Summary
Den ekstracellulære matrise gjennomgår betydelig ombygging under sårtilheling, betennelser og tumorigenesis. Vi presenterer en roman intra immunfluorescens mikros tilnærming til å visualisere dynamikken i fibrillær og nettinglignende matrikskomponenter med høy romlig og tidsmessig oppløsning ved hjelp epifluorescence eller to-foton mikroskopi.
Abstract
Foruten å være en fysisk stillas for å opprettholde vev morfologi, er den ekstracellulære matrix (ECM) aktivt involvert i regulering av celler og vev funksjon under utvikling og orgel homeostase. Det gjør det ved å handle via biokjemiske, biomekaniske, og biofysiske signalveier, for eksempel gjennom utgivelsen av bioaktive ECM protein fragmenter, regulere vev spenning, og gir trasé for celle migrasjon. Den ekstracellulære matriks av svulsten mikromiljøet gjennomgår vesentlig ombygging, karakterisert ved nedbrytningen, avsetning og organisering av fibrillar og ikke-fibrillar matriksproteiner. Stromal stivne av svulsten mikromiljøet kan fremme tumorvekst og invasjon, og føre til ombygging av blod-og lymfekar. Sanntids avbildning av matriksproteiner, men til dette punkt er begrenset til fibrillar kollagen som kan oppdages av andre harmonisk generering ved hjelp av multifotonmikroskopi, og etterlater det meste av matrikskomponenter largely usynlig. Her beskriver vi prosedyrer for tumor-inokulering i den tynne øret dorsal hud, immunolabeling av ekstracellulære matriksproteiner og intravital avbildning av det eksponerte vev i levende mus ved hjelp epifluorescence og to-fotonmikroskopi. Vår intravital avbildningsmetoden gir mulighet for direkte påvisning av både fibrillar og ikke-fibrillar matriksproteiner i sammenheng med en økende dermal tumor. Vi viser eksempler på fartøyet remodellering forårsaket av lokal matriks sammentrekningen. Vi har også funnet at fibrillær grunnmasse av den detekterte med den andre harmoniske generering tumor er romlig distinkt fra nylig avsatt matrikskomponenter som tenascin C. Vi viste også langvarig (12 timer) avbildning av T-celle-interaksjon med tumorceller og tumorceller migrasjon langs kollagen IV av basalmembran. Samlet utgjør dette en unik fremgangsmåte gjør det mulig for den samtidige påvisning av tumorceller, deres fysiske mikromiljøet og den endogene immunrespons vev over tid, noe som kan provide viktig innsikt i mekanismene bak tumorprogresjon og endelige suksess eller resistens mot behandlingen.
Introduction
Intra avbildning av inflammatorisk, metastatisk og matrise remodeling prosesser har vært et viktig område for forskning og har motivert etableringen av en rekke transgene reporter musemodeller som uttrykker fluorescerende proteiner 1,2. På grunn av ut-av-fokus fluorescerende signaler som reduserer bildekvaliteten og grenser lyser penetrasjon gjennom vevet, er bildebehandling tykk vev bare mulig med confocal eller multi-foton scanning mikros tre. Ved hjelp raskere, er mindre kostbart og komplisert epifluorescence mikros bare mulig med nesten to-dimensjonale vev som kylling chorio-allantoic membran fire eller mus øret dermis fem. De fleste bildedanningssystemer dra nytte av transgene mus som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner i en celletype-spesifikk måte. Selv om disse proteiner har svakt fototoksisitet, de induserer immunrespons 6.. Videre er det vanskelig å skifte mellom spesifikke celle subtyper eller merkeir basal eller aktiverte tilstander som slik endring krever utarbeidelse av en ny genetisk modell. I tillegg, som fluorescerende protein ekspresjon er vanligvis begrenset til intracellulær kammer, er det vanligvis ikke mulig å avbilde ekstracellulære strukturer som basalmembran proteiner eller vev chemokine avleiringer 7. I stedet, indirekte merking med antistoffer mot ekstracellulære antigener tilbyr fleksibilitet for nesten hvilken som helst celle-type eller matrise spesifikk komponent 8,9. Imidlertid er den største ulempen med denne merking tilnærming forbundet med immunotoxicity mediert av antigen-antistoff-immunkompleksene som kan utløse komplementsystemet avhengige celletoksisitet og fagocytose av celler og ekstracellulære strukturer 10.
Den ekstracellulære matriks av svulsten mikromiljøet, men også for normale vev ved inflammasjon eller sårheling, gjennomgår en betydelig ombygging. Stromal stivne av svulsten mikromiljøet kan promote tumorvekst og invasjon på grunn av stress-indusert signalmekanismer og årsaken ombygging av blod og lymfekar 11. Imidlertid er direkte avbildning av matriksproteiner begrenset til fibrillar kollagen som kan oppdages av andre harmonisk generering ved hjelp av multi-foton mikroskopi. Nylig har vi publisert en roman intraavbildningsmetode som minimerer risikoen for foto-og immun-toksisk skade fotografert celler og vev strukturer fem. I sammenligning med etablerte avbildningsteknikker hvor enkelt runde med kontinuerlig intravital visualisering er i et område på 30 minutter til 2 timer 12 til 17, vår intravital immunfluorescens (IF) teknikk tillatt 12 timer (langtids 8) avbildning. Det er viktig å merke seg at avbildnings tiden er begrenset til 12 timer på grunn av begrensningene beskrevet i vår dyr protokoll, men det er ingen tekniske mot indikasjoner på at den ikke kan forlenges hvis kritiske helse parametere av dyret, slik som blodtrykk og hjertesats blir kontrollert åtte. I tillegg, ved å bruke en automatisert fluorescens stereomikroskop var vi i stand til å samle inn bilder fra flere felt i løpet av et enkelt forsøk og observert sjeldne immunologiske og ombygging prosesser som skjedde i fysiologisk sammenheng med huden støttet av funksjonelle blod-og lymfekar. Fordi stereomicroscopic objektivet har en relativt stor, 2 cm, arbeidsavstand, og i motsetning til to-foton mikroskopiske optikk ikke krever fordampning av nedsenking i vann, ble langvarig avbildning utføres bare under fluorescens stereomikroskop. Intravital IF tillates immun merking og påvisning av hvilken som helst ekstracellulære matriks-komponenten i normal hud. Konstruksjonen av denne teknikken er basert på den innovative konseptet med å bruke farging for levende celler og vev matriseelementer for kirurgisk eksponerte musehuden uten å forårsake skadelige virkninger immunotoksisk 5. Den kirurgiske prosedyren i seg selv er trygt å dermisvaskulaturen den er avhengig bare av separasjon av to hudlagene i øret som er uavhengig innerverte, autonomt matet av blod og dreneres ved hjelp av separate lymfatiske opplag. Vår eksperimentelle oppsettet tillater avbildning av en rekke viktige patofysiologiske arrangementer over minst 12 timer, inkludert leukocytter trafficking mellom blod og lymfekar og sårheling prosesser. I den opprinnelige publikasjonen, sammenlignet vi vår teknikk for å state-of-the-art standarder i ulike felt av intra bildebehandling. Derfor observerte vi blodåre bloduttredelse og lymfatiske intravasation hendelser av ulike typer leukocytter, inkludert den unike visualisering av immunceller inn innsamling i stedet for forventet innledende lymfekar 15. Også, sammenfallende med observasjoner gjort av andre grupper 9,18, fant vi at in vivo CCL21 er i stand til å danne sterke, usammenhengende innskudd på å samle inn, men bare sjelden på innledende lymfekar.
19. Vi fant at fibrillar matrise av tumor, detekteres med det andre harmonisk generering, inntar ulike steder på tumormikromiljøet enn den nylig avsatt matriks sammensatt av tenascin C. Videre har vi beskrive eksempler på fartøyet remodellering forårsaket av lokal matriks sammentrekningen, lang sikt (12 timer) avbildning av T-celle-interaksjoner med tumorceller og tumorcellemigrering langs kollagen IV i basalmembran. Slike hendelser kan avbildes samtidig opptak lokale fysiologiske parametre som blodårer permeability og lymfedrenasje.
Protocol
Alle prosedyrer utført på dyr var i henhold til den sveitsiske dyrevernloven, forordningen om dyrevern og ordinansen på dyreforsøk. Vi bekrefter at vår Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), oppkalt Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (Permit Number: 2687), spesielt godkjent denne studien.
En. Tumor Inoculation av Ear
- Kultur B16-F10-melanomceller GFP i en 10 cm petriskål ved hjelp av DMEM + 10% FBS medium.
- Når cellene er 80-90% konfluent, vaske dem med PBS og løsne dem ved trypsinering. Spinn ned cellene ved 1500 xg i 5 min ved 4 ° C, resuspender pelleten i 1 ml Ringers oppløsning, og overføre den til et 1,5 ml Eppendorf-rør. Spin på nytt og fjerne all supernatant bortsett fra et tynt lag av mediet som forblir like over pelleten. Suspender cellene til å ende opp med en tykk celle slurry.
- Anesthetize mus med en blanding av markedetamin / dorbene [medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) og bekrefter at dyret er tilstrekkelig bedøvet ved å utføre en mild tå klype. Øk isofluran konsentrasjonen i trinn på 0,1% i saks bevegelser blir observert (f.eks tilbaketrekking av labben). Holde mus på en rektal termistor kontrollert varmepute (37 ° C) under hele prosedyren og beskytte øynene med en passende oftalmisk salve.
- Forbered en Hamilton sprøyte (33 G nål, 10 ml sprøyte volum). Ta hetten med nålen og last 20 pl av celleslam på toppen av spisskammeret. Trekke tilbake stempelet til 5 ml oppslemming er lastet inn i sprøyten. Fjern det overskytende slam fra spissen kammeret og lukke topphette.
- Ved hjelp av klebebånd, fastsette den proksimale kanten av øret på spissen av pekefingeren. I en 45 ° vinkel, sett den langsomt Hamilton sprøyte nål mellom rygg dermis og brusk. Når du er inne, trenge inn i øret proksimale koplet til den fjerne for ca 2-3 mm.
- Sprøyt 3 mL celle slurry og langsomt trekke nålen fra øret.Let tumorceller dannelse av en fast tumor i løpet av 7-9 dager, og følge tumorvekst ved hjelp av et fluorescens-stereomikroskop.
- Alternativt, for å følge de tidlige trinn i tumor celle interaksjon med vevet matrise, anvende 50 pl av 100000 tumorceller suspendert i Ringers løsning på de eksponerte og farget øret dermis (etter trinn 3.3).
2. Ear kirurgi
- Tre dager før forsøket, barbere musa hodet, fjerne håret hårene rundt hodet og øret (10-15 sek) og skyll med vann.
- Anesthetize mus med en blanding av fuktet oksygen og isofluran (3-4% induksjon, 1-2% vedlikehold) og bekrefter at dyret er tilstrekkelig bedøvet ved å utføre en mild tå klype. Øk isofluran konsentrasjonen i trinn på 0,1% i saks bevegelser blir observert (f.eks tilbaketrekking av labben). Hold musen på en rektal termistor kontrollert oppvarming pad (37 ° C) under hele prosedyren og beskytte sine øyne med enhensiktsmessig ophthalmic salve.
- Bygg en plattform laget av 8 limt glass histologi lysbilder. Snu musen på ryggen og forsiktig plasserer svulsten bærende øret på bunken med glassplater. Bruk små striper av teip for å fiksere de fremre og bakre kant av øret til stabelen.
- Skjær ventral huden av øret langs antihelix av musen pinna ved hjelp av en skalpell. Med hjelp av buede pinsett, forsiktig skrelle av ventral dermis og brusk fra rygg dermis hvor svulsten ble vaksinert. Trekk av ventral hud og brusk med buede tang, utsette rygg dermis. MERK: Hvis de store fartøy av øret er kuttet eller blodsirkulasjonen går ikke tilbake til normal flyt innen 15 min, kan øret ikke brukes til bildebehandling. Alltid holde åpnet øret huden våt ved hjelp av Ringers buffer og beskytte fuktighet ved hjelp av en dekk.
- I tilfelle det er vedvarende blødninger skjema tumor fartøy, stoppe blødningen ved å legge til 100 mLtrombin (5 U / ml) i Ringers buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 28 mM natriumlaktat) på toppen av øret i 5 min.
- Vask øret to ganger med ca 5 ml Ringer-buffer og fjerne ekstra væske med sterile våtservietter. Umiddelbart videre til neste trinn (ikke la den åpne øret tørt på noe punkt!).
Tre. Immunfluorescens Farging
Bruk Ringers buffer supplert med human serum (1:10), muse-polyklonalt sekundært antistoff mot humant IgG (01:50), og 125 IE / ml (2.5 mg / ml) aprotinin (blokkeringsbuffer) for alle fargingstrinn. Aprotinin hemmer plasmin fremme koagulasjon å begrense innledende blødning som kan oppstå etter operasjonen.
- Brett den delen av øret med de åpne dermis inn i eminentia conchae og tørk de ytre uåpnede øret dermis med sterile våtservietter. Immobilisere øret på bunken med glass lysbilde ved å bruke 0,5 mL av kirurgisk lim til fremre og bakre Dorsal kanter. Deretter forsiktig flate dorsal øret dermis på glasset.
- Påfør primære antistoffer rettet mot ekstracellulære matriks-molekyler i en konsentrasjon på 10 mikrogram / ml i et totalvolum på 100 ul blokkeringsbuffer til den utsatte øre. Dekk øret med et dekkglass for å hindre at det farvende løsning for å tørke på øret kanter. Inkuber i 15 min. Vask øret to ganger med omtrent 5 ml Ringers buffer.
- Anvende egnede sekundære antistoffer eller streptavidin konjugater (fluoroforer med høy eksitasjonsbølgelengde slik som 594 nm eller 647 nm er gunstige for intravital avbildning) ved en konsentrasjon på 10 ug / ml i et totalvolum på 100 ul blokkeringsbuffer til den utsatte øre. Dekk til øret med et dekkglass og inkuberes i 15 min. Vask øret to ganger med omtrent 5 ml Ringers buffer.
4. Interaksjon av blodbårne Aktivert Splenocytter med tumorceller in situ
- 7 dager etter inoculation av GFP-B16-B10 melanom på baksiden huden av congenic mus, avlive dyret og samle milt. Isoler splenocytes med mekanisk forstyrrelse av milten gjennom en 70 mikrometer celle sil.
- Etikett splenocytter i 8 min ved 37 ° C med Red CMTPX cellen cytoplasma flekk (1 mM i PBS), vaskes fire ganger i 15 ml ved 4 ° C og umiddelbart injiserer med 200 ul serumfritt medium inn i halevenen til mus som har ører inokulert med B16-F10-GFP 7 dager tidligere.
5. Intravital Imaging ved hjelp av en stereomikroskop
- For kortvarig imaging (opp til 2 timer), tilsett tilberedes sterile askorbat-Ringer-buffer inneholdende 140 mM natrium-askorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCl og 5 mM CaCl 2, ved en pH på 7,5 (askorbat-Ringers buffer endelige osmolaritet 320 mOsM) på toppen av det immobiliserte øret. Dekk til øret med et dekkglass og begynne bildebehandling ved hjelp av en fluorescens stereo med 2X linse.
- For langsiktig bildebehandling(Mer enn 2 timer), plasserer utløpet av en nål (koblet til et reservoar som inneholder askorbat-Ringer-buffer) under dekkglass, ca 0,5 cm fra øret. Bruk en peristaltisk pumpe ved en hastighet på 1 mL / min for å levere konstant askorbat-Ringer-buffer til kammeret under dekkglasset.
- Endre 1X objektivet (arbeidsavstand 6 cm) til 2X linse (arbeidsavstand 2 cm). Åpne oppkjøpet programvaren og konfigurere innstillingene for den fluorescerende stereomikroskop. I kamerainnstillinger velge 12 bit som bildet fargedybde og justere kameraets rekke gråskalaverdier fra 0% (minimum) til 5,1% (maksimum) og sette gammakorreksjon til to.
- Sett oppkjøpet gevinst til en (minimum), fluorescens intensitet til 1000 (maksimum), forstørrelse satt til 280X-320X og justere eksponeringstiden unngå over-eller undereksponering (eksponeringstiden skal være mindre enn 1 sek). Avhengig av antallet av bildefelt (vanligvis 10 til 20), tidsintervallet for akkvisisjon syklus bør være sattlom 1 til 2 min. Forkorte ganger kan føre til bleking og fototoksisitet.
- Velge flere felter som inneholder kreftceller, så vel som farget ECM-proteiner (slik som i figur 3). Ved hjelp av den motordrevne stadium, skaffe bilder av de passende fluorescerende kanaler (slik som GFP og fluoroforen 647 i figur 3) over tid (for eksempel hvert 2 min).
- Etter forsøket avlive mus i henhold til institusjonelle retningslinjer dyr. I dette tilfellet, ved slutten av forsøket, avlive bedøvet mus ved cervikal dislokasjon etterfulgt av blodtapping (intrakardiale perfusjon).
6. Intravital Imaging ved hjelp av en multiphoton Microscope
- Ved hjelp av silikonfett, bygge en sirkulær vegg av omtrent 2 cm i diameter og 2-3 mm høyde rundt øret, som starter ved bunnen av øret. Pass på at det ikke er noen lekker poeng. Fyll sirkelen med askorbat-Ringer buffer.
- Plasser musenpå scenen og koble varmeputen (37 ° C).
- Åpen oppkjøpet programvare og konfigurere innstillingene for multiphoton mikroskop.
- Velg opptil fire forskjellige felt som inneholder kreftceller og farget ECM-proteiner (slik som i figur 3). I dette eksempelet, tune Ti-Saphire laser til 850 nm for GFP signalisere en påfølgende enkelt foton 647 for fluoroforen 647 farging og visualisere fibrillar colla med SHG. Innhente bilder av de passende fluorescerende kanaler (slik som GFP og fluoroforen 647 i figur 3) og andre harmoniske generering over tid, for eksempel hvert 2 min, med vann el-HCX APO 20X med 1,00 NA linse og 2 mm arbeidsavstand.
- Etter forsøket avlive bedøvet mus med cervikal dislokasjon etterfulgt av blodtapping (intrakardiale perfusjon).
Representative Results
Til dags dato, er farging i levende vev vanligvis ikke brukes på grunn av dannelse av immunkomplekser som fører til høy flekker bakgrunn og immunotoxicity 20. Dette ble overvunnet av pre-blokkering Fcγ reseptorer på vevsmakrofager, og dermed "blinding" disse cellene til påfølgende indirekte sterk farging. Som merking var ekstracellulært, kan fototoksisitet og fluoroforen bleking styres ved nedsenking av vevet i naturlig antioksidant bufret, isosmotisk askorbinsyre (Fig. 1A). Siden våre innledende beskrivelse av denne fremgangsmåten 5, forbedret vi vår anti-bleking og anti-fototoksisk teknikk, slik at fotobleking kan nå ikke bare kan inhiberes, men helt forhindret (fig. 1B). Dette gjøres ved å bygge inn i øret i et stort volum av antioksydant (100 ul) i kammeret hvor øret er immobilisert. Legg merke til at 300 sekunder konstant bildebehandling tid tilsvarer 10 timer med bildebehandling når bildene ersamlet for 500 msek hver ett minutt (gjennomsnittlig bildeinnstillinger).
Figur 1. Fotobleking og fototoksisitet ble stoppet ved å erstatte klorid med askorbat i Ringers buffer og utlegg den eksponerte øret i 100 ul volum av løsningen. (A) Vevet ble farget først med et biotinylert antistoff mot kollagen IV, den komponent av basalmembran. Fargingen ble senere påvist med streptavidin-647 (rød), og deretter kontinuerlig avbildes i 300 sekunder i enten normal Ringer-buffer (øvre panel) eller askorbat-Ringers (nedre panel). Legg merke til at 300 sekunder konstant bildebehandling tid tilsvarer 10 timer med bildebehandling når bildene er samlet for 500 msek hver ett minutt (de vanlige bildeinnstillinger). Den smarteste 25% av pixel intensitetsverdier er grønn farget. (B) Kvantifisering av immunfluorescens råte (50% i Ringers vs 0% i askorbat-Ringer). Verdier ble normalisert til den første fluorescens. Bilder samlet med immunfluorescens stereo. Scale bar i A, 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Gransker samspillet mellom kreftmetastatiske celler og tumor stroma er avgjørende for å forstå prosessen med svulst celle migrasjon og tumor immunitet. Dette er fordi den tumor-assosierte stroma komponerer opp til 90% av tumormassen og aktivt regulerer tumorvekst og metastatisk spredning 21.. Men mekanistisk innsikt i hvordan matrise stasjoner svulst celle migrasjon mot enten lymfesystemet eller blodkar mangler 22. Dette er delvis på grunn av det faktum at intravital imaldring av matriksproteiner er begrenset til visualisering av modnede fibre av fibrillar kollagen ved hjelp av andre harmonisk generering i to-fotonmikros 23.. Derfor, vi tilpasset vår metode for visualisering av vevet mikromiljøet inkludert blod og lymfekar, pericytes, nerver, muskler og adipocytter å omfatte direkte visualisering av ekstracellulære matrix komponenter. Mange konstruksjoner kan skilles basert på deres morfologi etter farging for basalmembran-komponenter som kollagen IV eller perlekan (Fig. 2A), men direkte farging for spesifikke markører på celleoverflaten, f.eks Lyve1 (Fig. 2B og C) og podoplanin (Fig . 2C), gjør videre skille innledende, kapillære lymfekar (Lyve1 +) fra lymfatisk samlere (Lyve1 -). Beising for matrise-bundet CCL21 i huden avdekket forekomster av denne chemokine på basalmembranen av lymfatisk samlere identified med farging for perlekan, den heparansulfat proteoglycan (fig. 2D).
Figur 2. Eksempler på levende farging i en vanlig mus ører. (A) farging for perlekan, en kjeller membran komponent, viser alle blod-og lymfekar, nerver, muskelfibre og fettceller. (B) Lyve1 farging markerer den første lymfatiske kapillære nettverk. (C) Co-farging for Lyve1 og podoplanin, en pan-lymfatisk markør, skildrer nettverk av innledende og samle lymfekar. Rygg øret dermis kan avbildes ved hjelp av klassisk epifluorescence mikroskopi (uten optisk seksjonering) som øret dermis har lavt antall adipocytter som ellers ville dekke bildefeltet. (D) CCL21 Stai ning (grønn) på lymfatisk basalmembran farget for perlekan (rød). Bilder samlet med immunfluorescens stereo. Scale barer i A og B, 1 mm; i C, 100 mikrometer og 50 mikrometer i D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Viktigst, strukturelle proteiner som normalt ikke kan oppdages av SHG, den klassiske matrise deteksjonsmetode 23, kan visualiseres. For eksempel fant vi at tenascin C (fig. 3A), en matrise protein som uttrykkes under tumorigenesis, er sårtilheling og betennelse 19 deponert i ulike steder av tumor stroma enn fibrillar kollagen (fig. 3B). Denne matrisen heterogenitet kan påvirke svulst celle distribusjon og metastasering (fig. 3C).
t "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 3. Dorsal øret dermis kan leve avbildes ved hjelp av multi-foton mikroskopi. En enkelt felt av tumor B16-B10. Tumor stroma ble merket med tenascin C antistoff og farging ble påvist med anti-geit-antistoff 594 esel. Immunfluorescens av tenascin C (rød) nettverk er vist i A og fibrillar collagens oppdaget med andre harmoniske generasjon (SGH) i B. Disse to nettverkene er overlagret med kreftceller (cyan) i C (fusjonerte). Ny svulst matrise preget av tenascin C er ikke overlappende med fibrillar colla oppdages med SHG (grønn). Bildet med 44, fire ganger i gjennomsnitt z-seksjoner med z-steg 1,0 mikrometer ble kjøpt i 16 bits fargedybde modus. Bilder samlet med to-foton mikroskop. Scale bar, 100 mikrometer.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter immunolabeling av forskjellige tumor matrikskomponenter (f.eks tenascin C og kollagen IV) av tumor matrise vi kunne identifiseres begrenset og plutselige hendelser av tumor matrise retnings ombygging (Video 1). Krefter som utvikler seg i løpet av tumormikromiljøet kan føre til utvidelse eller sammentrekning av svulsten matrise og som følge remodellering og forlengelse av tumor vaskulaturen til en lignende grad som vi viste tidligere i tilfellet med lege sår 11,24.
Video 1. Utvidelse av tumor matrise merket med kollagen IV (rød) og tenascin C (cyan) forlenge blodårer (pil) og passivt translocate tre tumorceller (grønt). Lokalisert sammentrekning av teascin C-rik svulst matrise translocate blodkar (rød horisontalt orientert Struktureringe) med omtrent 100 pm i løpet av 12 timer etter avbildning. Bilder samlet med immunfluorescens stereo. Klikk her for å se video.
Ved hjelp av multi-foton mikroskopi med fluoroforen merking er problematisk som foton flux som brukes i disse forsøkene vil raskt bleke fluorescerende fargestoffer som ikke er beskyttet mot oksidering 25. Her viser vi at vi kan utføre to-foton time-lapse mikroskopi samtidig bildebehandling immunolabeled tenascin C matrise med minimal fotobleking av fluoroforene selv i høy foton tetthet to-foton mikroskopi (Video 2).
Video to. Lavt nivå fotobleking av tenascin C immunfluorescens (rød) i løpet av to-foton mikroskopi. B16-F10-GFP tumorceller (cyan) ble fotografert i det åpne rygg øret ni dager etter vaksinasjonen. Det fluorescerende signalet ble beskyttet ved anvendelse av askorbat-Ringers buffer på avbildes vev. Andre harmoniske generasjon (grønn) er ikke overlappende med ny matrise representert ved tenascin C. 16 bits fargedybde bilde med 11, fire ganger i gjennomsnitt z-seksjoner med z-steg 1,9 mikrometer ble kjøpt for 15 min. Bilder ble samlet inn hvert ett minutt 5 sekunder i seks z-flyene samlet. Klikk her for å se video.
Vi har også fotografert immun-celle interaksjoner med metastatisk kreftceller. CMTPX-merket splenocytes fra en svulst bærende mus ekstravasert fra tumor-assosiert blodkar åtte timer etter iv overføring, invaderte svulsten matrise og aktivt samhandlet med kreftceller ved å danne langvarige celle kontakter (Video 2). Fluoroforen-647-merket kollagen IV strukturer var resistente mot photobleaching i løpet av 12 timer med bildebehandling.
Video 3. Samspill CMTPX-merket splenocytes fra tumor (B16-B10)-bearing mus med individuelle tumorceller (GFP-B16-F10). Splenocytter var iv transfundert etter vev farging for kollagen IV. Kollagen IV-grønn (647), splenocytes-red (CMTPX), B16-B10 cyan (GFP). Bilder samlet med immunfluorescens stereo. Video varighet 12 timer. Klikk her for å se video.
Fersk isolerte tumorceller ble lagt over de utsatte øre dermis pre-farget for kollagen IV. Vi kunne observeres at etter at man følger vevet enkelte grupper av celler begynte å felles migrering langs basalmembran av blodkar og adipocytter.
Video 4. Kreftceller vandrer langs kjelleren membraner. Normal øre hud farget for kollagen IV (647, rød) ble kledde med fersk passaged B16-F10-GFP celler og avbildes i 5 timer. Noen kreftceller som overholdt vev startet kollektiv migrasjon sammenbasalmembran av blodkar og adipocytter. Bilder samlet med immunfluorescens stereo. Video varighet:. 5 timer Klikk her for å se video.
Også fordi øret dermis er tilnærmet todimensjonal, vi kunne lett samle store mengder data ved hjelp av rask fluorescens stereomikroskopi, i stedet for tregere og dyrere confocal eller multiphoton mikroskopi. Men det er også mulig å bruke noen av de nevnte scanning mikroskopi metoder med vår intra IF preparater (Fig. 3, Video 1).
Discussion
Betydning
Her presenterer vi en ny intramikros tilnærming som gir høy oppløsning og dynamisk visualisering av ulike vev mikromiljøet komponenter, inkludert fibrillær samt mesh-aktig matriksproteiner. Denne fremgangsmåten har flere fordeler fremfor nåværende intrabildeteknikker: (i) Intravital fluorescens avbildning har vært brukt i mikrosirkulasjon studier, f.eks, for å spore oppløst stoff lekkasje fra blod eller i lymfekar, men har ikke blitt kombinert med farging. (Ii) Bruk av genmodifiserte reporter mus muliggjør bestemte celletyper å bli fotografert, men krever deres tilgjengelighet (eller betydelig innsats for å skape nye) og begrenser antallet samspill celletyper som kan studeres. (Iii) Ekstracellulær matriks kan avbildes in vivo ved hjelp av andre harmonisk generering, men denne teknikk kan kun detektere fibrøse kollagen, slik at et stort antall viktige ekstracellulære komponenterfor eksempel kjelleren membraner, fibronectins, tenascins, vekstfaktorer, kjemokiner og vev glycosaminoglycans utilgjengelig for dagens forskning. Vår metode overvinner disse begrensningene, og tillater standard bildeteknikker som skal innarbeides og videre kombinert med immunostainings for andre celletyper, vev strukturer, innskudd av heparin-sulfat bindende vekstfaktorer (for eksempel VEGF 26) og kjemokiner (CCL21 5,18 og fig. 2D ), eller ekstracellulære matriksproteiner og samtidig sporing av blod og / eller lymfatiske strømmer.
Begrensninger
Den epifluorescence avbildning av intra IF er begrenset til den tynne huden flaps, fratatt tykke hypodermis (fettvev). Mens vi fant at rygg øret dermis er optimal for relativt harmløs kirurgisk utredning av øret huden, epifluorescence med intra IF teknikken ikke er begrenset til øre dermis og kan potensielt brukes til f.ekseksponert hud av tærne eller baksiden hud hos den nyfødte mus. Rapid antistoffarging (15 minutter) i immunfluorescens IF er ikke avhengig av passiv diffusjon, men krever funksjonell lymfedrenasje og interstitiell væske flyt, dermed ingen flekker kan observeres dersom lymfekar er occluded 27. I tråd med det, lymfekar flekken sterkere da lekk blod blodkar (skadet fartøy, arterioler) 5. Separasjonen av den dorsale og ventrale øre hudlapper er en mild kirurgisk inngrep, men det fører til skade på enkelte kapillarer og celledød i en rekke vev celler. Dette kan være et problem når man har behov for å undersøke helt intakt vev, for eksempel ser på milde virkning av legemidler på celleoverlevelse. Også anvendelsen av antioksidant som tjener til å beskytte huden mot fototoksisitet og fotobleking utelukker bruk av intravital immunfluorescens teknikk for å studere f.eks vevet oksidativt stress eller nitrogenoksid biology.
Endelig kan blinding av vev hørende makrofager med immunkomplekser aktivere disse celler og påvirker f.eks studiet av vevet immunrespons og dendrittiske celleaktivering.
Modifikasjoner og feilsøking
For å undersøke vevet oksidativt stress eller nitrogenoksid biologi, har askorbat for å bli erstattet med andre vev kompatible medier som ikke interfererer med den eksperimentelle utgang. Likeledes bør blokkerer Fc reseptorer på dermal immunceller unngås hvis målet med studien er den funksjon og aktivering av vev immunrespons og dendrittiske celle aktivering og migrasjon. Dette kan gjøres ved bruk av sekundære antistoff med Fc-fragmentet spaltes (2 antistoff-fragmenter F (ab)) eller ved bruk av biotinylert antistoff og fluorescerende streptavidin som påvisningsreagenser.
Fremtidige søknader
Vi presenterer en ny og unik intravital IF teknikk til bilde non-fibrillar komponenter i ekstracellulær matrix i transplant hudsvulster i kombinasjon med SHG-oppdaget fibrillær og modnet collagens hjelp av to-foton mikroskopi. En av fordelene ved å bruke multi-foton (eller konfokal) mikroskopi enn epifluorescence avbildning er z-stabling mulighet og som følge romlig ko-lokalisering av hendelser som skjer i løpet av ekstracellulær matriks, for eksempel tumor intravasation inn i lymfesystemet eller blodkaret, som i tilfellet standard epifluorescence mikroskopi kan bare utledes fra morfologiske endringer av invaderende celle. Denne teknikken har langt bredere potensial. For eksempel har vi brukt intra IF å undersøke mekanismene for lymfatisk okklusjon av lymfatisk-spesifikke fotodynamisk terapi 27. Andre potensielle anvendelser for denne metoden inkluderer, men er ikke begrenset til undersøkelse av huden immunitet under betennelse, mekanismen for transplantasjon avvisning eller metoder for blod og lymfe atic fartøy vekst under tumorigenesis.
Kritiske trinn i prosedyren
Det viktigste som har kritiske betydning for å opprettholde en fysiologisk vev miljøet er en kirurgisk separasjon av den ventrale hud og brusk fra rygghuden. Kutting eller okkludere det store arterie eller vene vil føre til overdreven blødning og lokal hypoksi i vev, noe som vil påvirke cellulær respons til behandlinger og cellebevegelse 8.. Immobilisering av øret med kirurgisk lim bør gjøres med forsiktighet da søle limet på eksponere vevet vil føre til en permanent skade på vev ved okklusjon av blodkar. Temperaturen på mus må kontrolleres og holdes ved 37 ° C. I tillegg må fuktet oksygen for å bli brukt for isofluran anestesi, slik at øynene og lunger bli skikkelig fuktet i løpet av eksperimentet. Dessuten må natriumaskorbat fremstilles friskt og dens pH-verdi kontrollert før bruk.
ntent "> I sammendraget, broer dette intra immunfluorescens sanntid, lokale målinger av fysiologiske funksjon med molekylær avbildning av komplekse cellulære hendelser i musen huden. Videre har denne metoden stort potensial som den enkelt kan brukes til f.eks studie post-utviklings mekanismer av blod og lymfe-angiogenese eller å visualisere de tidlige fasene av hudinfeksjon av ulike smittestoffer. Med sin fleksibilitet og høy gjennomstrømning potensial, kan dette intra teknikken bidra betydelig til flere felt av biologi.Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Jeremy CM Teo og S. Ryan Oliver for deres bidrag og Jolanta Kilarska om hjelp i bildebehandling. Vi takker BIOP kjernefasilitet på EPFL for støtten med to-foton mikroskopi
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra European Research Commission (DC-lymfe, 206653-2), European Framework Prosjekt 7 (AngioScaff), den sveitsiske National Science Foundation (31-135756), og det amerikanske National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). I tillegg midler fra Robert Wenner Award (sveitsisk Cancer League) tillot kjøp Leica stereo brukt i denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice Strain | |||
| BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
| C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
| Cell Line | |||
| B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
| Anesthesia Maintenance | |||
| Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
| Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
| DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
| Stereomicroscope | |||
| Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 1X lens (linear system magnification from 7.5X to 160X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| 2X lens (linear system magnification from 15.6X to 320X) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| Multiphoton Microscopy | |||
| LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
| HCX APO 20X/1.2 oil immersion | |||
| Chameleon Ultra Laser | |||
| Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
| Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
| Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
| Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
| Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
| Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
| Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
| LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
| CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
| Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
| Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
| Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
| CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
| Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
| Cell Culture Reagents | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
| Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
| PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |
References
- Martinez-Corral, I., et al. In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci. , (2012).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels. Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis. PLoS ONE. 8, (2013).
- Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
- Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).
- Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).
- Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).
- Sahai, E., et al. Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy. BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).
- Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).
- Pinner, S., Sahai, E. Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo. J. Microsc. 231, 441-445 (2008).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions. Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).
- Giampieri, S., et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Weber, M., et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients. Science. 339, 328-332 (2013).
- Midwood, K. S., Orend, G. The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis. Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).
- Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. 340-341 (2006).
- Sund, M., Kalluri, R. Tumor stroma derived biomarkers in cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies. Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).
- Patterson, G. H., Piston, D. W. Photobleaching in two-photon excitation microscopy. Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).
- Jakobsson, L., et al. Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis. Dev Cell. 10, 625-634 (2006).
- Kilarski, W. W., et al. Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis. Angiogenesis. , (2013).
