Summary
يتم وصف بروتوكولات لاحد الخلايا العصبية ميكروفلويديك arraying واخفاء المياه للالزخرفة البلازما الطلاء مادة بيولوجية في رقاقة. مترابطة للغاية المشترك الثقافات يمكن إعدادها باستخدام الحد الأدنى من المدخلات الخلية.
Abstract
وقد اجتذبت تجسيد ميكروفلويديك للغرفة Campenot اهتماما كبيرا من المجتمع الأعصاب. هذه المنصات شارك في الثقافة مترابطة يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من الأسئلة، والتي تمتد بيولوجيا الأعصاب التنموية والوظيفية للعدوى وانتشار المرض. ومع ذلك، الأنظمة التقليدية تتطلب مدخلات هامة الخلوية (عدة آلاف في المقصورة)، وعدم كفاية لدراسة الخلايا وفرة منخفضة، مثل الدوبامين substantia الرمادية الأولية، دوامة العقد، وDrosophilia الخلايا العصبية البطن، وغير عملي بالنسبة لإنتاجية عالية التجريب. كما متشابكا للغاية محليا الثقافات الكثيفة، مع عدد قليل من الامتداد (<10٪) ربط الثقافتين. في هذه الورقة تم وصفها بروتوكولات ميكروفلويديك والزخرفة واضحة تعالج هذه التحديات: (ط) عصبون واحد ميكروفلويديك arraying الأسلوب، و (ب) طريقة اخفاء المياه عن الزخرفة البلازما الطلاء مادة بيولوجية لريجيستير الخلايا العصبية وتعزيز نمو بين المقصورات. أعدت أضيق الحدود العصبية المشترك الثقافات مع مستوى عال (> 85٪) الربط intercompartment ويمكن استخدامها لإنتاجية عالية الدقة مع التجارب بيولوجيا الأعصاب خلية واحدة.
Introduction
الأنسجة العصبية هي معقدة للغاية؛ خليط غير متجانس الخلوية التي أمرت مكانيا داخل طبقات ومقصورات المعرفة والربط مع البلاستيك عن طريق الاتصال الخليوي، وخصوصا عن طريق محور عصبي والتغصنات الامتداد. ويلزم تقنيات جديدة لمنح مزيد من الحرية التجريبية لاكتساب رؤى أعمق وآليات تنحل المركزية للمرض، والتنمية، وظيفة صحية. غرفة Campenot 1،2 و microfabricated مؤخرا تجسيد 3،4 يمكن استخدامها لخارج الحي إعداد الشبكات العصبية المشترك الثقافات، مع القدرة على التشويش انتقائي السكان جسدية مختلفة، وأيضا الامتداد محوار بهم. وعلى سبيل المثال تم استخدام هذه الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة تنكس محور عصبي والتجديد التالية الكيميائية أو الليزر 5،6 axotomy 6-8، tauopathy 9، نشر الفيروسية 10،11، ومرنا في توطين المحاور 4.
الأنف والحنجرة ">لتوسيع نطاق من بيولوجيا عصبية، يطلب من التطورات التكنولوجية لإعداد أضيق الحدود العصبية المشترك الثقافات. وهذا يتيح disentanglement الشبكة العصبية للتحقيق في النظام مع خلية واحدة والدقة شبه الخلوية. متطلبات الحد الأدنى من أعداد الخلايا يفتح إمكانية لتحليل أنواع الخلايا النادرة، بما في ذلك خلايا الدوبامين substantia الرمادية ذات الصلة لمرض باركنسون، والعقد دوامة من الأذن، الخلايا العصبية الطرفية، والخلايا الجذعية. أبعد من ذلك، والاقتصاد الخلوية هي ذات الصلة إلى المبادرة 3RS. باستخدام هذه المنصات ميكروفلويديك، شاشات سمية على نطاق واسع أو غيرها من إنتاجية عالية، سلسلة البيانات التجريبية الغنية التي تتطلب الخلايا العصبية الحيوانية ويمكن الآن النظر فيها.
في هذه الورقة تم وصفها بروتوكولات لتصنيع واستخدام جهاز ميكروفلويديك. arraying ميكروفلويديك في تركيبة مع biomateri في الموقع آل أسلوب الزخرفة يمكن استخدامها لتسجيل مترابطة للغاية العصبية المشترك الثقافات باستخدام أرقام الخلية الحد الأدنى. ويستند arraying ميكروفلويديك على نهج تدفق التفاضلية 12-15، حيث يتم وضع الشراك microstructured داخل الدائرة فلويديك (موضح جنبا إلى جنب مع الصور ووزارة شؤون المرأة في الشكل 1). المسار 0 → 1 ديه مقاومة أقل فلويديك (R 2> R 1) لنقل الخلايا العصبية لمجموعة خطية من فتحات microstructured - مداخل إلى قنوات ثمرة neurite. شغل في فخ من قبل خلية واحدة يعوق تدفق محليا لتحويل يبسط لمحاصرة الخلايا اللاحقة في الفخاخ المجاورة. الإشغال كاملة من الفخاخ في مجموعة مفاتيح نسبة فلويديك (R 1> R 2) لتحويل يبسط في طريق اعوج (0 → 2) لإنتاج وضع الالتفافية من عملية لإزالة الخلايا العصبية الزائدة.
ق ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. ميكروفلويديك الدائرة. أ) الدائرة المقاومة التفاضلية فلويديك لarraying الخلايا العصبية واحد، مع المرافقة غرف ثقافة مترابطة عن طريق قنوات ثمرة neurite. B، C الصور) ووزارة شؤون المرأة من طبقة ثنائية الخلايا العصبية مجزأة شارك في ثقافة مجموعة مع الغضروف المفصلي تعلق micropillars. مع هذا التصميم، استخدمت الهياكل العصبية محاصرة على شكل ترايدنت لتعزيز تليف من الامتداد محوار. الرقم وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) 12. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
يمكن بسهولة أن يتحقق إعداد الشبكات العصبية micropatterned على ركائز مستو (لالامثله وفاق من مجموعتنا، انظر Frimat وآخرون 16 وهايكه وآخرون 17). ومع ذلك، التغليف أنماط المواد النشطة بيولوجيا داخل الأجهزة PDMS ومع متطلبات المواءمة ميكرومتر نطاق هذه إلى قنوات ميكروفلويديك يشكل تحديا تقنيا كبيرا. في القسم 3.1 في رقاقة، أو في الموقع، ويقدم إعداد أنماط بيولوجية بروتوكول لل. هذه الأنماط تمكين تسجيل الخلايا العصبية خلال فترات زمنية مطولة وتعزيز ثقافة الامتداد بين المقصورات. وتستخدم المجهرية الغضروف المفصلي، تعلق لمحاذاة ما يسمى قناع المياه مع الخلايا العصبية arraying المواقع والقنوات ثمرة neurite. قناع يحمي الطلاء المياه جزيء التصاق أثناء العلاج البلازما، بينما تفككت الأسطح المكشوفة لتعريف نمط مادة بيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكولات لخلية ثقافة والعزلة فلويديك اللازمة لعلاج انتقائية لمختلف المقصورات ثقافة مشتركة.
ve_content "> تم تصميم بروتوكولات للاستفادة من المبادئ الصديقة للمستخدم الطباعة الحجرية الناعمة لتكرار بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) الأجهزة ميكروفلويديك 18. وبالمثل، مادة بيولوجية في الوضع الطبيعي الزخرفة واضح ومباشر، واستغلال التبخر والسطح ظواهر التوتر، وفقط تتطلب باليد مصدر البلازما غير مكلفة. الدائرة ميكروفلويديك فعالية العلاجات برامج التحميل ومقصورة خلية محددة مما يجعل هذه العمليات مجرد مسألة الاستغناء المواد في منفذ أسفل الصحيح والشفط من فوق. وبهذه الطريقة، فإنه يهدف إلى إعطاء بيولوجيا عصبية الحرية لإعداد واستخدام أجهزة ميكروفلويديك في المختبرات الخاصة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتهدف البروتوكولات لعلماء الأعصاب، ويتم تلخيصها في الشكل 2. على هذا النحو فمن المستحسن أن التصنيع الدقيق من SU-8 الماجستير تستخدم لPDMS النسخ المتماثل الاستعانة بمصادر خارجية إلى مرافق تجارية أو المؤسسية. هي متاحة بحرية كمعلومات تكميلية (ZIP) على الجمعية الملكية للكيمياء موقع 12 التصاميم قناع طبقة اثنين. الأهم من ذلك، ينبغي أن تكون ملفقة أول طبقة SU-8 على عمق 2.5-3.0 ميكرون، والثانية على عمق 25-30 ميكرومتر. هذه هي الأبعاد الرئيسية اللازمة لفعالية arraying الخلايا العصبية. الحد ارتفاع 3 ميكرون ضروري أيضا لمنع الخلايا العصبية التي يجري نقلها أو المهاجرة بين اثنين من المقصورات 12.
1. النسخ المتماثل جهاز ميكروفلويديك في PDMS
- خلط prepolymer PDMS تماما مع وكيل علاج (184) بنسبة 10:1 وديغا الخليط في مجفف فراغ لعادة 20 دقيقة. بدلا من ذلك، وضع مزيجتلح في 50 مل فالكون أنبوب واستخدام منخفض ز الطرد المركزي لفصل الغاز.
- 2 وضع طبقة microstructured SU-8 الرقاقة على موقد 80 درجة مئوية ومواءمة الأطر البوليمر لكل جهاز على الرقاقة. صب PDMS في إطارات على عمق ≥ 5 ملم والسماح> 1 ساعة لضمان المعالجة الحرارية كاملة.
- مرة واحدة الشفاء، وإزالة الرقاقة من موقد والسماح لتبرد على سطح مستو.
- ارتداء النظارات الواقية والعمل من زاوية واحدة (بعيدا عن SU-8 المجهرية) مع مشرط جامدة لجائزة بلطف الإطار وPDMS من رقاقة.
- إزالة العفن PDMS من الإطار واستخدام زوج من مقص لتقليم الجهاز من PDMS الزائدة. وغالبا ما ينتج هذا ما يسمى امض عند طبقة رقيقة من PDMS ينتشر بين الإطار البوليمر وسطح الرقاقة.
- PDMS المتبقية يمكن تطبيقها على الرقاقة بأكملها ومملح لحماية الرقاقة أثناء التخزين. إزالة هذا الجهاز قبل صب اللاحقة، وبذلك إزالة أي عالتعبير عن الملوثات من السطح.
2. الجمعية الأجهزة والربط البيني
- إعداد منافذ واجهة 6 باستخدام 3 مم خزعة قطر لكمة. العمل على سطح الظلام، في ظروف الإضاءة الجيدة ومع ميزات microstructured متجهة لأعلى لمساعدة محاذاة الموانئ مع قنوات ميكروفلويديك.
- فحص الجهاز للجسيمات. إزالة هذه باستخدام شريط لاصق عكسها.
- يتم تغليف الدائرة ميكروفلويديك باستخدام طبقة رقيقة PDMS التي شنت على ساترة الزجاج: تم إعداد هذه بسكب كمية صغيرة (~ 0.5 مل) من خليط كيل PDMS متصلب (10:1، 601) على قاعدة مرنة، الصف البكتريولوجية طبق بيتري. اضغط بلطف ساترة على طبقة PDMS، ووضع على موقد وعلاج حراريا لبضع دقائق. بسرعة بعد التبريد، واستخدام مشرط لقطع والجائزة طبقة ثنائية ساترة PDMS من طبق بيتري. تقليم مع مقص إذا لزم الأمر.
- السندات البلازما الجهاز PDMSوطبقة الدعم لإنتاج ختم جيدة: الظروف المثلى هي أداة محددة. على سبيل المثال، فرن البلازما تعمل في 70 W و 40 كيلو هرتز في جو 0.2 م بار الأكسجين لمدة 40 ثانية تنتج ممتازة السندات PDMS-PDMS. مرة واحدة تعامل البلازما، اضغط كلا الجزأين معا ويترك لمدة دقيقة واحدة لالسندات بالكامل.
- استخدام أنابيب السيليكون (1.6 ملم معرف؛ 3.2 مم OD) على التفاعل مع المضخات والمحاقن.
3. مادة بيولوجية الزخرفة وعمليات ميكروفلويديك
ويوضح بروتوكولات الزخرفة مادة بيولوجية الموقع، ثقافة العصبية وعلاجات فلويديك في في الشكل 2.
الشكل 2. بروتوكولات ميكروفلويديك المصور. A) PL وPLL-G-PEG الزخرفة؛ إضافة طبقة التصاق الخلية (على سبيل المثال،PL، الأخضر)، مع تبخر المياه المنتجة قناع محاذاة B) الغلاف الجوي العلاج البلازما الجوية من PL عرضة للخطر.؛ وتستخدم اثنين من المسامير الهوائي، مع الهوائي مقدمة البلازما يتضح مع نجم الوردي يستخدم. C) برنامج تلفزيوني (الأزرق) الغسيل بواسطة طموح لتجنب تلويث المنطقة المعالجة البلازما مع PL. D) تسليم PLL-G-PEG (أحمر ) من خلال التطلع إلى معطف المناطق المعالجة البلازما E) تحميل الخلية.؛ arraying ميكروفلويديك في وقت واحد من الخلايا العصبية إلى كل من المقصورات المرافقة بواسطة الشفط، F) وسائل الاعلام (الوردي) الارواء باستخدام تدفق مدفوعة الهيدروستاتيكي-G) العلاجات فلويديك المعزولة؛ تسليم المعاملة الطرفية وكيل الاختبار (أسود) من أسفل مدخل المرافقة بواسطة الطموح وH) معالجة مركزية تسليمها من مدخل وسط القاع بواسطة الشفط. الرقم وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء(RSC) 12. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
البلازما التالية مباشرة تربط القنوات ميكروفلويديك PDMS هي ماء عالية (الاتصال زاوية ≤ 5 °). هذه السطوح هي مناسبة للالتصاق والثقافة من خطوط الخلايا مثل الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا SH-SY5Y الإنسان متباينة. لفيفو السابقين الثقافة من الخلايا العصبية الأولية والثقافة من خطوط الخلايا العصبية السلائف مثل خط لوند خلية الدماغ المتوسط الإنسان (LUHMES) طلاء البولي أمينات، إما متعدد الليزين (PL) أو polyornithine (أ ف ب)، مطلوب باعتباره مرتكزا كهرباء. بالإضافة غالبا ما يطلب من البروتينات التصاق مثل laminin أو فبرونيكتين مثل طلاء التواصل إنتغرين. ومع ذلك، فإن PL وPO الطلاء بسهولة ربط الخلايا العصبية، مما يعوق تسليم ميكروفلويديك إلى مواقع مجموعة وفرض اجهادات القص غير المرغوب فيها أيضا. لحل هذه المشكلة مادة بيولوجية في رقاقةمطلوب الزخرفة في توطين المواد التصاق في مواقع فخ وو microchannels ثمرة. هذا يشجع أيضا على تطوير الاتصالات بين المقصورة ويقلل من تشابك المحلية. ويشمل البروتوكول أيضا إضافة مواد PEG إلى المناطق المجاورة لضمان تقتصر البروتينات والخلايا العصبية إلى الأماكن المطلوبة خلال الثقافة مطولة. تم توثيقه بروتوكول التالية في الشكل 3:
الرقم 3. المياه اخفاء لتنميط مادة بيولوجية من قبل بالستينسيل البلازما. أ) توضيحات من عملية اخفاء المياه مع micropillars PDMS تعلق الغضروف المفصلي المياه في مكان لبالستينسيل البلازما. وقد أهملت انحناء الغضروف المفصلي في الطائرة العمودية. B) قناع المياه تصور مع صبغة حمراء وضعه من قبل الغضروف المفصلي عالشوط. ج) منقوشة طلاء PL-FITC تصويرها بعد بالستينسيل البلازما. D) إضافة البروتين رفض وطارد الخلية PLL-G-PEG-TRITC إلى نقوش البلازما PL-FITC الطلاء. تم استخدام هذا لتسجيل الخلايا SH-SY5Y وأيضا لتنميط طبقة إضافية للخلايا فبرونيكتين LUHMES. الرقم وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) 12. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
- اخفاء المياه عن الوضع الطبيعي في مادة بيولوجية الزخرفة بواسطة البلازما بالستينسيل
- بعد وقت قصير من الترابط البلازما ماصة حجم 0.5 ميكرولتر من PL أو ص (100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X) في منفذ مركز القاع. في غضون ثواني شغل في الدائرة ميكروفلويديك بالكامل عن طريق عمل شعري. يترك لبضع دقائق لمعطف تماما PDMS السطوح المائية مع بولياالألغام.
- إزالة جزيئات البولي أمينات غير منضم عن طريق الغسيل يحركها الطموح مع برنامج تلفزيوني 1X (انظر الشكل 2C) لمدة 1 دقيقة.
- إزالة كل برنامج تلفزيوني من الموانئ وتسخين الجهاز عن طريق الإضاءة مع المجهر. هذا يزيد التبخر من المنافذ لتشكيل قناع الماء السريع. يتم تأسيس قناع المياه (موضح في الشكل 3A وثقت في الشكل 3B) في غضون 5 دقائق ~.
- فحص الجهاز عن طريق الفحص المجهري لضمان اخفاء المياه كاملة. يرجى ملاحظة يتم تضمين الهياكل خزان المنبع من موقع مجموعة في تصميم قناع لإطالة استقرار قناع المياه (~ 15 دقيقة).
- إدراج دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ في الموانئ (الشكل 2B). وتستخدم هذه لزوجين البلازما الناتجة عن ضغط باليد كورونا التفريغ في الغلاف الجوي أو تسلا مولد (على سبيل المثال، تعمل على 2 ميجا هرتز، 30 كيلو فولت إشارة) 19،20 في القنوات ميكروفلويديك الشاغرة. تشير غيض من رانه البلازما مصدر مقرب من غيض من دبوس واحد والبلازما علاج متناهية ل≤ 1 ثانية. استخدام ظروف الإضاءة المنخفضة لمراقبة الزخرفة البلازما.
- إزالة القناع الماء مع خطوة الغسيل. استخدام تطلع موازية من الموانئ العلوي 3. استخدام 4 أطوال متساوية من أنابيب السيليكون متصلة بواسطة محول 4-سيلة لمضخة الشفط لتحقيق الطموح موازية. بدء الطموح والاستغناء برنامج تلفزيوني في الجزء السفلي 3 منافذ لرسم برنامج تلفزيوني عبر الدائرة ميكروفلويديك. في هذه الطريقة يتم إنتاج مادة التباين PDMS عديد الأمين (انظر الشكل 3C). إخلاء PBS من الدوائر ميكروفلويديك وترك لعدة ساعات لاستعادة دولة مسعور الأصلية. هذا يجعل PDMS كاملا غير متساهلة إلى التصاق الخلية.
- يجب التصاق مواد إضافية، مثل laminin أو فبرونيكتين، تكون هناك حاجة مطلوبة الخطوات التالية وينبغي أن يتم ذلك مباشرة بعد إزالة القناع المياه: ماصة حجم 10 ميكرولتر من الكسب غير المشروع المشترك البوليمر بولي-L- يسين بولي (جلايكول الإثيلين) (PLL-G-PEG، و 100 ميكروغرام / مل، في برنامج تلفزيوني) في كل القنوات أسفل المرافقة، تليها تطلع من القنوات المرافقة العليا لمدة 2 دقيقة.
- دون انقطاع تدفق، وإزالة الزائدة PLL-G-PEG عن طريق تبادل مع العازلة PBS. هذه المعاطف انتقائي المناطق المغلفة غير البولي أمينات مع شاردة PEG تعمل على منع امتصاص البروتين والخلايا التصاق 17،21.
- بروتينات التصاق مثل laminin أو فبرونيكتين يمكن بعد ذلك شارك المترجمة مع طلاء بولي أمين: ماصة 10 ميكرولتر من كميات هذه البروتينات ECM (عادة 10 ميكروغرام / مل) في جميع منافذ القاع الثلاثة. نضح من أعلى ثلاثة منافذ حتى يتم شغل الجهاز مع حل البروتين واحتضان لمدة 1 ساعة لإنتاج طلاء نوعية جيدة.
- إزالة البروتينات الزائدة عن طريق الشفط برنامج تلفزيوني من أسفل 3 منافذ.
- ميكروفلويديك واحدة العصبية Arraying
- رئيس الأجهزة مع اعتماداتيأكلون وسائل الإعلام. إضافة 20 مجلدا ميكرولتر إلى أسفل 3 منافذ وتطلع موازية من الموانئ الثلاثة العليا ملء بسرعة الدائرة ميكروفلويديك مع وسائل الاعلام. استخدام موصل أنابيب 4 في اتجاه لزوجين الموانئ العلوي 3 عبر متساوية طول أنابيب السيليكون لمضخة الشفط.
- إضافة 20 ميكرولتر من تعليق خلية المصنفة (1 × 10 6 خلية / مل) إلى كل من الموانئ المرافقة مدخل (0، في الشكل 1).
- تجهيز مضخة الشفط مع منظم تدفق أو استخدام حقنة لطيف تطلع من العلوي 3 منافذ. كاملة الخلايا العصبية arraying يتطلب عادة 1 دقيقة.
- حصاد الخلايا العصبية الزائدة المتبقية في الموانئ المرافقة 4 مع ماصة للarraying في أجهزة ميكروفلويديك اللاحقة.
- إزالة الأنبوب. ملء جميع الموانئ مع وسائل الاعلام ووضع الجهاز في الحاضنة. في غضون ساعات قليلة الخلايا تصبح ملتصقة تماما على نمط مادة بيولوجية.
- الخلايا العصبية الثقافة والانتقائية فلويديك العلاج، واللقاحاتnostaining
- تبادل وسائل الإعلام من خلال نضح الدورية باستخدام الأعلاف الهيدروستاتيكي (أ 2 مم ارتفاع عمود الفرق هو بطيء بشكل مناسب).
- بدلا من ذلك، غمر الجهاز ميكروفلويديك في وسائل الإعلام، وتبادل وسائل الإعلام بشكل دوري (2-3 أيام) كما هو الحال مع الثقافات الخلية القياسية.
- وتتحقق العلاجات فلويديك انتقائية إما الخلايا العصبية الثقافة مقصورة أو مقصورة محوار المركزية ثمرة النحو التالي: الاستغناء عن 20 ميكرولتر من مادة الاختبار في منفذ قاع القناة المثيرة للاهتمام، ونضح من الميناء مباشرة فوق. لعلاجات طويلة لحد من معدل تدفق باستخدام منظم تدفق وتجديد مادة الاختبار على النحو المطلوب.
- بروتوكولات المناعية تختلف عن كل هدف الجزيئية والكواشف المرتبطة بها. من أجل مواجهة المخاطر المحتملة التي يسببها القص الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية تم استخدام معدل تدفق بطيء. هذه النتائج في زيادة مرات التطبيق ليروي تماما النظام، وتمتد أوقات بروتوكول العادية. HYتم استخدام نضح drostatic باستخدام المنافذ مع اختلاف ارتفاعات العمود (على سبيل المثال، بنسبة 2 ملم) لتسليم الكواشف. بالإضافة كاشف أكثر سرعة وإزالة باستخدام مضخة يمكن استخدامها للحد من الجداول الزمنية التجريبية. توصيل مضخة تطلع إلى الأعلى 3 منافذ لرسم الكواشف من أسفل 3 منافذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مآثر اخفاء المياه السطحية التوتر. التسامح الضغط في واجهة الهواء السائل موازين عكسيا مع نصف قطر انحناء [ 
، وإنتاج واجهات درجة عالية من الاستقرار في أبعاد ميكروفلويديك. وmicropillars ترسيخ فعال قناع المياه في المكان. هو الدافع وراء تشكيل قناع المياه عن طريق التبخر من الموانئ ميكروفلويديك، مع معدل زيادة عن طريق التسخين. باستخدام الحرارة من التكبير المنخفض (4X - 10X) المجهري الإضاءة، وقناع المياه عادة في إنشاء ≤ 5 دقائق. يؤدي التبخر أيضا إلى انهيار في نهاية المطاف من قناع المياه. لزيادة عمر قناع المياه إلى ~ 15 دقيقة (عملية لبالستينسيل البلازما)، تم وضع 18 هياكل خزان NL المنبع من المقصورات الثقافة. معدل تكوين قناع المياه وانهيار يمكن أن تختلف، وينصح المراقبة المتقطعة لتحديد فترة مناسبة للبلازما رreatment. مع ذلك، يمكن إعداد أجهزة متعددة في وقت واحد.
بالستينسيل البلازما يتطلب ~ 1 ثانية. استخدام علاجات طويلة يبخر قناع المياه، مما يؤدي إلى الإفراط في التفكك البلازما للطلاء البولي أمينات. على غير كافية نتائج العلاج البلازما المناسبة، وترك الطلاء البولي أمينات سليمة على الجدار متناهية المجاورة (انظر الشكل 3D) التي يمكن أن تدعم التصاق الخلايا العصبية 12. ومع ذلك، كان الماوس المحتشدة الخلايا العصبية القشرية كفاءة الزخرفة من 89.5٪ 12 التالية الثقافة لمدة 6 أيام. هذه الكفاءة ما يعادل أنماط PL / PEG على ركائز مستو. الزخرفة مادة بيولوجية لديه ميزة إضافية لتعزيز الامتداد إلى محوار و microchannels. مع الامتداد الزخرفة مادة بيولوجية تمديد داخل ~ 90٪ من و microchannels، بينما مع عديد الأمين المستمر لمستويات ثمرة طلاء خفضت إلى ~ 70٪. استخدام الخلايا العصبية القشرية، 7 أيام من الثقافة في رقاقة كان مطلوبا لتتفوقتي إتش إس تمتد كل من مقصورات (على مسافة 500 ميكرون). كان متباينة الخلايا العصبية البشرية SH-SY5Y أعلى معدلات نمو، وإقامة الاتصالات في 4-6 أيام. تم تربيتها القشرية، LUHMES وSH-SY5Y الخلايا العصبية لتصل إلى 2 أسابيع. هذا هو طويل بما فيه الكفاية من أجل وظيفة الكهربية عفوية إلى أن يتحقق ويمكن قياسها بشكل غير مباشر عن طريق كا 2 + التصوير. وهذا من شأنه التحقق من صحة تطبيق على نطاق واسع من الزخرفة مادة بيولوجية وطرق arraying ميكروفلويديك لإنشاء شبكات الخلايا العصبية الوظيفية.
هياكل تعلق الغضروف المفصلي لا، ومع ذلك، وتعزيز التشابك محوار (انظر الشكل 4C). النتيجة حافة هو سمة مشتركة بين محاور مثقف على الأسطح microstructured 22. لمنع مثل هذه التورط ومزيد تشجيع تشكيل اتصالات بين المقصورة وأعمدة-تعلق الغضروف المفصلي يمكن دمجها مع الجدار متناهية (أي لم تعد قائمة بذاتها). بالإضافة إلى ذلك، الامتدادفي قناة ميكروفلويديك المركزية يمكن مشوشه. للتجارب التي تتطلب اتصال الخطية، وقناة مركزية يمكن إزالتها (انظر التصاميم القناع في دينه وآخرون 12، معلومات تكميلية). هذه الدائرة يتطلب arraying التسلسلي للمقصورة الأولى، تليها فترة (على سبيل المثال، 4 ساعة) للالتصاق الخلية أو ما يسمى احكام بصمام الخلوية 14 لجعل الدائرة متساهلة للarraying الخلايا في المقصورة الثانية.
يوفر الدائرة ميكروفلويديك عمليات فلويديك مبرمجة مسبقا. ويتم تحديد وظائف مختلفة عن طريق اختيار ميناء لتحميل الكواشف أو واجهة مع أنابيب أو نصائح. هذا يتجنب الحاجة لمعقدة ومكلفة والفضاء تطالب ردود الفعل التي تسيطر عليها الأجهزة لجعل هذه التقنية للوصول للغاية للبيولوجيا عصبية. تصميم الدوائر اعتمادا كبيرا على الأبعاد النسبية المثلى لتحقيق ميكروفلويديك arraying 12-14. التغييرات الصغيرة يمكن منع CIRCUIT من أداء وظيفته، وبالتالي فإننا أوصت تبنته الأولية للبروتوكولات للاستفادة من التصاميم المتوفرة بحرية 12. مع دائرة الأمثل، arraying ميكروفلويديك عصبون واحد سريع، مع ~ 100 المحتشدة الخلايا العصبية في كل غرفة الثقافة في أقل من 1 دقيقة. على الرغم من عدد محدود من الخلايا العصبية، وكثافة المحلية لا يزال يعادل الثقافات القياسية لتوفير مستويات الإشارات كافية لدعم الحياة. كما هو موثق في الشكل 4B هذا النهج يعطي فعالية الخلايا العصبية في فخ 1 (1.14 ± 0.09) 12. ومع ذلك، يتم المحتشدة ليس كل الخلايا العصبية. الدائرة ميكروفلويديك يولد يبسط موازية، مثل أن الخلايا العصبية وصوله الى المناطق الخارجية من تدفق الصفحي تواصل قناة اعوج. مع ذلك النظام قدم هو 10-100 أضعاف أكثر اقتصادا مع خلايا من نظم مجزأة القائمة. خلايا طرد يمكن أن تحصد من الموانئ والأنابيب. في التصاميم المستقبلية، والتشريد الجانبي القطعية المنبع23 هياكل يمكن استخدامها لصرف جميع الخلايا في arraying يبسط للاقتصاد الخلوية المطلقة.
الشكل 4. ميكروفلويديك عصبون arraying. A) يستخدم الطموح دليل استخدام حقنة لطيف الخلايا العصبية arraying. يتم استخدام موصل أنابيب 4 في اتجاه واجهة الحقنة مع العلوي 3 منافذ لالخلايا العصبية في وقت واحد في كل من المقصورات arraying. B) متباينة تصطف الخلايا SH-SY5Y الإنسان مثل الخلايا العصبية والخلايا العصبية الأخرى بدقة وحيدة الخلية (الخلايا العصبية واحد في الفخ ). C) وبعد 5 أيام من الثقافة، وتمديد محوار ربط الثقافتين. هي ملطخة النوى مع دابي وكان يستخدم الأكتين المناعية لتصور الامتداد. الرقم تعديل وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC)
ومن السمات الرئيسية لأنظمة مجزأة هو القدرة على علاج انتقائي السكان الخلية الفردية للتحقيق في الاتجار المادية وطويلة المدى الإشارات. ومع ذلك، الأساليب المتاحة في الأدب هي إما غير كافية لعزل فلويديك أو موصوفة بشكل سيئ. طريقة العزل فلويديك ضعنا تمكن التسليم السريع (<1 دقيقة) اختبار المواد والعزلة فلويديك طويلة (> 1 ساعة) 12. يتم توثيق النتائج في الشكل 5. يرصد هذه القدرة ممكنا بفضل مزيج من تصميم الدوائر وباستخدام الطموح لتقديم مادة الاختبار. هذا هو على النقيض من حقن السائل باستخدام إما ضخ حقنة من قبل تغذية الهيدروستاتيكي. على الرغم من المقاومة فلويديك عالية من القنوات ثمرة neurite، هذه الطرق إنتاج مسارات الحراري رقبعة تفريق بسرعة المواد اختبار وتلوث الجهاز بأكمله. تطلع من ميناء العلوي يتفاعل أيضا مع السوائل في جميع أنحاء الدائرة (سمة أساسية للمقاومة التفاضلية arraying المبدأ). ومع ذلك، في هذا النمط من العمليات، يتم رسمها الاعلام من اماكن اخرى في الدائرة لتخفيف مادة الاختبار بدلا من تشتيت ذلك. نظرا للمقاومة الشديدة فلويديك (النسبية) من القنوات ثمرة neurite، ومستوى التخفيف غير ذات أهمية. للتجارب تنطوي على إنشاء التدرجات نشرها، طريقة تطلع يمكن استخدامها لعلاج انتقائي حجرة واحدة، مع وقف تدفق تستخدم لبدء تطور تعتمد على الوقت من التدرج الكيميائية.
الرقم 5. العلاجات فلويديك اختياري. أ) شفط يحركها العلاجات انتقائية رانه المركزية وB) المرافقة المقصورات. السهم يشير إلى منفذ واحد يستخدم لطموح. أنشئت في العلاجات 1 دقيقة (الخطوط الحمراء)، وكان يحتفظ به لمدة التجربة؛ 60 دقيقة (الخطوط الزرقاء). الرقم تعديل وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) 12. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية arraying ميكروفلويديك هو الأول من نوعه الذي يتيح دقة التعامل مع الخلايا العصبية واحد لإنشاء الثقافات في أضيق الحدود. إلى جانب الوضع الطبيعي أسلوب الزخرفة مادة بيولوجية في، نهج قوية لمواءمة أنماط الخلية مع هياكل ميكروفلويديك، هذه الثقافات في أضيق الحدود لديهم مستويات عالية intercompartment الاتصال مع انخفاض التورط المحلية. هذه الميزات يمكن استخدامها لدراسة كفاءة انتقال بين المقصورة، ومع تعديلات بسيطة التصميم لديها القدرة على عزل المحاور الفردية عن التصور والتحليل الكمي. على سبيل المثال، في الجيل القادم تصاميم يمكن استبدال الهياكل ترايدنت مع قناة ثمرة واحدة في الخلايا العصبية لتقليل احتمال محاور متعددة تشكيل حزم. يمكن لهذه القدرات تستفيد كثيرا مجموعة متنوعة من التطبيقات علم الأعصاب، بما في ذلك؛ سمية الجسيمات النانوية 24 و 25 نشر المنغنيز، والنشاط SYNchronization في الصرع، ونشر العوامل المعدية مثل البريونات 26، اميلويد بيتا (أب) في انتقال مرض الزهايمر مرض 9، وsynuclein ألفا في باركنسون مرض 27.
فائدة واضحة أخرى للأسلوب arraying ميكروفلويديك هو القدرة على إجراء البحوث مع انخفاض فرة الخلايا العصبية السكان الفرعية بدلا من الثقافات غير المتجانسة المعقدة. على سبيل المثال، الخلايا العصبية الدوبامين المادة السوداء مناسبة لأغراض البحث أو الخلايا العصبية الطرفية باركنسون التي لا يمكن إلا أن تكون معزولة في أعداد صغيرة ما زالت كافية للدراسات تكرار باستخدام منصة ميكروفلويديك. وتشمل الأمثلة النادرة تطبيق الخلايا الأخرى التحقيق في أساس فقدان السمع باستخدام الترتيب التجريبي لخلايا الشعر شارك في تربيتها مع الخلايا العصبية العقد لولبية، أو الدراسات التي تستخدم الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من البشر. وبالمثل، فإن متطلبات الخلية منخفضة من النظام جعلهممكن بسهولة لإجراء التجارب مع الخلايا العصبية من الدماغ مصغرة Drosophilia البطن 28 وبالتالي الاستفادة من منافع هذا النموذج الجيني قوية.
وجهة نظر أخرى هي البراغماتية الاقتصاد الخلوية والبصمة جهاز صغير يجعل البحث إنتاجية عالية يمكن التحكم فيها. كل شرط وتكرار يتطلب الحد الأدنى من الخلايا العصبية، وهي الميزة التي يمكن استخدامها للحد بشكل كبير أعداد الحيوانات بما يتماشى مع مبادرة 3RS مستمرة. على سبيل المثال، تحليل الاستجابة للجرعة من لوحة كبيرة من المركبات يمكن القيام بها باستخدام حيوان واحد. وتشمل أنواع شاشة اختبار السمية والتحقيق في المكتبات من سيرنا أو وكلاء الدوائية من حيث تأثيرها على الاتجار بعيدة المدى ونقل الإشارة. وباختصار، فإن البروتوكولات وصفها توسيع نطاق التجريبية للأعصاب، وتقدم إمكانات لتقديم إنتاجية عالية، الكمية والإحصائيةبيانات قوية مع حليف قرار واحد والتحت خلوية. وهذا والعديد من التطورات الكبيرة الأخرى في مجال علم الأعصاب تؤدي إلى رؤى جديدة في آليات التنمية العصبية الكامنة وظيفة، فضلا عن العمليات المرضية المسببة للأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لأولريش Marggraf (ISAS) لSU-8 تلفيق وماريا بيكر (ISAS) لSEM التصوير. وأيد هذا البحث من الناحية المالية من قبل دويتشه FÜR للبحوث (DFG WE3737/3-1)، وهي منحة Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF 0101-31P6541) وقبل Ministerium FÜR الابتكار، Wissenschaft اوند Forschung قصر اندز نوردراين فيستفالن. هايكه Hardelauf بفضل المدرسة الدولية لايبنتز العليا "بيولوجيا الأنظمة المختبر على واحد في رقاقة" للحصول على الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm biopsy punches | Kai Medical | Handle with care - extremely sharp | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way tubing connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polylysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Polyornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted fluorescent microscope | |||
| Example aspiration pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand held corona discharge device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto plasma oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum dessicator or centrifuge |
References
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
