마취아민 / dorbene [medetomidine (75mg/kg-1mg/kg)과 동물이 충분히 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. 경우의 움직임에 0.1 %의 단계에서 이소 플루 란의 농도를 증가 (발 예 : 철수) 관찰된다. 전체 절차를 수행하는 동안 직장 서미스터 제어 가열 패드 (37 ℃)에 마우스를 유지하고 적절한 안과 연고와 눈을 보호합니다.
- 해밀턴 주사기 (33 G 바늘, 10 ㎖ 주사기 볼륨)을 준비합니다. 바늘 끝의 캡을 제거하고 팁 챔버의 상부에 세포 슬러리의 20 μl를로드합니다. 5 ㎖ 슬러리 주사기 내부에로드 될 때까지 플런저를 뒤로 당기십시오. 팁 챔버로부터 여분의 슬러리를 제거하고 팁 뚜껑을 닫습니다.
- 접착 테이프를 이용하여, 검지 손가락의 선단에 귀 기단을 고정한다. 45 ° 각도에서 천천히 등쪽 진피와 연골 사이의 해밀턴 주사기 바늘을 삽입합니다. 일단 내부에, 2 ~ 3 mm를 위해 말단에 이어 근위 침투.
- 3 μL 세포 슬러리를 주입하고 천천히 귀에서 바늘을 철회.종양 세포를 7-9 일간 고형 종양 형성 및 형광 실체 현미경을 이용하여 종양 성장을 수행하자.
- 또한, 조직의 매트릭스와 종양 세포의 상호 작용의 초기 단계를 수행하기 위해, (단계 3.3 이후) 노출 및 스테인드 귀 진피에 링거액에 부유 100,000 종양 세포의 50 μl를 적용합니다.
2. 귀 수술
- 사흘 실험하기 전에, 마우스의 머리를 면도 머리와 귀 (10 ~ 15 초) 주변의 털을 뽑다와 물로 씻어.
- 가습 산소와 이소 플루 란 (3-4 % 년 유도, 1 ~ 2 % 유지)의 혼합물로 마우스를 마취하고 동물이 충분히 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. 경우의 움직임에 0.1 %의 단계에서 이소 플루 란의 농도를 증가 (발 예 : 철수) 관찰된다. 전체 절차를 수행하는 동안 직장 서미스터 제어 가열 패드 (37 ℃)에 마우스를 유지하고 자사의 눈을 보호적절한 안과 연고.
- 8 붙어 유리 조직학 슬라이드 만들어진 플랫폼을 구축 할 수 있습니다. 그 뒷면에 마우스를 켜고 조심스럽게 유리 슬라이드의 스택에 종양 베어링 귀를 놓습니다. 스택에 귀 앞쪽과 뒤쪽 가장자리를 흥분하는 접착 테이프의 작은 줄무늬를 사용합니다.
- 메스를 사용하여 마우스 날개의 이륜 따라 귀의 복부 피부를 잘라. 곡선 핀셋의 도움으로 조심스럽게 복부와 진피 종양이 접종 등의 진피에서 연골을 벗긴다. 등의 진피를 노출, 곡선 집게로 복부 피부와 연골을 잡아 당깁니다. NOTE : 귀의 주요 혈관이 절단되거나 혈행이 15 분 내에 정상 유동에 반환하지 않는 경우, 귀 이미징에 사용될 수 없다. 항상 링거 완충액을 사용하여 습식 열린 귀 피부를 유지 및 커버 슬립을 사용하여 습도를 보호한다.
- 경우 지속적인 출혈 형태의 종양 혈관은 100 μl를 추가하여 출혈을 멈추게,이트롬빈 5 분 귀의 상단에 링거 완충액 (102 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘, 28 MM의 젖산 나트륨) (5 U / ㎖).
- 링거 버퍼의 약 5 ㎖로 두 귀를 씻고 살균 물티슈 여분의 액체를 제거합니다. 즉시 (어떤 점에서 열린 귀를 건조하게하지 않는다!) 다음 단계로 진행합니다.
3. 면역 형광 염색법
사용 링거 버퍼는 사람의 혈청 (1시 10분), 인간 IgG에 마우스 클론 차 항체 (1시 50분), 125 IU / ㎖ (2.5 ㎎ / ㎖) 모든 염색 단계 아프로 티닌 (버퍼를 차단)로 보충. 아프로 티닌은 수술 후 발생할 수있는 초기 출혈을 제한하는 플라스 홍보 응고를 억제한다.
- eminentia의 conchae에 오픈 진피와 귀 부분을 접어 살균 물티슈 외부 미개봉 귀 진피를 건조. 전방 및 후방 dorsa에 수술 접착제의 0.5 μl를 적용하여 유리 슬라이드의 스택에 귀를 고정시킨다L 가장자리. 그런 다음, 부드럽게 유리에 지느러미 귀 진피를 평평하게.
- 노출 귀에 차단 버퍼 100 μL의 총 부피의 10 ㎍ / ㎖의 농도에서 세포 외 기질 분자를 대상으로 일차 항체를 적용합니다. 귀 가장자리에 건조 염색 용액을 방지하기 위해 커버 슬립으로 귀를 커버. 15 분 동안 품어. 링거 버퍼의 약 5 ㎖로 두 귀를 씻으십시오.
- 노출 귀에 차단 완충액 100 ㎕의 총 부피의 10 ㎍ / ml의 농도에서 적절한 이차 항체 또는 스트렙 타비 딘 컨쥬 게이트 (예컨대 594 ㎚ 이상 647 나노 미터와 같은 높은 여기 파장과 형광체가의 intravital 이미징 유리한) 적용. 커버 슬립과 귀를 덮고 15 분 동안 품어. 링거 버퍼의 약 5 ㎖로 두 귀를 씻으십시오.
현장에있는 종양 세포와 혈액을 매개로 활성화 된 비장 세포 4. 상호 작용
- 칠일 inoculatio 후N congenic 마우스의 뒷면 피부에 GFP-B16-F10 흑색 종으로, 동물을 안락사 및 비장를 수집합니다. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 비장의 기계적 장애와 비장 세포를 분리.
- 레드 CMTPX 세포질 얼룩 (PBS 1 μM)와 37 ° C에서 13 분 동안 라벨 비장 세포, 4 ° C에서 15 ㎖에 4 번 씻어 낸 후 그의 귀했다 쥐의 꼬리 정맥에 200 ㎕의 혈청 배지에 주입 칠일 이전 B16-F10-GFP 접종.
실체 현미경을 사용하여 5.의 intravital 이미징
- 단기 영상 (최대 2 시간)의 경우, 7.5 (아스 코르 빈산 - 링거 버퍼 최종의 pH에서 140 밀리미터 아스 코르 빈산 나트륨, 10 mM의 HEPES, 4 mM의 KCl을 5 ㎜ 염화칼슘을 포함하는 새로 제조 된 멸균 아스 코르 빈산 - 링거 버퍼를 추가 고정 된 귀 위에 삼투압 320 mOsM). 커버 슬립과 귀를 덮고 배 렌즈와 형광 실체 현미경을 사용하여 영상을 시작합니다.
- 장기 이미징을위한(이상 2 시간), 약 0.5 cm 떨어져 귀에서, 커버 슬립 아래 (아스 코르 빈산 - 링거 버퍼를 포함하는 저장소에 연결) 바늘의 출구를 배치합니다. 지속적으로 커버 슬립 아래 챔버에 아스 코르 빈산 - 링어의 버퍼를 제공하기 위해 1 μL / 분의 속도로 연동 펌프를 사용합니다.
- 1X 렌즈 2 배 렌즈 (작동 거리 6cm) (작동 거리 2cm)를 변경합니다. 수집 소프트웨어를 열고 형광 실체 현미경의 설정을 구성합니다. 카메라의 설정은 화상의 색 농도로 12 비트를 선택하고 5.1 % (최대)로 0 % (최소)에서 계조 값의 카메라 범위를 조정하고, 감마 보정을 2로 설정.
- 설정 취득 1 (최소), 1000 형광 강도 (최대), 배율 280X-320X로 설정 (노출 시간이 1 초 이하 연결해야한다)에 또는 아래에 노출 피하고 노출 시간을 조절하려면 이득. 촬상 필드 (20, 보통 10), 취득주기위한 시간 간격의 수에 의존하는 수 설정해야2 분에 1 트위닝. 단축 시간은 표백과 광독성을 일으킬 수 있습니다.
- 종양 세포뿐만 아니라 (예 : 그림 3에서와 같이) 스테인드 ECM 단백질을 포함하는 여러 필드를 선택합니다. 자동화 된 단계를 사용하여, 시간 (예를 들어, 매 2 분)을 통해 (예 : GFP와 그림 3의 형광 647 등) 적절한 형광 채널의 이미지를 수집.
- 실험 후, 동물 기관 가이드 라인에 따라 마우스를 안락사. 이 경우, 실험의 끝에되어 출혈 (심장 내 관류) 뒤에 경추 탈구하여 마취 된 마우스를 안락사.
다 광자 현미경을 사용하여 6.의 intravital 이미징
- 실리콘 그리스를 사용하여 귀의 기부에서 시작하여, 약 2 ㎝ 직경 귀 2-3 밀리 높이의 원형 벽을 구축. 확인 새기 점은 없는지 확인하십시오. 아스 코르 빈산 - 링어의 버퍼 원을 입력합니다.
- 장소 마우스무대에서 가열 패드를 연결합니다 (37 ℃).
- 열기 수집 소프트웨어 및 다 광자 현미경의 설정을 구성합니다.
- 종양 세포 (예 :도 3에서와 같이) 스테인드 ECM 단백질을 함유 개의 다른 필드까지 선택. 이 예, 조정에서 GFP 850 nm의 티 - SAPHIRE 레이저 형광 647 염색에 대한 후속 단일 광자 647 신호 및 SHG와 원 섬유 콜라겐을 시각화. 1.00 NA 렌즈와 2mm 작동 거리와 물 침수 HCX APO 20X와 (예 : GFP와 그림 3의 형광 647 등) 적절한 형광 채널의 이미지와 시간에 두 번째 고조파 발생, 예를 들어, 매 2 분, 취득.
- 실험 후 일어난 과다 출혈 (심장 내 관류) 다음 자궁 경부 전위 마취 마우스를 안락사.
Representative Results
지금까지 살아있는 조직 면역 염색은 전형적으로 높은 염색 배경 및 면역 독성 (20)로 이어지는 면역 복합체의 형성에 사용되지 않습니다. 이 따라서 이후의 간접 강한 면역 염색에이 세포를 "눈부신", 조직의 대 식세포에 Fcγ 수용체를 사전에 차단하여 극복 하였다. 라벨이 세포되면서, 광독성 및 형광 표백 천연 항산화 버퍼, 삼투 성 아스 코르 빈산 (그림 1A)에서 조직의 침수에 의해 제어 될 수있다. photobleaching에 지금은 억제하지만 완전히 (그림의 1B)를 방지 할 수있다뿐만 아니라 수 있도록이 방법 5 우리의 초기 설명 이후, 우리는 우리의 안티 표백 및 안티 광독성 기술을 개선. 이것은 귀는 고정되어 챔버 내의 산화 방지제 (100 μL)의 큰 볼륨에 귀를 포함하여 수행됩니다. 사진 때 삼백초 일정 이미징 시간 영상 10 시간에 해당합니다500 밀리 초 1 분마다 (평균 영상 설정)에 대해 수집.
그림 1. 광표백 및 광독성은 링거 버퍼에 아스 코르 빈산으로 염화을 교체하고 그 용액 100 ㎕의 양에 노출 된 귀를 삽입하여 중지되었습니다. (A) 조직은 콜라겐 IV, 기저막의 구성 요소에 대한 비오틴 항체를 먼저 염색했다. 염색은 나중에 스트렙 타비 딘-647 (레드)로 검출 한 후 지속적으로 정상적인 링거 버퍼 (상단 패널) 또는 아스 코르 빈산 - 링거 (하단 패널) 중 하나를 300 초 동안 몇 군데 있었다. 사진을 500 밀리 초 1 분마다 (보통 이미지 설정)에 대해 수집하는 경우 삼백초 일정 이미징 시간 영상 10 시간에 해당합니다. 파이의 가장 밝은 25 %XEL 강도 값은 녹색으로 표시됩니다. 면역 붕괴 (B) 정량 (링거 대에서 50 % 아스 코르 빈산 - 링거 0 %). 밸류는 초기 형광 정상화 하였다. 면역 형광 실체 현미경으로 수집 한 이미지. 의 스케일 바는 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전이성 종양 세포 및 종양 기질 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 종양 세포 이동 및 종양 면역의 과정을 이해하는 것이 중요하다. 종양 - 관련 기질은 종양의 질량의 90 %까지 구성하고있다 적극적 종양의 성장 및 전이성 확산 (21)을 조절하기 때문이다. 그러나, 림프 혈관 등 어느쪽으로 매트릭스 드라이브 종양 세포의 이동이 22 부족 방법으로 기계적인 통찰력. 이 사실에 부분적으로 기인하는 메신저의 intravital기질 단백질의 숙성이 광자 현미경 (23)에 제 고조파 발생을 이용하여 섬유 성 콜라겐의 숙성 된 섬유의 시각화에 한정된다. 따라서, 우리는 세포 외 기질 성분의 직접적인 시각화를 포함하는 혈액과 림프 혈관, 혈관 주위 세포, 신경, 근육과 지방 세포를 포함한 조직의 미세 환경의 시각화를위한 우리의 방법을 적용. 대부분의 구조는 콜라겐 IV 또는 perlecan (그림 2A), 그러나, 특정 세포 표면 마커에 대한 직접적인 염색, 예를 들면 Lyve1 (그림 2B 및 C) 및 podoplanin 등의 기저막 구성 요소에 대한 면역 염색 후 자신의 형태에 따라 구분 될 수있다 (그림 .) - 2C), 더 초기, 모세 림프관 림프 수집에서 (Lyve1 +) (Lyve1을 구별 할 수 있습니다. 피부에 매트릭스 바인딩 CCL21 발현이 관찰하는 림프 수집 IDE의 기저막에이 케모카인의 예금을 밝혀perlecan의 염색, 헤파 란 황산 프로테오글리칸 (그림 2D)으로 ntified.
일반 마우스 귀에서 라이브 염색 2. 예를 그림. (A) perlecan위한 염색 기저막 성분은 모든 혈액 및 림프관, 신경, 근육 섬유 및 지방 세포를 나타낸다. (B) Lyve1 염색은 초기 임파 모세 혈관 망을 표시한다. Lyve1 및 podoplanin, 팬 림프 마커에 대한 (C) 공동 염색 초기 및 수집 림프관의 네트워크를 보여줍니다. 지느러미 귀 진피가 귀 진피로 (광 절편 제외) 클래식 표면 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다 그렇지 않으면 이미징 분야를 커버 할 지방 세포의 낮은 번호가 있습니다. (D) CCL21의 스테인레스 perlecan (빨간색)에 스테인드 림프 기저막에 닝 (녹색). 면역 형광 실체 현미경으로 수집 한 이미지. A와 B의 스케일 바, 1mm; C에, 100 μm의 D에 50 ㎛가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
가장 중요한 것은, 일반적 SHG, 고전 행렬 검출 방법 (23)에 의해 검출 될 수없는 구조 단백질이 가시화 될 수있다. 예를 들어, 우리가 테나의 C (도 3a), 종양 발생 동안에 발현되는 매트릭스 단백질을 발견, 상처 치유 및 염증 (19)는 섬유 성 콜라겐 (도 3B)에 비해 종양 기질의 서로 다른 위치에 증착된다. 이 행렬의 이질성은 종양 세포의 분포 및 전이 (그림 3C)에 영향을 줄 수 있습니다.
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그림 3. 등의 귀 진피 라이브 다 광자 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 종양 B16-F10의 단일 필드. 종양의 기질은 테나의 C 항체로 표지하고, 염색은 안티 - 염소 594 당나귀 항체로 검출되었다. 테나의 C (빨간색)의 면역는 네트워크가에 도시 및 원 섬유 콜라겐은 B에 두 번째 고조파 발생 (SGH)로 검출된다. 이 두 네트워크는 (병합) C에서 종양 세포 (시안)과 겹쳐있다. 테나의 C로 표시되어 새로운 종양 행렬은 SHG (녹색)로 검출 섬유의 콜라겐과 중복되지 않습니다. 44, 네 시간은 Z-단계 1.0 μm의와 Z-섹션을 평균과 이미지는 16 비트 색상 심도 모드에 인수되었다. 이광자 현미경으로 수집 한 이미지. 스케일 바, 100 μm의.REF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg"대상 = "_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 종양의 기질 성분 종양 행렬의 (예를 들어, 테나 신 C와 콜라겐 IV)의 immunolabeling 다음 우리는 할 수 있었다 식별 제한 및 종양 매트릭스 방향 리모델링의 갑작스러운 이벤트 (비디오 1). 우리가 상처에게 11,24 치료의 경우 이전에 보이는 것과 같이 종양 미세 환경 내에서 개발 힘은 종양 매트릭스와 결과 리모델링과 비슷한 정도의 종양 혈관의 신장에서의 확장 또는 수축이 발생할 수 있습니다.
콜라겐 IV (빨간색)와 테나의 C (시안) 혈관 (화살표)를 연장하고 수동적으로 세 가지 종양 세포 (녹색)시키다로 표지 종양 행렬의 비디오 1. 확장. teascin의 C가 풍부한 종양 매트릭스시키다 혈관 (빨간색 가로 방향 structur의 현지화 수축E) 영상 12 시간 동안 약 100 μm의에 의해. 면역 형광 실체 현미경으로 수집 한 이미지. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 실험에 사용 된 광자 플럭스 빠르게 산화 (25)로부터 보호되지 않은 형광 염료를 표백하는 바와 같이 형광 라벨링과 다중 광자 현미경을 사용하는 것은 문제가있다. 여기에서 우리는 동시에도 (비디오 2) 높은 광자 밀도 두 광자 현미경 형광 최소한의 광표백과 immunolabeled 테나의 C 행렬을 이미지하면서 우리는 두 광자 시간 경과 현미경을 수행 할 수 있음을 보여줍니다.
두 광자 현미경 동안 테나의 C의 면역 형광 (적색)의 비디오 2. 낮은 수준의 광표백. B16-F10-GFP 종양 세포 (시안)는 구일 접종 후 오픈 등의 귀에서 몇 군데 있었다. 형광 신호는-아스코르브의인가에 의해 보호 된몇 군데 조직 상 링거 버퍼. 두 번째 고조파 발생 (녹색) 네 배 Z 단계 1.9 μm의와 Z-섹션을 평균 11, 15 분 동안 획득 한과 C. 16 비트 컬러 깊이 이미지를 테나으로 표시 새로운 매트릭스와 중복되지 않습니다. 이미지가 수집 6 Z-평면에서 1 분마다 5 초 수집하는 것은. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 또한 전이성 종양 세포와 면역 세포의 상호 작용을 이미지. 8시간 IV 수혈 후 종양 관련 혈관으로부터 extravasated 담암 마우스에서 CMTPX 표지 된 비장 세포는 종양 행렬 침입 적극적 오래 셀 콘택트 (영상 2)를 형성함으로써 종양 세포와 상호 작용. 형광 - 647 - 라벨 콜라겐 IV의 구조는 영상의 12 시간 동안 photobleaching에에 저항했다.
종양에서 CMTPX 표지 비장 세포 (B16-F10)-B의 비디오 3. 상호 작용각각의 종양 세포 (GFP-B16-F10)와 마우스를 이어링. 비장 세포는 콜라겐 IV에 대한 조직 염색 후 수혈 IV했다. 콜라겐 IV-그린 (647), 비장 - 레드 (CMTPX), B16-F10 시안 (GFP). 면역 형광 실체 현미경으로 수집 한 이미지. 비디오 지속 시간 12 시간이다. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
갓 고립 종양 세포가 노출 귀 진피 콜라겐 IV에 대해 미리 염색 적층했다. 우리는 조직에 부착 후 세포의 일부 그룹은 혈관과 지방 세포의 기저막을 따라 집단 이주를 시작 것을 관찰 할 수 있습니다.
비디오 4. 종양 세포가 기저막을 따라 이동한다. 정상 귀 피부가 갓 계대 B16-F10-GFP 세포와 겹쳐 5 시간 동안 몇 군데 (빨강 647) 콜라겐 IV에 스테인드. 조직에 부착 된 일부 종양 세포를 따라 집단 이주를 시작혈관 및 지방 세포의 기저막. 면역 형광 실체 현미경으로 수집 한 이미지. 비디오 재생 시간 :. 5시간는 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
귀 진피는 거의 2 차원 때문에 또한, 우리는 쉽게 대신 느리고 비싼 공 초점 또는 다 광자 현미경의 빠른 형광 실체 현미경을 사용하여 많은 양의 데이터를 수집 할 수 있습니다. 그러나, 우리의 intravital로 언급 현미경 검사 방법을 사용하는 것도 가능하다 IF 제제 (도 3, 비디오 1).
Discussion
의미
여기에서 우리는 높은 해상도와 섬유 성뿐만 아니라 메쉬와 같은 기질 단백질을 포함한 다양한 조직의 미세 환경 구성 요소의 동적 시각화 할 수있는 소설의 intravital 현미경의 접근 방식을 제시한다. (I)의 intravital 형광 이미징은 혈액이나 림프관에 용질 누설을 추적하기 위해, 예를 들면, 미세 혈관 연구에 사용되었지만, 면역 염색과 결합되지 않은 :이 방법은 현재의 intravital 이미징 기술에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. (II) 유전자 변형 기자 마우스의 사용은 이미지에 표시 할 특정 세포 유형은 가능하지만, 자신의 가용성 (또는 새로 작성하는 상당한 노력을) 필요로하고 연구 할 수있는 종류의 세포 상호 작용의 수를 제한합니다. (ⅲ) 세포 외 기질은 초 고조파 발생을 이용하여 생체 내 이미징 될 수 있지만,이 기술은 단지 중요한 세포 외 다수의 부품을 떠나는, 콜라겐 섬유를 검출 할 수있다기저막, fibronectins, tenascins, 성장 인자, 케모카인 및 현재의 연구의 손이 닿지 않는 조직 글리코 사 미노 글리 칸 등. 우리의 방법은 이러한 한계를 극복하고, 표준 영상 기법은 성장 인자 (예 : VEGF 26) 및 케모카인 (CCL21 5,18 및도. 2D 바인딩 다른 세포 유형, 조직 구조, 헤파린 설페이트의 예금 immunostainings 혼입 더욱 결합 될 수있게 ) 또는 세포 외 기질 단백질을 동시에 혈액 및 / 또는 림프 흐름을 추적하면서.
제한
의 intravital IF의 표면 형광 이미징은 두꺼운 피하 조직 (지방 조직)의 박탈 얇은 피부 플랩, 제한됩니다. 우리는 지느러미 귀 진피는 기술이 귀 진피에 한정되지 않고, 경우의 intravital과 귀, 피부, 표면 형광 상대적으로 무해한 수술 박람회에 최적입니다 잠재적 예에 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다 있지만발가락 또는 신생아 마우스의 뒷면 피부의 노출 된 피부. 면역의 급속한 항체 염색 (15 분) 경우는 수동 확산에 의존하는 것이 아니라 기능적인 림프 배수 및 간질 유체의 흐름을 필요로 림프 혈관이 27 폐색하는 경우, 따라서 전혀 오염이 관찰 될 수있다. 그와 일치하여, 림프 혈관이 강한 후 새는 혈액 혈관 (부상 혈관, 동맥) 5 얼룩. 지느러미와 복부 귀 피부 플랩의 분리는 가벼운 수술이지만 다양한 조직 세포에 약간의 모세 혈관과 세포 죽음에 부상의 원인이됩니다. 하나의 예를 들면 세포의 생존에 대한 약물의 온화한 효과를보고 완전히 손상 조직을 조사 할 필요가있을 때이 문제가 될 수 있습니다. 또한 광독성 및 광표백으로부터 피부를 보호하는 역할을 항산화 애플리케이션 티슈 산화 스트레스 또는 산화 질소 biolog 예 공부의 intravital 면역 형광 기법의 사용을 배제예.
마지막으로, 면역 복합체와 조직 상주 식세포의 눈을 멀게하는 것은이 세포와 조직 면역 반응 및 수지상 세포 활성화의 연구 예를 들어 영향을 활성화 할 수 있습니다.
수정 및 문제 해결
티슈 산화 스트레스 또는 산화 질소 생물학을 연구하기 위하여, 아스 코르 베이트는 실험 출력을 방해하지 않는 다른 조직 호환 매체로 대체되어야한다. 연구의 목적은 기능 및 조직 면역 반응 및 수상 세포의 활성화 및 이동의 활성화 경우에 마찬가지로, 경피 면역 세포에 차단 된 Fc 수용체는 피해야한다. 이것은 (F (AB) 2 항체 단편) 또는 검출 시약으로서 바이오틴 항체 및 스트렙 타비 딘의 형광 사용 절단 Fc 단편과 차 항체를 이용하여 수행 될 수있다.
미래의 응용 프로그램
우리는 소설과 독특한 내부를 제시중요한 IF 두 광자 현미경을 사용하여 SHG 감지 섬유의 성숙 콜라겐과 함께 이식 가능한 피부 종양의 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 이미지가 아닌 섬유의 구성 요소에 대한 기술. 표면 형광 이미징 위에 다중 광자 (또는 공 초점) 현미경을 사용하는 장점 중 하나는 Z-스태킹 가능하고있는 결과 세포 외 매트릭스 내에서 발생하는 이벤트의 공동 지역화 공간적, 림프계 또는 혈관으로 예 종양 intravasation 그중 경우 표준 표면 형광 현미경은 침입 세포의 형태 학적 변화에서 유추 할 수있다. 이 기술은 훨씬 더 넓은 가능성이있다. 림프 별 광 역학 치료 (photodynamic therapy)가 27만큼 림프 폐색의 메커니즘을 조사하기 위해 예를 들어, 우리의 intravital를 사용했습니다. 이 방법의 추가 잠재적 인 응용 프로그램을 포함하지만, 이식 거부 또는 혈액과 림프의 방법의 염증 메커니즘 동안 피부 면역의 조사에 국한되지 않습니다 종양 동안 ATIC의 혈관의 성장.
절차의 중요한 단계
생리적 조직 환경을 유지하기위한 중요한 의미를 가지고 가장 중요한 단계는 등의 진피에서 복부 피부와 연골 수술 분리합니다. 절단 또는 주요 동맥 또는 정맥 폐색하는 치료와 세포의 움직임 8 세포 반응에 영향을 미칠 것이다, 과도한 출혈과 지역 조직의 저산소증으로 이어질 것입니다. 수술 접착제로 귀를 고정화하는 것은 조직을 노출에 접착제를 흘리고주의하여 수행해야 혈관의 폐색에 의해 조직에 영구적 인 손상의 원인이됩니다. 마우스의 온도는 37 ℃로 조절하고 유지해야합니다 눈과 폐 제대로 실험 동안 가습 유지되도록 또한 가습 산소, 이소 플루 란 마취를 위해 사용되어야한다. 또한, 아스 코르 빈산 나트륨 갓 준비를해야하고 그 pH는 사용하기 전에 확인.
요약 ntent ">이의 intravital 면역 형광 마우스 피부에 복잡한 세포 사건의 분자 영상과 생리 기능의 실시간, 지역 측정 교량. 쉽게 후 개발 등의 연구에 적용 할 수있는 또한,이 방법은 큰 잠재력을 가지고 혈액과 림프 혈관 또는 유연성과 높은 처리량 잠재력. 다양한 병원체에 의해 피부 감염의 초기 단계를 시각화하는 메커니즘이의 intravital 기술은 크게 생물학의 여러 분야에 기여할 수있다.Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 이미지 처리에 도움 제레미 CM 테오와 S. 라이언 올리버 기여 및 졸 란타 Kilarska에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 두 개의 광자 현미경과 지원을 EPFL의 BIOP 핵심 시설 감사
이 작품은 유럽 연구위원회 (DC-림프, 206653-2), 유럽 Framework 프로젝트 7 (AngioScaff), 스위스 국립 과학 재단 (31-135756), 그리고 건강의 미국 국립 연구소에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 (NIH) / NIH 심장, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI) (RO1 HL096539). 또한, 로버트 베너 수상 (스위스 암 리그)에서 자금 구입이 연구에 사용 된 라이카 실체 현미경 허용했다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice Strain | |||
| BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
| C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
| Cell Line | |||
| B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
| Anesthesia Maintenance | |||
| Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
| Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
| DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
| Stereomicroscope | |||
| Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| Multiphoton Microscopy | |||
| LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| HCX APO 20X/1.2 oil immersion | |||
| Chameleon Ultra Laser | |||
| Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
| Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
| Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
| Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
| Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
| Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
| Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
| LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
| CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
| Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
| CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
| Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
| Cell Culture Reagents | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
| Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
| PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |
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