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Neuroscience

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

Abstract

Campenot 실의 미세 유체 실시 예는 신경 과학 사회에서 큰 관심을 받고있다. 이러한 상호 공동 문화 플랫폼은 감염 및 질병 전파에 발달 및 기능 신경 생물학에 걸쳐, 다양한 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 기존의 시스템은 중요한 세포와 같은 기본 도파민 흑색질, 나선 신경절 및 Drosophilia melanogaster의 뉴런의 낮은 풍부 세포 연구에 대한 불충분 한 입력 (구획 당 수천), 및 높은 처리량 실험에 대한 허무가 필요합니다. 조밀 한 문화는 매우 로컬 두 문화를 상호 몇의 outgrowths (<10 %)과 얽혀있다. (I) 미세 유체 하나의 신경 세포는 방법으로 배열하고, 플라즈마 패터닝 생체 재료의 코팅 REGI을위한 (II) 물 마스킹 방법 :이 논문에서는 간단 미세 패터닝 프로토콜은 이러한 문제를 해결하는 설명되어 있습니다신경을 STER과 구획 사이의 파생물을 촉진합니다. 최소한의 신경 세포 공동 배양은 높은 수준 (> 85 %) intercompartment 연결로 제조 된 단일 셀 정밀도 높은 처리량 신경 생물학 실험에 사용될 수있다.

Introduction

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신경 조직은 매우 복잡합니다; 공간적 세포 연락처 및 특히 축삭과 수상 돌기의 outgrowths를 통해 통해 정의 층과 구획 내에서 플라스틱 연결과 함께 주문 이종 세포 혼합물. 새로운 기술은 깊은 통찰력과 질병, 개발, 건강 기능 중심 해명 메커니즘을 얻기 위해 더 많은 실험적인 자유를 부여해야합니다. Campenot 챔버 1,2 그리고 더 최근의 마이크로 제조 실시 예 3,4는 선택적으로 다른 체세포 인구 느려지고 또한 신경 돌기의 outgrowths하는 기능과 네트워크의 연결 공동 배양의 생체 외 제조에 사용될 수있다. 이러한 마이크로 유체 장치는 예를 들어 화학 5,6 또는 레이저 axotomy 6-8, 타우 병증 9, 바이러스 전파 10, 11, 및 축삭 4 mRNA의 현지화 다음 축삭의 변성과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다.

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신경 생물학의 범위를 확장하기 위해, 기술 개발은 최소한의 신경 세포의 공동 문화를 준비해야합니다. 이것은 하나의 세포 및 서브 셀룰러 정밀 시스템의 조사를 위해 신경 네트워크의 풀림을 할 수 있습니다. 최소한의 세포 수에 대한 요구 사항은 파킨슨 병, 귀에서 나선형 신경절, 말초 신경 관련된 도파민 흑질 세포를 포함한 희귀 세포 유형을 분석하고, 줄기 세포를 수있는 가능성을 연다. 이 외에도, 휴대 경제는 3RS 사업에 관련이 있습니다. 이러한 미세 유체 플랫폼 대규모 독성 스크린 또는 다른 높은 처리량을 이용하여 동물의 신경 세포가 필요한 데이터 풍부한 일련의 실험은 이제 고려 될 수있다.

본 논문에서는 마이크로 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 현장 biomateri에와 함께 마이크로 유체으로 배열알 패터닝 방법은 최소한의 세포 수를 높게하여 상호 연결을 공동 배양의 등록을 위해 사용될 수있다. 미세 유체으로 배열은 차동 흐름 할인 모형의 미세 트랩 유체 회로 (그림 1의 SEM 이미지와 함께 설명) 내에 위치되어있다 12 ~ 15을 기반으로합니다. 신경 돌기 가지의 채널 입구 - 경로 0 → 1은 미세 구멍의 선형 배열에 신경을 운반 낮은 유체 저항 (R 2> R 1)가 있습니다. 하나의 셀에 의해 트랩의 인원은 로컬 이웃 트랩 이후의 세포를 포집 유선을 전환하는 흐름을 방해한다. 배열 트랩의 전체 점유 과잉 뉴런의 제거 동작의 바이 패스 모드를 생성하기 위하여 사문석 경로 (0 → 2)에 유선을 전환하는 유체 비율 (R 1> R 2)를 전환한다.


그림 1. 미세 유체 회로. 신경 돌기 가지 채널에 의해 상호 문화 실의 측면에있는 하나의 뉴런으로 배열에 대한 A) 차동 저항 유체 회로,. B, 메 니스 커스 (meniscus) 고정 micropillars와 이중층 구획 된 신경 세포의 공동 문화 배열의 C) SEM 이미지. 이 디자인으로, 삼지창 모양의 신경 세포 트래핑 구조는 신경 돌기의 outgrowths의 fasciculation을 촉진하는 데 사용되었습니다. 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

평면 기판 상에 마이크로 패턴 신경 네트워크의 제조는 용이 exampl 위해 (달성 될 수있다 우리 그룹에서 ES는, Frimat 등. (16)와 헤이 케 등. 17)을 참조하십시오. 그러나, PDMS 장치 내부와 미세 유체 채널이의 마이크로 미터 크기의 정렬의 요구 사항과 생리 활성 물질의 패턴을 캡슐화하는 주요 기술적 인 도전을 포즈. 3.1 절에 대한 프로토콜에 칩, 또는 현장에서, 생체 적합 물질 패턴의 준비가 표시됩니다. 이러한 패턴은 긴 문화 척도 동안 신경 세포의 등록을 활성화하고 구획 사이의 outgrowths을 촉진합니다. 메 니스 커스 고정 마이크로는 신경이 사이트와 신경 돌기 가지 채널을으로 배열과 소위 물 마스크를 정렬하는 데 사용됩니다. 노출 된 표면은 생체 재료 패턴을 정의하기 위해 분해되는 반면, 물 마스크는, 플라즈마 처리 동안에 접착 분자 코팅을 보호한다. 또한, 프로토콜은 세포 배양과 다양한 공동 문화 구획의 선택적인 치료에 필요한 유체 격리를 위해 제공됩니다.

ve_content "> 프로토콜은 이와 유사하게, 현장 생체 재료의 패턴 증발 및 표면 장력 현상을 이용, 간단합니다. 폴리의 복제 (디메틸 실록산) (PDMS) 미세 유체 장치를 18 일 소프트 리소그래피의 사용자 친화적 인 원리를 활용하도록 설계되어 있습니다 만 저렴한 휴대용 플라즈마 소스를 필요로. 미세 유체 회로는 이러한 동작을 만들기 효과적으로 프로그램 셀 로딩 및 구획 구체적인 치료는 단순히 올바른 하단 포트에 재료를 분배하고 위에서 흡입의 문제. 이러한 방식으로,이 신경 생물 학자에게 제공하기위한 것이다 자신의 실험실에서 미세 유체 장치를 준비하고 사용할 수있는 자유.

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Protocol

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프로토콜은 신경 과학자를 대상으로하고, 그림 2에 요약되어있다. 따라서 그것은 상업적 또는 기관 시설에 아웃소싱 PDMS 복제에 사용 된 SU-8 마스터의 미세을 추천합니다. 두 레이어 마스크 디자인은 화학 웹 사이트 (12)의 왕립 학회에 부가 정보 (ZIP)로 자유롭게 사용할 수 있습니다. 중요한 사실은, 제 SU-8 층은 2.5-3.0 ㎛의 깊이로 제조하고, 25 ~ 30 ㎛의 깊이까지 제되어야한다. 이러한 효과가 신경으로 배열에 필요한 주요 치수입니다. 3 미크론의 높이 제한은 신경 세포가 두 개의 구획 (12) 사이에 운반 또는 마이그레이션되지 않도록하는 것이 필요하다.

PDMS 1. 미세 유체 장치 복제

  1. 10:1 비율로 경화제 (184)로 철저히 PDMS의 예비 중합체를 혼합하고 통상적으로 20 분 동안 진공 데시 케이 혼합물을 탈기. 대안 적으로, 혼합 두어50 ML 팔콘 튜브의 낮은 g을 사용 진짜야 탈 가스 원심 분리.
  2. 80 ° C의 열판에 2 층 미세 구조화 SU-8 웨이퍼를 놓고 웨이퍼의 각 장치에 폴리머 프레임을 맞 춥니 다. ≥ 5mm의 깊이까지의 범위에 PDMS를 부어> 1 시간 열 경화가 완료되도록 할 수있다.
  3. 치료 후, 핫 플레이트에서 웨이퍼를 제거하고 평평한 표면에 냉각 할 수 있습니다.
  4. 부드럽게 상품 웨이퍼의 프레임과 PDMS를에 엄격한 메스 (멀리 SU-8 미세부터) 한 구석에서 보호 안경과 작업을 착용 할 것.
  5. 프레임에서 PDMS 몰드를 제거하고 초과 PDMS의 장치를 손질하는 가위를 사용합니다. PDMS 박막은 고분자 프레임과 웨이퍼 표면 사이에 퍼지는 경우 소위 번쩍 종종 생성된다.
  6. 남은 PDMS는 전체 웨이퍼에 적용하고 저장 중에 웨이퍼를 보호하기 위해 경화 될 수있다. 이전 후속 장치 성형이를 제거하고, 그렇게함으로써 어떤 P를 제거표면으로부터 오염물을 명확히.

2. 장치 조립 및 상호

  1. 3mm 직경 생검 펀치를 사용하여 6 인터페이스 포트를 준비합니다. 좋은 조명 조건과 미세 유체 채널 포트의 정렬을 돕기 위해 위쪽으로 향하게 미세 기능, 어두운 화면에서 작업 할 수 있습니다.
  2. 미립자의 장치를 검사합니다. 가역 접착 테이프를 사용하여이를 제거합니다.
  3. 이러한가 플렉시블의베이스 상에 PDMS-경화제 혼합물 (10:1 601)의 작은 부피 (~ 0.5 ml)에 부어 의해 제조된다 : 미세 유체 회로는 유리 커버 슬립 상에 장착 얇은 PDMS 층을 사용하여 캡슐화된다 세균 등급 페트리 접시. 부드럽게, PDMS 층에 커버 슬립을 눌러 몇 분 동안 핫 플레이트와 열 치료에 놓습니다. 신속하게 냉각 한 후, 페트리 접시에서 커버 슬립 - PDMS 이중층을 잘라 상에 메스를 사용합니다. 필요에 따라 가위로 잘라.
  4. 플라즈마 결합 PDMS 장치보기좋은 실을 생산하는 지지층 : 최적의 조건은 기기에 따라 다릅니다. 예를 들어, 40 초 동안 0.2 mbar의 산소 분위기에서 70 W와 40 kHz로 작동하는 플라즈마 오븐은 뛰어난 PDMS-PDMS 결합을 생성한다. 플라즈마 처리 후, 함께 두 부분을 누르면 완전히 결합에 잠시 둡니다.
  5. 펌프와 주사기와 인터페이스, 실리콘 튜브 (3.2 mm 외경 1.6 mm의 ID)를 사용합니다.

3. 생체 적합 물질 패터닝 및 미세 유체 운영

현장 생체 재료의 패턴, 신경 세포의 문화와 유체 치료에 대한 프로토콜은 그림 2에 나타내었다.

그림 2
그림 2. 일러스트 미세 유체 프로토콜. A) PL 및 PLL-g-PEG의 패턴; 세포 접착층의 첨가 (예를 들면,PL, 그린), 증발 물을 정렬 마스크 B) 노광 PL의 대기압 플라즈마 처리를 생산하는,. 2 개의 안테나 핀. C) PBS 흡인 (파란색) 세탁을 PLL-g-PEG의 PL. D) 배달 (빨간색 플라즈마 처리 영역 오염을 막기 위해 사용되는 핑크 스타와 함께 설명 된 플라즈마 도입 안테나로 사용된다 ) 코트에 대한 열망 플라즈마 처리 영역 E) 휴대 로딩.; 흡인에 의해 모두의 측면에 구획에 신경을 동시에 미세으로 배열, 수압 구동 흐름 G) 절연 유체 치료를 사용하여 F) 미디어 (핑크) 관류.; 테스트 에이전트 (흑)의 둘레 치료 흡인하고, 흡인 하단 중앙 입구로부터 전달 H) 중앙 처리에 의해 하부의 측면에 흡입구로부터 전달. 그림과 전설은 화학의 왕립 학회의 허가를 재현(RSC)는 12. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

PDMS 미세 유체 채널을 접합하는 즉시 다음과 같은 플라즈마 (접촉각 ≤ 5 °) 높은 친수성이다. 이러한 표면은 차별화 된 인간 SH-SY5Y 신경 세포와 같은 세포와 같은 세포 라인의 접착과 문화에 적합하다. 기본 뉴런과 같은 룬드 인간의 중간 뇌 세포 라인 (LUHMES) 폴리아민 코팅, 폴리 라이신 (PL) 또는 폴리 오르니 틴 (PO) 중 하나와 같은 신경 전구 세포 라인의 문화의 체외 배양을 위해, 정전 앵커가 필요합니다. 또한 이러한 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 접착 단백질은 종종 인테 - 인터페이스 코팅으로 필요합니다. 그러나, PL 및 PO 코팅은 쉽게 배열 사이트에 미세 유체 전달을 방해하고 원치 않는 전단 응력을 부과, 신경 세포를 바인딩합니다. 이 문제를 해결하려면 칩 생체 재료패터닝 트랩 사이트와 가지의 마이크로에 접착 물질을 집중해야합니다. 이것은 또한 간 구획 연결의 개발을 촉진하고 지역의 엉킴을 감소시킨다. 프로토콜은 또한 단백질과 뉴런 긴 배양 기간 동안 원하는 위치로 제한되도록 인접 지역에 PEG 재료의 첨가를 포함한다. 다음 프로토콜은 그림 3에 설명되어 있습니다 :

그림 3
그림 3. 물 플라즈마 스텐실에 의해 생체 적합 물질 패터닝 마스크. A) PDMS의 micropillars 플라즈마 박아 자리에 물 메 니스 커스 (meniscus)을 고정으로 물 마스킹 과정의 그림입니다. 수직 평면에 메 니스 커스의 곡률은 무시하고있다. B) 물 마스크 메 니스 커스 (P)에 의해 붉은 염료로 시각화 및 위치단백질의 플라즈마 박아. D 후 몇 군데 회. C) 패턴 PL-FITC 코팅) 추가 플라즈마 패턴 PL-FITC 코팅을 거부하고 세포 혐오감을 PLL-g-PEG-TRITC. 이것은 SH-SY5Y 세포의 등록 및 또한 LUHMES 셀들에 대한 추가적인 피브로넥틴 층을 패터닝하기 위해 사용되었다. 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 플라즈마 박아하여 현장에서 생체 적합 물질 패터닝 물 마스킹
    1. 곧 플라즈마 본딩 피펫 후 중앙 하단 포트에 PL 또는 PO (100 ㎍ / ㎖의에 1X PBS)의 0.5 μL 볼륨. 수초 이내에 전체 미세 유체 회로는 모세관 작용에 의해 충전된다. 몇 분 남겨 폴리 A와 완벽하게 코트 친수성 ​​PDMS 표면에광산.
    2. 1 분 동안 (도 2c 참조) 1X PBS와 포부 중심의 세탁에 의해 언 바운드 폴리아민 분자를 제거합니다.
    3. 포트에서 모든 PBS를 제거하고 현미경으로 조사하여 장치를 가열한다. 이 빠른 물 마스크 형성을위한 포트에서 증발을 증가시킨다. 물 마스크 (그림 3a에 나타낸 그림 (b)에 설명)을 ~ 5 분 이내에 설정됩니다.
    4. 물 마스킹이 완료 보장하기 위해 현미경으로 장치를 검사합니다. 배열 사이트의 상류 저수지 구조가 물 마스크 (~ 15 분)의 안정성을 연장하기 위해 마스크 디자인에 포함 된주의하시기 바랍니다.
    5. 포트 (그림 2B)로 스테인레스 스틸 핀을 삽입합니다. 이들은 빈 미세 유체 채널로 19, 20 (2 MHz의 30 kV의 신호로 작동 예) 커플 기압 휴대용 코로나 방전 또는 테슬라 생성기에 ​​의해 생성 된 플라즈마에 사용된다. T의 끝을 포인트그는 하나의 핀과 플라즈마의 끝 부근에 소스가 ≤ 1 초 동안 마이크로 치료 플라즈마. 플라즈마 패턴을 관찰하기 위해 낮은 조명 조건을 사용합니다.
    6. 세척 단계와 물 마스크를 제거합니다. 상위 3 포트에서 병렬 포부를 사용합니다. 병렬 포부를 달성하기 위해 흡인 펌프에 4 방향 어댑터로 연결된 실리콘 튜브의 4 동일한 길이를 사용합니다. 구토물이기도를 시작하고 미세 유체 회로를 통해 PBS를 그릴 아래 3 포트에 PBS를 분배. 이러한 방식으로 PDMS-폴리아민 물질 콘트라스트 (도 3c 참조) 생성된다. 미세 유체 회로에서 PBS 대피하고 원시, 소수성 상태를 복원하기 위해 몇 시간 동안 그대로 둡니다. 이 세포 접착에 PDMS가 완전히 비 관대 렌더링합니다.
    7. 그러한 라미닌 또는 피브로넥틴과 같은 추가 접착 재료는, 다음 단계는 즉시 물 마스크를 제거한 후 필요하며 이루어져야 필요한되면 : 피펫 그래프트 코 폴리머, 폴리-L의 10 μl의 용적- 리신 - 폴리 (에틸렌 글리콜) (PBS에서 PLL-g-PEG, 100 ㎍ / ㎖,) 양쪽 하단의 측면에 채널로, 2 분간 상부 플 랭킹 채널로부터 흡인 하였다.
    8. 흐름을 방해하지 않고, PBS 버퍼와 교환 초과 PLL-g-PEG를 제거합니다. PEG 부분이 단백질 흡착 및 세포 부착 17,21을 방지 작용이있는 선택적 코트 비 폴리아민 코팅 영역.
    9. 이러한 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 접착 단백질은 폴리 아민 코팅 공동 지역화 할 수 있습니다 : 이러한 ECM 단백질 (일반적으로 10 ㎍ / ㎖)의 피펫 10 μL 볼륨을 세 하단 포트에. 장치가 단백질 용액으로 채워지고 양질 코팅을 생산하는 1 시간 동안 배양 될 때까지 최상위 세 개의 포트에서 대기음.
    10. 아래 3 포트에서 PBS를 흡입하여 여분의 단백질을 제거합니다.
  2. 미세 유체 단일 신경으로 배열
    1. appropri 프라임은 장치미디어를 먹었다. 아래 3 포트에 20 μL 볼륨을 추가하고 상위 세 개의 포트에서 병렬 열망에 의해 빠른 속도로 미디어를 미세 유체 회로를 채 웁니다. 흡인 펌프에 동일한 길이의 실리콘 튜브를 통해 커플에 4 방향 튜브 커넥터 3 위 포트를 사용합니다.
    2. (그림 1, 0)의 측면에 입구 각 포트에 세분화 된 세포 현탁액 20 ㎕ (1 X 10 6 세포 / ml)를 추가합니다.
    3. 유량 조절기와 흡인 펌프 장비 또는 상위 3 포트에서 부드러운 포부 주사기를 사용합니다. 완전한 신경으로 배열은 일반적으로 1 분을 필요로한다.
    4. 이후 마이크로 유체 장치에으로 배열의 피펫 4의 측면에 포트에 남아있는 여분의 신경 세포를 수확.
    5. 튜브를 제거합니다. 미디어와 모든 포트를 입력하고 인큐베이터에 장치를 배치합니다. 몇 시간 내에 세포는 생체 재료 패턴에 완벽하게 부착된다.
  3. 신경 세포 문화, 선택적 유체 치료 및 면역nostaining
    1. 수압 피드 (2mm 열 높이 차이가 적절하게 느린)를 사용하여 정기적으로 관류하여 미디어를 교환한다.
    2. 또한, 표준 세포 배양에서와 같이 (2-3 일) : 주기적으로 미디어를 교환, 미디어의 마이크로 유체 장치를 잠수함.
    3. 다음과 같이 신경 세포 배양 구획 또는 중앙 신경 돌기 가지 구획 중 하나에 선택적 유체 처리는 달성된다 : 그 채널의 하단 포트에 시험 물질의 20 μl를 분배하고, 직접 위의 포트에서 대기음. 긴 처리는 유량 조절기를 사용하여 유량을 감소시키고 필요한 피검 물질을 보충하기 위해.
    4. 면역 염색 프로토콜은 각각의 분자 표적 및 관련 시약에 따라 다릅니다. 느린 유속을 사용한 뉴런 전단 - 유도 된 손상의 잠재적 인 위험에 대처하기 위해. 이것은 정상적인 프로토콜 시간을 연장, 시스템을 완전히 perfuse 증가 응용 프로그램의 시대에 발생합니다. 숨바꼭질(2mm 순서 예) 상이한 칼럼 높이와 포트를 사용 drostatic 관류는 시약을 제공하는 데 사용되었다. 펌프를 사용하여 더 빠른 시약 첨가 및 제거 실험 척도를 줄이기 위해 사용될 수있다. 아래 3 포트에서 시약을 그릴 상단 3 포트에 흡인 펌프를 연결합니다.

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Representative Results

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물 마스킹 공격은 표면 장력. 공기 - 액체 계면에서의 압력 공차는 곡률 [반경 반비례 비늘 , 미세 유체 차원에서 매우 안정적인 인터페이스를 생성. micropillars 효과적으로 대신 물 마스크 앵커. 워터 마스크 형성은 가열에 의해 증가 된 속도로, 마이크로 유체 포트에서 증발에 의해 구동된다. 낮은 배율 (4X - 10X)에서 열을 사용하여 현미경 조명, 물 마스크는 일반적으로 ≤ 5 분에 설립되었다. 증발은 또한 물 마스크의 최종적인 붕괴에 이르게한다. ~ (플라즈마 박아 실용적인) 15 분은, 18 NL 저장 구조는 문화 구획의 상류에 위치 된 것으로 물 마스크의 수명을 증가시킵니다. 물 마스크 형성과 붕괴의 비율은 다를 수 있고, 간헐적으로 관찰 플라즈마 t에 적합한 기간을 확인하는 것이 좋습니다reatment. 그럼에도 불구하고, 여러 장치를 동시에 제조 할 수있다.

플라즈마 박아 1 ~ 초를 필요로한다. 긴 처리의 사용은 폴리아민 코팅 과도한 플라즈마 분해에 이르는, 물을 증발 마스크. 기회 부족 플라즈마 처리 결과 (그림 3D 참조) 인접 마이크로 벽에 그대로 폴리아민 코팅을 남겨 두는 것은 신경 세포 접착 (12)를 지원할 수. 그럼에도 불구하고, 배열 마우스 대뇌 피질의 뉴런 6 일 동안 문화를 다음과 같은 89.5 % (12)의 패터닝 효율을했다. 이 효율은 평면 기판에 PL / PEG 패턴에 해당합니다. 생체 재료 패턴은 신경 돌기 마이크로으로의 outgrowths을 촉진 더 장점이있다. 연속 폴리아민 코팅 가지 농도로 70 % ~ 반면에 감소 된 바이오 물질의 패터닝의 outgrowths은 마이크로 채널의 90 % ~ 안에 확장과. 대뇌 피질의 신경 세포를 사용하여,의 칩 문화 7 일이 빨리 성장을 위해 필요했다두 구획 (500 ㎛의 거리) 스팬 THS. 차별화 된 인간 SH-SY5Y 신경 4-6 일 연결을 설정, 높은 가지의 속도를했다. 대뇌 피질, LUHMES 및 SH-SY5Y 신경은 최대 2 주 동안 배양되었다. 이것은 달성되는 자발적 전기 생리 기능에 충분히 길고, 간접적 칼슘 2 + 촬상에 의해 측정 될 수있다. 이것은 생체 물질 패터닝 기능적 네트워크의 연결을 확립하기위한 미세 유체으로 ​​배열 방법의 광범위한 적용 성을 검증한다.

메 니스 커스 고정 구조는, 그러나, 신경 돌기 얽힘을 (그림 4C 참조) 홍보 않습니다. 에지 발견은 미세 표면 (22)에 배양 축삭의 일반적인 기능입니다. 이러한 엉킴을 방지하고 또한 간 구획 연결의 형성을 촉진하기 위해, 메 니스 커스 고정 기둥 마이크로 벽 (즉, 더 이상 독립형)로 병합 할 수 있습니다. 또한,의 outgrowths에서중앙 미세 유체 채널에 비조직적 할 수 있습니다. 선형 연결을 필요로하는 실험을 위해, 중앙 채널 (딘 등. (12), 부가 정보의 마스크 디자인을 참조)을 제거 할 수있다. 이 회로는 세포 부착 또는 제 2 구획에 세포를으로 배열에 대한 관대 한 회로를 렌더링하는 이른바 휴대 밸브 (14)에 대한 기간 (예를 들어, 4 시간) 다음에 제 1 구획의 연속으로 배열이 필요합니다.

미세 유체 회로는 미리 프로그램 된 유체 작업을 제공합니다. 다른 기능은 튜브 또는 팁을 시약 또는 인터페이스를로드 포트의 선택에 의해 결정된다. 이것은 신경 생물학 기법에 매우 접근하게하는 복잡하고 비용이 많이 들고 공간 요구 피드백 제어 계측에 대한 필요성을 피한다. 회로 설계는 12-14으로 배열 마이크로 유체를 달성하기위한 최적의 상대 크기에 결정적으로 의존한다. 작은 변화는 CIR을 방지 할 수 있습니다기능에서 CUIT, 우리는 따라서 자유롭게 사용할 수있는 디자인 (12)의 사용을 할 수있는 프로토콜의 초기 채택을 권장. 최적의 회로로, 미세 유체 단일 뉴런으로 배열 미만 1 분에서 각각 배양 챔버로 배열 ~ 100 뉴런, 빠르다. 뉴런의 수가 제한에도 불구하고, 지역의 밀도는 여전히 충분한 생명 유지 신호 레벨을 제공하는 표준 문화에 해당합니다. 그림 (b)에 설명 된대로이 방법은 효과적으로 트랩 당 뉴런 (1.14 ± 0.09) (12)를 산출한다. 그러나 모든 뉴런 배열됩니다. 미세 유체 회로는 층류의 외측 영역에 도착 뉴런 사문석 채널에 계속되도록 병렬 유선을 생성한다. 그럼에도 불구하고 제시된 시스템은 기존의 구획 된 시스템보다 세포와 경제적 인 10 ~ 100 배이다. 추방 세포는 포트와 튜브에서 수확 할 수있다. 미래의 디자인에, 상류 결정 횡변위(23)으로 배열로 모든 셀을 편향하는 데 사용할 수있는 구조는 절대 셀룰러 경제 간소화.

그림 4
그림 4. 미세 유체 신경으로 배열. A) 주사기를 사용하여 수동 포부는 부드러운 신경으로 배열에 사용됩니다. 4 방향 튜브 커넥터는 두 구획으로 배열 동시에 신경 세포의 상위 3 포트 주사기를 인터페이스하는 데 사용됩니다. B) 신경 세포와 같은 인간 SH-SY5Y 세포와 다른 신경 세포는 단일 세포의 정밀도 (트랩 당 하나의 신경 세포로 배열되어 차별화 ). C) 배양 5 일 후, 신경 돌기의 확장은 두 문화를 상호 연결. 핵은 DAPI로 염색하고 말라 면역 염색은의 outgrowths를 시각화하는 데 사용되었다. 수정 된 그림과 전설은 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

구획 된 시스템의 주요 기능은 선택적으로 물질의 인신 매매와 장거리 신호를 조사하기 위해 각각의 세포 집단을 처리 할 수​​있는 기능입니다. 그러나 문학에서 사용할 수있는 방법은 유체 분리 부적절하거나 잘못 설명되어 있습니다 중 하나입니다. 우리가 개발 한 유체 분리 방법은 <(1 시간) 12 시험 물질 및 장기 유체 분리 (1 분 빠른 배송)> 수 있습니다. 결과를도 5에 설명되어있다.이 기능은 회로 설계의 조합에 의해 시험 물질을 전달하기 위해 흡입을 사용함으로써 가능하게된다. 이는 정압 공급 순서 주사기 펌프를 사용하여 유체 분사 대조적이다. 신경 돌기 가지 채널의 높은 유체 저항에도 불구하고,이 방법은 대류 경로의 t을 생산모자 빠르게 시험 물질을 분산 및 장치 전체를 오염. 위쪽 포트에서 흡입은 또한 회로 (원칙으로 배열 차동 저항의 중심 기능)을 통해 유체와 상호 작용합니다. 그러나,이 동작 모드에서, 미디어가 그것을 대신 분산 시험 물질을 희석하기 위해 다른 장소에있는 회로로부터 인출된다. 극단적 유체 저항 신경 돌기 가지 채널 (상대)을 감안할 때, 희석 수준은 미미하다. 확산 그라디언트의 확립을 수반하는 실험을 위해, 흡인 법을 선택적 화학적 구배의 시간에 따른 변화를 시작하는 데 사용되는 플로우 중지와, 한 구획을 치료하는 데 사용될 수있다.

그림 5
그림 5. 선택적 유체 처리. T의) 흡입 중심 선택적 치료그는 중앙과 B) 구획 측면을 노릴. 화살표는 흡입에 사용되는 하나의 포트를 나타냅니다. 처리는 1 분 (레드 라인)에 설립하고, 실험 기간 동안 유지 하였다; 60 분 (파란색 선). 수정 된 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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미세 유체으로 ​​배열 기술은 최소한의 문화 구축을위한 정밀 단일 신경 세포의 처리를 가능하게 최초의 것입니다. 미세 구조와 세포의 패턴을 정렬하는 현장 생체 적합 물질 패터닝 방법에있어서, 강력한 접근 방식과 함께, 이러한 최소한의 문화가 감소 된 지역의 얽힘 높은 intercompartment 연결 수준이. 심플한 디자인 수정이 시각화 및 정량 분석​​을위한 개별 축삭을 분리 잠재력이 이러한 기능은 간 구획 전송의 효율적인 학습을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다음 세대에서 삼지창 구조체가 다발을 형성하는 복수 축삭의 확률을 줄이기 위해 신경 세포 당 하나의 가지 채널로 대체 될 수있는 디자인. 이러한 기능은 크게 신경 과학 등의 응용 프로그램의 다양한 혜택을 누릴 수 있습니다; 나노 입자의 독성 (24)과 망간 전파 25, 활동 SYN간질 chronization 같은 프리온 (26), 알츠하이머 병 9 아밀로이드 베타 (AB) 전송 및 파킨슨 병 (27) 알파 시누 클레인과 같은 감염원의 보급.

미세 유체으로 ​​배열 방법의 또 다른 명백한 이점은 낮은 풍부 신경 하위 집단이 아닌 복잡한 이종 문화와 함께 연구를 수행 할 수있는 기능입니다. 예를 들어, 단지 작은 숫자에서 고립 될 수있다 파킨슨 연구 또는 말초 신경에 적합한 도파민 흑색질 신경 세포는 미세 유체 플랫폼을 사용하여 복제 연구에 여전히 충분하다. 다른 희귀 세포 응용 예는 나선 신경절 신경 세포와 공동 배양 유모 세포의 실험적인 배열을 사용하여 청력 손실의 기초 조사, 또는 인간에서 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 연구를 포함한다. 마찬가지로, 시스템의 최저 셀 요구 해낼쉽게 가능한 소형 Drosophilia melanogaster의 뇌 (28)로부터 신경 세포로 실험을 수행하기 때문에이 강력한 유전 모델의 이점을 활용할 수.

다른 관점은 휴대 경제 및 높은 처리량 조사를 관리 할 수​​있게 해주는 작은 장치 면적의 실용주의입니다. 각 조건 및 복제에 최소한의 뉴런, 대단히 진행중인 3RS 이니셔티브에 부합 한 동물 수를 감소 시키는데 사용될 수있는 기능이 필요하다. 예를 들어, 화합물의 대형 패널의 투여 량 반응 분석은 하나의 동물을 사용하여 수행 될 수있다. 화면의 종류는 독성 시험 및 siRNA를 또는 장거리 인신 매매와 신호 전달에 미치는 영향에 대한 약리 대리인의 라이브러리의 조사를 포함한다. 요약하면, 기재된 프로토콜은 높은 처리량, 양적 및 통계를 제공 할 가능성을 제공하고, 신경학의 실험 범위를 확장단일 및 세포 내 해상도 동맹 강력한 데이터. 이 신경 과학 분야에서 많은 다른 위대한 발전은 기전 신경 세포의 발달과 기능에 새로운 통찰력뿐만 아니라 질병을 일으키는 병리 적 과정으로 이어질 것입니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 SEM 이미징 SU-8 제조 마리아 베커 (ISAS)에 대한 울리히 Marggraf (ISAS)에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구는 재정적으로 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium FÜR Bildung 싶게 Forschung 부여 (BMBF 0101-31P6541)에 의해 Ministerium FÜR 혁신, Wissenschaft 싶게 Forschung 데 Landes의 노르 트라 인베스트 팔렌에 의해 지원되었다. 헤이 케 Hardelauf 덕분에 국제 라이프니츠 대학원 "시스템 생물학 연구소 - 온 - 칩"재정 지원에 대한.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

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References

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단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비
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Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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