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Neuroscience

Préparation de neurones co-cultures avec l'unité portable de précision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l'eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales.

Abstract

Réalisation microfluidiques de la chambre Campenot ont suscité un grand intérêt de la communauté des neurosciences. Ces plates-formes de co-culture interconnectés peuvent être utilisés pour étudier une variété de questions, allant de la neurobiologie développementale et fonctionnelle à l'infection et la propagation de la maladie. Cependant, les systèmes classiques nécessitent des apports importants cellulaires (plusieurs milliers par compartiment), l'insuffisance de l'étude des cellules de faible abondance, comme primaire nigra dopaminergique substance, les ganglions spirale, et les neurones de melanogaster de drosophile, et peu pratique pour l'expérimentation à haut débit. Les cultures denses sont également hautement enchevêtrées localement, avec quelques excroissances (<10%) interconnectant les deux cultures. Dans cet article, les protocoles microfluidiques et structuration simples qui sont décrits relever ces défis: (i) un seul neurone microfluidique méthode rangeant, et (ii) un procédé de masquage de l'eau pour la modélisation de plasma revêtements de biomatériaux à REGIster neurones et favoriser l'excroissance entre les compartiments. Co-cultures de neurones minimalistes ont été préparés avec de haut niveau (> 85%) connectivité autre et d'peuvent être utilisés pour des expériences à haut débit de la neurobiologie avec une précision d'une cellule unique.

Introduction

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Tissu neuronal est très complexe; un mélange cellulaire hétérogène spatialement ordonné dans des couches et des compartiments définis et avec une connectivité plastique par des contacts cellulaires et en particulier par l'intermédiaire des axones et dendrites excroissances. De nouvelles techniques sont nécessaires pour conférer une plus grande liberté d'expérimentation pour gagner une compréhension plus profonde et mécanismes démêler centrales à la maladie, le développement et la fonction saine. La chambre Campenot 1,2 et, plus récemment, des modes de réalisation microfabriqué 3,4 peuvent être utilisés pour la préparation ex vivo des co-cultures de neurones en réseau ayant la capacité de perturber sélectivement les différentes populations somatiques et également leurs excroissances de neurites. Ces dispositifs microfluidiques ont par exemple été utilisés pour étudier la dégénérescence axonale et la régénération chimique suivante 5,6 ou laser axotomie 6-8, tauopathie 9, la diffusion virale 10,11, et la localisation des ARNm dans les axones 4.

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Pour étendre la portée des neurobiologistes, les développements technologiques sont nécessaires pour préparer les co-cultures de neurones minimalistes. Cela permet désenchevêtrement du réseau neuronal pour l'étude du système avec une seule cellule et une précision sub-cellulaire. L'obligation pour les nombres de cellules minimaux ouvre la possibilité d'analyser les différents types de cellules rares, y compris les cellules de la substantia nigra dopaminergiques pertinents pour la maladie de Parkinson, les ganglions de la spirale de l'oreille, des neurones périphériques, et les cellules souches. Au-delà, l'économie cellulaire est pertinente à l'initiative 3R. L'utilisation de ces plates-formes microfluidiques, des écrans de toxicité à grande échelle ou d'autres haut débit, riche en données série expérimentale nécessitant des neurones des animaux peut maintenant être considérée.

Dans ce document, les protocoles pour la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique sont décrits. Formation de réseau microfluidique en combinaison avec un biomateri in situProcédé de formation de motifs al peut être utilisé pour l'enregistrement des co-cultures de neurones fortement interconnectés en utilisant les nombres de cellules minimal. Formation de réseaux microfluidique est basé sur une approche de flux différentiel 12-15, où les pièges microstructurées sont placés dans un circuit fluidique (illustré avec des images MEB de la figure 1). Le chemin 0 → 1 présente la plus faible résistance fluidique (R 2> R 1) pour le transport de neurones à une rangée linéaire d'ouvertures microstructurées - les ports d'entrée vers les canaux de la croissance des neurites. Occupation du piège par une seule cellule empêche localement le flux de détourner les lignes de courant pour piéger les cellules suivantes dans les pièges voisins. Occupation totale des pièges contenus dans le tableau commute le rapport fluidique (R 1> R 2) pour dévier les lignes de courant dans le trajet sinueux (0 → 2) pour produire un mode de fonctionnement en dérivation pour l'élimination des excès de neurones.


Figure 1. Microfluidique circuit. A) Le circuit de résistance différentielle fluidique pour seule formation de réseaux de neurones, avec accompagnement des chambres de culture reliés entre eux par des canaux de la croissance des neurites. B, C images) au MEB de la bicouche neurone compartimentée matrice de co-culture avec des ménisques micropiliers goupiller. Avec cette conception, structures neurone piégeage en forme de trident ont été utilisés pour promouvoir fasciculation des excroissances de neurites. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

La préparation des réseaux neuronaux microélectrodes sur des substrats planaires peut facilement être atteint (pour exampl es de notre groupe, voir Frimat et al. 16 et Heike et al. 17). Cependant, l'encapsulation des motifs de matériau bioactif dans des dispositifs PDMS et à l'exigence d'alignement échelle micrométrique de ceux-ci aux canaux microfluidiques pose un défi technique majeur. Dans la section 3.1 un protocole pour l'en-puce, ou in situ, la préparation de modèles de biomatériaux est présenté. Ces modèles permettent l'enregistrement des neurones pendant de longues échelles de temps de la culture et de promouvoir des excroissances entre les compartiments. Microstructures ménisque-épinglage sont utilisées pour aligner une dite masque de l'eau avec le neurone sites et des canaux de l'excroissance de neurites rangeant. Le masque protège les revêtements de l'eau des molécules d'adhésion pendant le traitement au plasma, tandis que les surfaces exposées sont désintégrées pour définir le motif de biomatériau. En outre, les protocoles sont prévus pour la culture de cellules et pour l'isolation fluidique nécessaire pour le traitement sélectif des différents compartiments de co-culture.

ve_content "> Les protocoles sont conçus pour tirer parti des principes conviviales de lithographie douce pour la réplication de poly (diméthyl) (PDMS) des dispositifs microfluidiques 18. De même, biomatériau in situ structuration en est simple, l'exploitation évaporation de surface et les phénomènes de tension, et seulement nécessitant une source de plasma portatif peu coûteux. Circuit microfluidique efficacement les traitements spécifiques des programmes de chargement de la cellule et des soutes qui rend ces opérations simplement une question de la distribution des matériaux dans l'orifice inférieur correspondant et l'aspiration par le haut. De cette manière, il est destiné à donner les neurobiologistes la liberté de préparer et d'utiliser des dispositifs microfluidiques dans leurs propres laboratoires.

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Protocol

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Les protocoles sont conçus pour les neuroscientifiques, et sont résumées dans la figure 2. Comme tel, il est recommandé que la microfabrication des SU-8 maîtres utilisés pour la réplication PDMS est sous-traitée à des installations commerciales ou institutionnelles. Les deux modèles de masques de couche sont disponibles gratuitement que les informations complémentaires (ZIP) de la Société royale du site Chimie 12. Fait important, le SU-8 première couche doit être fabriqué sur une profondeur de 2,5 à 3,0 um, et le second à une profondeur de 25 à 30 um. Ce sont des dimensions clés nécessaires pour formation de réseaux de neurones efficace. La limite de taille de 3 microns est également nécessaire d'éviter les neurones étant transportées ou de migrer entre les deux compartiments 12.

1. Microfluidique réplication de périphériques dans PDMS

  1. Mélanger le prépolymère PDMS à fond avec de l'agent de durcissement (184) dans un rapport de 10:01 et dégazer le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 20 min en général. Vous pouvez aussi mettre le mélangeture dans un tube Falcon de 50 ml et utiliser faible g une centrifugation pour le dégazage.
  2. Placer la couche microstructurée 2-SU-8 sur une plaquette plaque chauffante à 80 ° C et aligner des trames de polymère à chaque dispositif sur la tranche. Verser le PDMS dans les cadres jusqu'à une profondeur de ≥ 5 mm et permettre> 1 h afin d'assurer le durcissement thermique complet.
  3. Une fois durci, retirer la plaquette de la plaque de cuisson et laisser refroidir sur une surface plane.
  4. Porter des lunettes de protection et de travail d'un coin (loin des SU-8 microstructures) avec un scalpel rigide pour forcer doucement le cadre et PDMS de la plaquette.
  5. Retirer le moule PDMS du cadre et utiliser une paire de ciseaux pour couper le dispositif de PDMS excès. Ce que l'on appelle souvent clignotant est produit quand un mince film de PDMS s'étend entre le bâti de polymère et la surface de la plaquette.
  6. PDMS restants peuvent être appliqués sur toute la plaquette et on les durcit pour protéger la pastille durant le stockage. Enlever avant moulage d'un dispositif ultérieur, et en faisant enlever tout particuler les contaminants de la surface.

2. Assemblée de l'appareil et l'interconnexion

  1. Préparer les ports d'interface 6 en utilisant un 3 mm de diamètre biopsie punch. Travailler sur une surface sombre, dans de bonnes conditions d'éclairage et les caractéristiques microstructurées tournées vers le haut pour faciliter l'alignement des ports avec les canaux microfluidiques.
  2. Inspectez l'appareil pour les particules. Enlevez ces aide de ruban adhésif réversible.
  3. Le circuit microfluidique est encapsulé à l'aide d'une couche de PDMS mince monté sur une lamelle de verre: Elles sont préparées par coulée d'un petit volume (~ 0,5 ml) du mélange d'agent de PDMS-durcissant (10:01, 601) sur la base d'un flexible, qualité bactériologique boîte de Pétri. Appuyez doucement sur une lamelle sur la couche de PDMS, placer sur la plaque chauffante et le traitement thermique pendant quelques minutes. Rapidement après refroidissement, utiliser un scalpel pour découper et prix de la bicouche lamelle-PDMS de la boîte de Pétri. Couper avec des ciseaux si nécessaire.
  4. liaison plasma de l'appareil PDMSet la couche de support pour produire une bonne étanchéité: Conditions idéales instrument spécifique. Par exemple, un four à plasma fonctionnant à 70 W et 40 kHz, dans une atmosphère d'oxygène de 0,2 mbar pendant 40 secondes produit une excellente liaison PDMS-PDMS. Une fois le plasma traité, appuyez sur les deux pièces ensemble et laisser reposer pendant une minute pour coller correctement.
  5. Utiliser un tube en silicone (1,6 mm d'identité; 3,2 mm OD) pour s'interfacer avec des pompes et des seringues.

3. Biomatériaux Modélisation et opérations microfluidiques

Les protocoles de biomatériau in situ structuration, de la culture des neurones et des traitements fluidiques sont illustrés dans la figure 2.

Figure 2
Figure 2. Des protocoles microfluidiques Illustrated. A) PL et PLL-g-PEG motif; ajout de la couche d'adhésion cellulaire (par exemple,PL, vert), avec production d'évaporation de l'eau du masque aligné B) de traitement par plasma atmosphérique de l'air de la PL exposé.; deux broches d'antenne sont utilisés, avec l'antenne d'introduction de plasma illustré avec une étoile rose. C) PBS (bleu) lavage par aspiration est utilisé pour éviter de contaminer la région de plasma traité par PL. D) La livraison de PLL-g-PEG (rouge ) par aspiration à enrober les régions de plasma traité E) cellule de chargement.; formation de réseaux microfluidique simultanée des neurones à deux compartiments d'accompagnement par aspiration, F) médias (perfusion rose) à l'aide d'un flux à entrainement hydrostatique La G) traitements fluidiques isolées.; traitement périphérique d'un agent de test (noir) livré à partir du fond de flanc d'entrée par aspiration et H) de traitement central délivré de l'entrée centrale inférieure par aspiration. Figure et légende reproduites avec la permission de la Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Plasma immédiatement après le collage des canaux microfluidiques PDMS sont très hydrophile (angle de contact ≤ 5 °). De telles surfaces sont adaptés à l'adhérence et à la culture de lignées cellulaires telles que les cellules différenciées analogues à des neurones humains SH-SY5Y. Pour la culture ex vivo des neurones primaires et la culture de lignées de cellules précurseurs neuronales telles que la lignée Lund de cellules mésencéphaliques humain (LUHMES) un revêtement de polyamine, soit la polylysine (PL) ou la polyornithine (PO), est nécessaire comme point d'ancrage électrostatique. En plus des protéines d'adhésion comme la laminine ou la fibronectine sont souvent requis que le revêtement de l'intégrine interfaçage. Toutefois, les revêtements PL et PO se lient facilement les neurones, ce qui entrave la distribution microfluidique aux sites de réseau et également imposer des contraintes de cisaillement indésirables. Pour résoudre ce problème biomatériau à la pucestructuration est nécessaire de localiser les matériaux d'adhérence au niveau des sites de piégeage et les microcanaux de excroissance. Cela favorise également le développement des liaisons inter-compartiments et réduit l'enchevêtrement local. Le protocole comprend également l'ajout de matériaux PEG dans les zones voisines pour assurer les protéines et les neurones sont limitées aux endroits désirés pendant une longue culture. Le protocole suivant est décrit dans la figure 3:

Figure 3
Figure 3. L'eau de masquage pour la modélisation biomatériau par pochoir plasma. A) Illustration du processus de masquage de l'eau avec les PDMS micropiliers épingler le ménisque d'eau en place pour pochoir plasma. Courbure du ménisque dans le plan vertical a été négligée. B) de l'eau masque visualisés avec un colorant rouge et positionné par ménisque pmanche. C) Le motif revêtement PL-FITC imagée après plasma pochoir. D) L'addition de protéines de rejet et anti-cellule PLL-g-PEG-TRITC à un PL-FITC revêtement de plasma à motifs. Cela a été utilisé pour l'enregistrement des cellules SH-SY5Y et également pour un motif d'une couche supplémentaire de la fibronectine des cellules LUHMES. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

  1. masquage de l'eau pour in situ biomatériaux Modélisation par pochoir plasma
    1. Peu de temps après le collage de plasma pipette d'un volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml dans du PBS 1x) dans l'orifice central inférieur. En quelques secondes, l'ensemble du circuit microfluidique est rempli par capillarité. Laissez agir quelques minutes pour enrober complètement les PDMS surfaces hydrophiles avec le polyamines.
    2. Éliminer les molécules de polyamines non liés par lavage entraîné aspiration-avec 1x PBS (voir figure 2C) pendant 1 min.
    3. Retirez tous PBS à partir des ports et chauffer l'appareil par un éclairage avec un microscope. Cela augmente l'évaporation à partir des ports pour la formation rapide du masque de l'eau. Le masque de l'eau (illustré sur la figure 3A et documentés dans la figure 3B) est établi à l'intérieur de ~ 5 min.
    4. Inspecter le dispositif par microscopie à assurer masquage d'eau est terminée. S'il vous plaît noter structures de réservoir en amont du site de réseau sont incluses dans la conception de masque pour prolonger la stabilité du masque de l'eau (~ 15 min).
    5. Insérer les broches en acier inoxydable dans les ports (figure 2B). Ceux-ci sont utilisés pour coupler le plasma généré par une décharge corona pression atmosphérique à main ou d'un générateur Tesla (par exemple, fonctionnant à 2 MHz, le signal de 30 kV) 19,20 dans les canaux microfluidiques vacants. Pointer le bout de til plasmatique source proche de la pointe d'une épingle et plasma traiter la microcanaux pour ≤ 1 sec. Utilisez conditions de faible éclairage pour observer la structuration de plasma.
    6. Retirer le masque de l'eau avec une étape de lavage. Utilisez aspiration parallèle des 3 ports supérieurs. Utiliser quatre longueurs égales de tubulure en silicone reliés par un adaptateur 4 voies à une pompe d'aspiration pour réaliser une aspiration parallèle. Lancer aspiration et de distribution de PBS dans les 3 ports bas pour attirer PBS dans le circuit microfluidique. De cette manière, un contraste de matériau PDMS-polyamine est produit (voir la figure 3C). Évacuer PBS du circuit microfluidique et laisser reposer pendant plusieurs heures pour le restaurer, état hydrophobe natif. Ceci rend les PDMS entièrement non permissive de l'adhésion cellulaire.
    7. Si, nécessaires matériaux d'adhésion supplémentaires, telles que la laminine ou la fibronectine les étapes suivantes sont nécessaires et doivent être effectuées immédiatement après avoir enlevé le masque de l'eau: la pipette un de volume de 10 ul de la greffe co-polymère de poly-L- Lysine-poly (éthylène glycol) (PLL-g-PEG, 100 pg / ml, dans du PBS) dans les deux canaux de transmission indirecte de fond, suivi par aspiration à partir des canaux supérieurs flanquantes pendant 2 min.
    8. Sans interruption de l'écoulement, enlever l'excès de PLL-g-PEG par échange avec un tampon PBS. Cette sélectivement enrobe les régions non revêtues de polyamine avec le fragment PEG agissant pour empêcher l'adsorption de protéines et l'adhésion cellulaire 17,21.
    9. les protéines d'adhésion comme la laminine ou la fibronectine peuvent ensuite être co-localisées avec le revêtement de poly-amine: Introduire à la pipette volumes de 10 ul de ces protéines de la MEC (typiquement 10 pg / ml) dans tous les trois orifices de fond. Aspirer des trois premiers ports jusqu'à ce que le dispositif est rempli de la solution de protéine et incuber pendant 1 heure pour produire un revêtement de bonne qualité.
    10. Éliminer les protéines en excès par aspiration PBS à partir des 3 ports de fond.
  2. Microfluidique unique neurone rangeant
    1. Prime appareils avec appropriémangé médias. Ajouter des volumes de 20 pi à 3 orifices de fond et par aspiration parallèle à partir des trois ports supérieurs remplir rapidement le circuit microfluidique avec les médias. Utiliser un raccord de tubulure à 4 voies pour coupler les trois orifices supérieurs par l'intermédiaire de tube en silicone de longueur égale à une pompe d'aspiration.
    2. Ajouter 20 ul d'une suspension de cellules désagrégées (1 x 10 6 cellules / ml) à chacun des ports d'entrée (0 flanquantes, dans la figure 1).
    3. Équipé d'une pompe d'aspiration avec un régulateur de débit ou utiliser une seringue pour l'aspiration douce des 3 ports supérieurs. Neurone complet de formation de réseau nécessite généralement 1 min.
    4. Récolter les neurones excédentaires restantes dans les quatre ports d'accompagnement avec une pipette pour rangeant dans des dispositifs microfluidiques ultérieures.
    5. Retirez le tube. Remplissez tous les ports avec les médias et placer l'appareil dans l'incubateur. En quelques heures, les cellules deviennent totalement adhérente sur le modèle biomatériau.
  3. Neuron Culture, sélective traitement fluidique, et Immunostaining
    1. Échanger les médias par perfusion périodique utilisant l'avance hydrostatique (2 mm de différence de hauteur de la colonne est lent approprié).
    2. Alternativement, submerger le dispositif microfluidique dans les médias, d'échanger les médias périodiquement (2-3 jours) avec des cultures de cellules standard.
    3. Fluidiques traitements sélectifs de chaque neurone compartiment de culture ou de l'excroissance des neurites compartiment central sont obtenus comme suit: Distribuer 20 ul de la substance d'essai dans l'orifice de fond du canal d'intérêt, et aspirer de l'orifice au dessus. Pour de longs traitements réduisent le débit à l'aide d'un régulateur de débit et de reconstituer la substance d'essai au besoin.
    4. Protocoles IMMUNOCOLORATION varient pour chaque cible moléculaire et réactifs associés. Afin de lutter contre le risque potentiel de dommages induits par cisaillement aux neurones un débit lent a été utilisé. Il en résulte une augmentation des temps d'application pour perfuser pleinement le système, un allongement des délais de protocole normales. Hyperfusion drostatic utilisant les ports avec différentes hauteurs de la colonne (par exemple, par 2 mm) a été utilisé pour fournir des réactifs. Plus réactif et plus rapide suppression à l'aide d'une pompe peuvent être utilisés pour réduire les délais d'expérimentation. Connectez une pompe d'aspiration pour les trois ports supérieurs à attirer réactifs des 3 ports de fond.

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Representative Results

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exploits de masquage de l'eau de surface tension. La tolérance à la pression à l'interface air-liquide échelles inversement avec le rayon de courbure [ , Produisant des interfaces très stables à des dimensions microfluidiques. Les micropiliers ancrer efficacement le masque de l'eau en place. formation d'un masque de l'eau est conduite par évaporation à partir des ports microfluidiques, avec l'augmentation du taux de chauffage. Utilisation de la chaleur de faible grossissement (4X - 10X) microscopie éclairage, le masque de l'eau a été généralement établir dans ≤ 5 min. L'évaporation conduit également à la chute éventuelle du masque de l'eau. Pour augmenter la durée de vie du masque de l'eau à environ 15 min (pratique pour pochoir plasma), 18 structures de réservoir nl ont été positionnés en amont des compartiments de la culture. Le taux de formation de masque de l'eau et de l'effondrement peut varier, et l'observation intermittente est recommandé d'identifier une période appropriée pour le plasma traitement. Néanmoins, plusieurs appareils peuvent être préparés simultanément.

pochoir plasma nécessite ~ 1 sec. L'utilisation des traitements de longue durée vaporise le masque de l'eau, ce qui conduit à la désintégration du plasma excessive du revêtement de polyamine. À l'occasion des résultats insuffisants de traitement par plasma, laissant revêtements de polyamines intactes sur le mur de microcanaux adjacent (voir la figure 3D) qui peut soutenir l'adhésion des neurones 12. Néanmoins, les neurones corticaux de souris parée avaient un rendement de 89,5% de motifs 12 suivant culture pendant 6 jours. Cette efficacité est équivalente à motifs PL / PEG sur des substrats planaires. Structuration biomatériau a en outre le mérite de promouvoir des excroissances dans les microcanaux de neurites. Avec des excroissances de mise en forme étendues à l'intérieur des biomatériaux ~ 90% des micro-canaux, alors qu'avec un niveau d'excroissance de revêtement en continu de polyamines ont été réduits à environ 70%. Utilisation de neurones corticaux, 7 jours de culture à la puce a été nécessaire pour la outgrowTHS à s'étendre deux compartiments (sur une distance de 500 um). Neurones différenciés SH-SY5Y humains avaient des taux plus élevés de l'excroissance, établir des connexions en 4-6 jours. Neurones corticaux, LUHMES et SH-SY5Y ont été cultivées pendant 2 semaines. Ceci est suffisamment longue pour que la fonction électrophysiologique spontanée à réaliser et peut être mesurée indirectement par Ca 2 + imagerie. Ce serait valider l'applicabilité généralisée de la structuration biomatériau et des méthodes de formation de réseaux microfluidiques pour l'établissement de réseaux neuronaux fonctionnels.

Les structures du ménisque épinglage ne, cependant, favorisent l'enchevêtrement des neurites (voir la figure 4C). Bord constatation est une caractéristique commune des axones cultivées sur des surfaces microstructurées 22. Pour éviter de tels enchevêtrement et de promouvoir davantage la formation de connexions entre les compartiments, piliers du ménisque épinglage peuvent être fusionnés avec la paroi du microcanal (pas plus de libre-debout). En outre, des excroissancesdans le canal microfluidique central peut être désorganisé. Pour les expériences nécessitant une connectivité linéaire, le canal central peut être retiré (voir les modèles de masque à Dinh et al. 12, des informations supplémentaires). Ce circuit nécessite de formation de réseau de série du premier compartiment, suivie d'une période (par exemple, 4 heures) pour l'adhésion cellulaire ou dite soupape cellulaire 14 pour rendre le circuit des cellules permissives pour la rangeant dans le second compartiment.

Le circuit microfluidique fournit des opérations fluidiques pré-programmés. Les différentes fonctions sont déterminées par le choix d'un port pour charger les réactifs ou l'interface avec des tubes ou des conseils. Cela évite la nécessité de complexe, exigeant instrumentation asservi coûteux et d'espace pour faire la technique très accessible pour les neurobiologistes. conception de circuit dépend de façon critique sur les dimensions relatives optimales pour atteindre microfluidique rangeant 12-14. De petits changements peuvent empêcher la cirCuit de fonctionner, et nous avons recommandé donc adopteurs initiaux des protocoles à utiliser les modèles disponibles gratuitement 12. Avec un circuit optimal, microfluidique unique de formation de réseau de neurones est rapide, avec ~ 100 neurones disposés dans chaque chambre de culture en moins de 1 min. Malgré le nombre limité de neurones, la densité locale est encore équivalent à des cultures standard pour fournir un soutien de vie des niveaux de signalisation suffisantes. Comme indiqué dans la figure 4B cette approche donne effectivement 1 neurone par piège (1,14 ± 0,09) 12. Cependant, tous les neurones sont disposés en réseau. Le circuit microfluidique génère des lignes de courant en parallèle, tels que les neurones qui arrivent dans les zones extérieures de l'écoulement laminaire continuent vers le canal de serpentin. Néanmoins, le système présenté est de 10-100 fois plus économique avec des cellules de systèmes cloisonnés existants. Cellules expulsés peuvent être récoltées à partir des ports et des tubes. Dans les conceptions futures, déplacement latéral déterministe amontstructures 23 peuvent être utilisés pour détourner toutes les cellules dans la formation de réseaux rationalise l'économie cellulaire absolue.

Figure 4
Figure 4. Microfluidique neurone formation de réseaux. A) l'aspiration manuelle à l'aide d'une seringue est utilisée pour doux neurone formation de réseaux. Un raccord de tubes à 4 voies est utilisé pour interfacer la seringue avec les 3 ports supérieurs pour neurone simultanée rangeant dans les deux compartiments. B) différenciées des cellules SH-SY5Y droits neurones comme et d'autres neurones sont disposées avec une précision d'une seule cellule (un neurone par piège ). C) Après 5 jours de culture, les extensions de neurites relient les deux cultures. Noyaux sont colorés avec du DAPI et l'actine immunologique a été utilisé pour visualiser les excroissances. Chiffre modifié et la légende reproduites avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) Cliquez ici pour agrandir l'image.

Un élément clé des systèmes compartimentés est la capacité de traiter sélectivement les populations de cellules individuelles pour enquêter sur le trafic de matériel et de la signalisation à longue portée. Cependant, les méthodes disponibles dans la littérature sont soit insuffisantes pour l'isolement fluidique ou sont mal décrit. La méthode d'isolement fluidique nous avons développé permet la livraison rapide (<1 min) des substances d'essai et de l'isolement fluidique prolongée (> 1 h) 12. Les résultats sont consignés dans la figure 5. Cette capacité est rendue possible par la combinaison de la conception de circuit et à l'aide de l'aspiration pour fournir la substance d'essai. Ceci est en contraste avec l'injection de fluide soit à l'aide d'une pompe à seringue d'alimentation en hydrostatique. En dépit de la résistance fluidique élevée des canaux de la croissance des neurites, ces procédés produisent des chemins de convection tchapeau disperser rapidement substances d'essai et de contaminer l'ensemble du dispositif. L'aspiration à partir de l'orifice supérieur interagit également avec le fluide tout au long du circuit (un élément central de la résistance différentielle rangeant principe). Cependant, dans ce mode de fonctionnement, les médias sont tirées dans le reste du circuit pour diluer la substance d'essai, au lieu de le disperser. Compte tenu de la résistance fluidique extrême (relative) des canaux de la croissance des neurites, le niveau de dilution est négligeable. Pour les expériences impliquant l'établissement de gradients de diffusion, le procédé d'aspiration peut être utilisée pour traiter sélectivement un compartiment, avec la cessation de l'écoulement utilisé pour initier l'évolution en fonction du temps du gradient chimique.

Figure 5
Figure 5. Des traitements sélectifs fluidiques. A) les traitements sélectifs aspiration mécanique de til flanquant central et B) compartiments. La flèche indique le seul port utilisé pour l'aspiration. Les traitements ont été mis en place dans une min (lignes rouges) et ont été maintenus pendant la durée de l'expérience; 60 min (lignes bleues). Chiffre modifié et la légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

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La technique de formation de réseau microfluidique est le premier de son genre qui permet une manipulation simple neurone de précision pour établir cultures minimalistes. Couplé avec la méthode in situ de structuration biomatériau, une approche puissante pour aligner les modèles de cellules avec des structures microfluidiques, ces cultures minimalistes ont des niveaux de connectivité haut de intercompartment à une réduction de l'enchevêtrement local. Ces caractéristiques peuvent être utilisées pour l'étude efficace de transmission inter-compartiment, et avec des modifications simples de conception ont le potentiel pour isoler les axones individuels pour la visualisation et l'analyse quantitative. Par exemple, dans la prochaine génération conçoit les structures de trident peuvent être remplacés par un canal de prolongement par neurone à réduire la probabilité de multiples axones formant des faisceaux. Ces capacités peuvent grandement bénéficier d'une variété d'applications, y compris les neurosciences; nanoparticulaire toxicité 24 et la propagation de manganèse 25, l'activité synnisation dans l'épilepsie, la dissémination des agents infectieux tels que les prions, 26 bêta-amyloïde (Ab) la transmission de la maladie d'Alzheimer, 9 et alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson 27.

Un autre avantage évident de la méthode de formation de réseau microfluidique est la capacité à entreprendre des recherches sous-populations de neurones abondance faibles plutôt que les cultures hétérogènes complexes. Par exemple, les neurones dopaminergiques de la substance noire appropriés pour la recherche ou périphériques des neurones de Parkinson qui ne peuvent être isolés en petit nombre sont encore suffisante pour les études répétées en utilisant la plate-forme microfluidique. D'autres exemples d'application de rares cellules comprennent l'étude de la fonction de perte de l'ouïe au moyen d'un dispositif d'essai de cellules ciliées co-cultivées avec des neurones des ganglions de la spirale, ou des études utilisant des cellules souches pluripotentes induites chez l'homme. De même, les faibles exigences de cellules du système rendentfacilement possible d'entreprendre des expériences avec les neurones du cerveau miniature Drosophilia melanogaster 28 et ainsi tirer parti des avantages de ce modèle génétique puissant.

L'autre point de vue est le pragmatisme de l'économie cellulaire et le faible encombrement de l'appareil qui fait de la recherche à haut débit gérable. Chaque état et chaque répétition nécessite neurones minimes, une fonctionnalité qui peut être utilisé pour réduire considérablement le nombre d'animaux en ligne avec l'initiative 3R en cours. Par exemple, l'analyse d'un grand panel de composés de réponse à la dose peut être réalisée en utilisant un seul animal. Types d'écrans comprennent des tests de toxicité et l'enquête des bibliothèques de siRNA ou d'agents pharmacologiques pour leur effet sur le trafic à longue distance et la transduction du signal. En résumé, les protocoles décrits étendre la portée expérimentale de la neuroscientifique, offrant la possibilité de fournir un débit élevé, quantitative et statistiquedonnées allié puissant avec une résolution unique et subcellulaire. Ceci et les nombreux autres grands développements dans le domaine des neurosciences conduira à de nouvelles connaissances sur les mécanismes de développement neuronal sous-jacent et la fonction, ainsi que les processus pathologiques responsables de la maladie.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Ulrich Marggraf (ISAS) pour SU-8 de fabrication et Maria Becker (ISAS) pour l'imagerie SEM. La recherche a été soutenue financièrement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), un Bundesministerium für Bildung und Forschung subvention (BMBF 0101-31P6541) et par le Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf grâce l'École internationale d'études supérieures Leibniz «biologie des systèmes Lab-on-a-Chip» pour un soutien financier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

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References

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Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision
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Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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