Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Abstract

Microfluïdische uitvoeringen van de Campenot kamer hebben veel belangstelling trok van de neurowetenschappen. Deze onderling co-kweek platforms kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid aan vragen te onderzoeken, verspreid ontwikkelings-en functionele neurobiologie infecties en ziekten propagatie. Echter, conventionele systemen zijn aanzienlijke cellulaire ingangen (duizenden per compartiment), matig voor het bestuderen lage abundantie cellen, zoals primaire dopaminerge substantia nigra, spiraal ganglia en neuronen Drosophilia melanogaster en onpraktisch voor hoge doorvoer experimenteren. De dichte culturen zijn ook zeer lokaal verstrengeld, met weinig uitwassen (<10%) onderling verbinden van de twee culturen. In deze paper eenvoudige microfluïdische en patroonvorming protocollen beschreven die deze uitdagingen aan: (i) een microfluïdisch enkel neuron arraying methode, en (ii) een water-masking methode voor plasma patroonvorming biomateriaal coatings te register de neuronen en bevorderen uitgroei tussen de compartimenten. Minimalistische neuronale co-cultures werden bereid met hoog niveau (> 85%) intercompartment connectiviteit en kan worden gebruikt voor high throughput neurobiologie experimenten met enkele cel precisie.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuronaal weefsel is zeer complex; een heterogeen cellulaire mengsel dat ruimtelijk wordt besteld binnen bepaalde lagen en compartimenten en met plastic connectiviteit via de mobiele contacten en vooral via axon en dendriet uitwassen. Nieuwe technieken zijn nodig om meer experimentele vrijheid om diepere inzichten en mechanismen ontrafelen centraal in de ziekte, ontwikkeling en gezonde functie krijgen verlenen. De Campenot kamer 1,2 en meer recent microfabricated 3,4 uitvoeringsvormen kunnen worden gebruikt voor de ex vivo bereiding van neuronale netwerk co-kweken met de mogelijkheid om selectief verstoren de verschillende somatische populaties alsook hun neurieten uitwassen. Deze microfluïdische inrichtingen zijn bijvoorbeeld gebruikt om axon degeneratie en regeneratie studie volgende chemische 5,6 of laser axotomy 6-8, tauopathie 9, virale verspreiding 10,11 en mRNA lokalisatie in axonen 4.

ent ">

Om het bereik van de neurobiologen breiden, zijn technologische ontwikkelingen nodig om minimalistische neuronale co-culturen te bereiden. Dit maakt ontvlechting van het neuronale netwerk voor het onderzoek naar het systeem met enkele cel en sub-cellulaire precisie. De vereiste minimale aantal cellen mogelijkheden voor de zeldzame celtypen, inclusief dopaminerge substantia nigra cellen ziekte van Parkinson, spiraal ganglia van het oor, perifere neuronen relevante analyseren en stamcellen. Afgezien van deze, cellulaire economie is aan het 3V-initiatief betrokken. Met behulp van deze microfluïdische platforms, grootschalige toxiciteit schermen of andere high throughput, kan data rijke experimentele serie waarbij dierlijke neuronen nu worden beschouwd.

In deze protocollen voor de vervaardiging en het gebruik van een microfluïdische inrichting worden beschreven. Microfluïdische arraying in combinatie met een in situ biomaterial patroonvorming methode kan worden gebruikt voor de registratie van sterk gekoppelde neuronale co-cultuur met minimale mobiele nummers. Microfluïdische arraying is gebaseerd op een differentiële stroom benadering 12-15, waarbij de microgestructureerde vallen worden geplaatst binnen een fluïdumkringloop (geïllustreerd met SEM-afbeeldingen in Figuur 1). Het pad 0 → 1 heeft de onderste vloeibare weerstand (R2> R1) voor het transporteren neuronen een lineaire reeks microgestructureerde openingen - de inlaten naar de neuriet uitgroei kanalen. Bezetting van de trap door een cel belemmert plaatselijk de stroom naar de stroomlijnen leiden voor het vangen latere cellen in naburige vallen. Volledige bezetting van de vallen in de array schakelt de vloeibare ratio (R 1> R 2) aan de stroomlijnen te leiden in de kronkelend pad (0 → 2) om een bypass modus operandi te produceren voor het verwijderen van overtollig neuronen.


Figuur 1. Microfluidic Circuit. A) De differentiële weerstand fluïdumkringloop voor enkel neuron arraying, met begeleidende cultuur kamers verbonden door neurietuitgroei kanalen. B, C) ​​SEM beelden van de dubbellaag verzuilde neuron co-cultuur array met meniscus pinning micropillars. Met dit ontwerp, werden drietand-vormige neuron trapping structuren gebruikt om fasciculatie van de neuriet uitwassen te promoten. Figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klik hier voor grotere afbeelding.

De voorbereiding van micropatterned neuronale netwerken op vlakke ondergronden kan gemakkelijk worden bereikt (voor exampl es uit onze groep, zie Frimat et al.. 16 en Heike et al.. 17). Echter, het inkapselen van bioactief materiaal patronen in PDMS-apparaten en met de eis van micrometer-schaal afstemming van deze aan de microfluïdische kanalen vormt een grote technische uitdaging. In paragraaf 3.1 een protocol voor de in-chip, of in situ, de voorbereiding van biomateriaal patronen wordt gepresenteerd. Deze patronen stellen neuron registratie bij langdurige cultuur termijnen en uitwassen tussen compartimenten te promoten. Meniscus-pinning microstructuren worden gebruikt om een ​​zogenaamde water masker af te stemmen op de neuron arraying sites en neurietuitgroei kanalen. Het water masker beschermt adhesiemolecule coatings tijdens plasma behandeling, terwijl blootgestelde oppervlakken worden gedesintegreerd het biomateriaal patroon definiëren. Daarnaast zijn protocollen voorzien celcultuur en vloeibare isolatie voor de selectieve behandeling van de verschillende co-cultuur compartimenten.

ve_content "> De protocollen zijn ontworpen om de gebruiker ingestelde principes van zachte lithografie hefboomwerking voor de replicatie van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) microfluïdische inrichtingen 18. Ook in situ biomateriaal patroon is eenvoudig, verdamping en oppervlaktespanning verschijnselen exploiteren, en slechts waarbij een goedkope draagbare plasmabron. Het microfluïdische circuit effectief programma cel laden en compartimentspecifieke behandelingen die deze bewerkingen Op deze wijze is het de bedoeling een kwestie van doseren materialen in de juiste onderste poort en opzuigen van boven. de neurobiologists geven de vrijheid voor te bereiden en te gebruiken microfluïdische apparaten in hun eigen laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De protocollen zijn bedoeld voor neurologen, en zijn in figuur 2. Als zodanig is het aanbevolen dat microfabricage van de SU-8 masters voor PDMS replicatie uitbesteed aan commerciële en institutionele voorzieningen. De twee lagen masker ontwerpen zijn vrij beschikbaar als aanvullende informatie (ZIP) op de Royal Society of Chemistry website 12. Belangrijk is, moet de eerste SU-8 lagen worden vervaardigd tot een diepte van 2,5-3,0 urn, en de tweede tot een diepte van 25-30 urn. Dit zijn belangrijke dimensies noodzakelijk voor een effectieve neuron arraying. De 3 micron hoogtebegrenzing moet ook voorkomen neuronen vervoer of migreren tussen de twee compartimenten 12.

1. Microfluïdische apparaat replicatie in PDMS

  1. Meng de PDMS voorpolymeer grondig met het hardingsmiddel (184) in een verhouding van 10:01 en ontgas het mengsel in een vacuüm exsiccator gedurende normaliter 20 minuten. Als alternatief, zet de mixtuur in een 50 ml Falcon buis en gebruiken lage g gecentrifugeerd voor het ontgassen.
  2. Plaats de 2-laags microstructured SU-8 wafer op een 80 ° C kookplaat en lijn polymeer frames aan elk apparaat op de wafer. Giet PDMS in de frames tot een diepte van ≥ 5 mm en laat> 1 uur tot volledige thermische uitharding garanderen.
  3. Eenmaal uitgehard, verwijdert u de wafel van de kookplaat en laat afkoelen op een vlakke ondergrond.
  4. Draag een veiligheidsbril en werk van de ene hoek (weg van de SU-8 microstructuren) met een stijve scalpel duwt het frame en PDMS van de wafer.
  5. Verwijder de PDMS mal van het frame en gebruik een schaar om het apparaat van overtollige PDMS trim. Deze zogenaamde knipperen vaak geproduceerd wanneer een dunne PDMS verspreidt tussen het polymeer frame en het wafeloppervlak.
  6. Resterende PDMS kan worden toegepast op de gehele wafer en uitgehard om de wafel te beschermen tijdens opslag. Verwijder deze vóór verder apparaat gieten, en daarmee verwijder particuleren verontreinigingen van het oppervlak.

2. Apparaat Montage en Interconnectie

  1. Bereid de 6-interface poorten met een diameter van 3 mm biopsie punch. Werken op een donker oppervlak, in goede lichtomstandigheden en met de microstructured functies naar boven om de uitlijning van de havens te helpen met de microfluïdische kanalen.
  2. Inspecteer het apparaat voor deeltjes. Verwijder deze met omkeerbare plakband.
  3. De microfluïdische schakeling is ingekapseld met een dunne PDMS-laag aangebracht op een glazen dekglaasje: Deze worden bereid door het gieten van een klein volume (~ 0,5 ml) van de PDMS-hardingsmiddel-mengsel (10:01, 601) op de basis van een flexibele, bacteriologische kwaliteit petrischaal. Druk voorzichtig een dekglaasje op de PDMS laag, plaats op de kookplaat en thermisch remedie voor een paar minuten. Snel na afkoeling, gebruik een scalpel het dekglaasje-PDMS dubbellaag van de petrischaal uit te snijden en prijs. Knip met een schaar indien nodig.
  4. Plasma bond de PDMS apparaaten ondersteuning laag om een ​​goede afdichting te produceren: Optimale condities zijn instrument specifiek. Bijvoorbeeld, een plasma-oven werkt bij 70 W en 40 kHz op 0,2 mbar zuurstofatmosfeer gedurende 40 seconden produceert een uitstekende PDMS PDMS-binding. Zodra plasma behandeld, druk beide delen aan elkaar en laat een minuut volledig obligatie.
  5. Gebruik siliconen slang (1,6 mm ID; 3,2 mm OD) om te communiceren met pompen en spuiten.

3. Biomateriaal Patterning en Microfluidic Operations

De protocollen voor in situ biomateriaal patroon, neuron cultuur en vloeibare behandelingen zijn geïllustreerd in figuur 2.

Figuur 2
Figuur 2. Illustrated microfluïdische protocollen. A) PL en PLL-g-PEG patronen; toevoeging van de cel hechtlaag (bv.PL, groen), met verdamping produceren van de lijn water masker B) Atmosferische plasma behandeling van de blootgestelde PL.; twee antenne worden gebruikt, met het plasma introductie antenne geïllustreerd met een roze ster. C) PBS (blauw) het wassen door aspiratie wordt gebruikt om te voorkomen dat besmetting van de plasma-behandelde gebied met PL. D) Levering van PLL-g-PEG (rood ) door aspiratie om de vacht van de plasma-behandelde gebieden E) Mobiele laden.; gelijktijdige microfluïdische arraying van neuronen zowel flankerende compartimenten door aspiratie, F) media (roze) perfusie met een hydrostatische aangedreven stroming G) Geïsoleerde fluidisch behandelingen.; perifere behandeling van een test-agent (zwart) geleverd vanaf de bodem flankerende inlaat door aspiratie en H) centrale behandeling verlost van de onderste centrale inlaat door aspiratie. Figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Klik hier voor grotere afbeelding.

Onmiddellijk na plasma hechten van de PDMS microfluïdische kanalen zijn zeer hydrofiel (contacthoek ≤ 5 °). Dergelijke oppervlakken zijn geschikt voor de hechting en cultuur van cellijnen zoals gedifferentieerde menselijke SH-SY5Y neuron-achtige cellen. Voor de ex vivo cultuur van primaire neuronen en cultuur van neuronale precursor cellijnen zoals de humane Lund mesencefale cellijn (LUHMES) een polyamine coating, hetzij polylysine (PL) of polyornithine (PO), dient als een elektrostatisch anker. Bovendien adhesie-eiwitten zoals laminine en fibronectine zijn vaak nodig als integrine interfacing coating. Echter, de PL en PO coatings binden gemakkelijk neuronen, belemmeren de microfluïdische levering aan de array sites en ook het opleggen van ongewenste schuifspanningen. Om dit probleem op te lossen in-chip biomateriaalpatroonvorming is nodig om de hechting materialen lokaliseren bij de val sites en de uitgroei microkanalen. Dit bevordert ook de ontwikkeling van inter-compartiment verbindingen en vermindert plaatselijke verstrengeling. Het protocol omvat ook de toevoeging van PEG materialen om aangrenzende gebieden om ervoor te zorgen eiwitten en neuronen worden beperkt tot de gewenste locaties tijdens langdurige cultuur. Het volgende protocol is beschreven in Figuur 3:

Figuur 3
Figuur 3. Water maskeren voor biomateriaal patroonvorming door plasma sjabloneren. A) Illustratie van het water maskeerproces met het PDMS micropillars pinning het water meniscus in de plaats voor plasma sjabloneren. De kromming van de meniscus in het verticale vlak verwaarloosd. B) Water masker gevisualiseerd met een rode kleurstof en gepositioneerd door meniscus pinning. C) Het patroon PL-FITC coating afgebeeld na plasma sjabloneren. D) Toevoeging van eiwitten te verwerpen en cel afstotend PLL-g-PEG-TRITC een plasma patroon PL-FITC coating. Dit werd gebruikt voor de registratie van SH-SY5Y cellen en ook voor patroonvorming tegen fibronectine laag voor LUHMES cellen. Figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klik hier voor grotere afbeelding.

  1. Water Masking voor in situ Biomateriaal Patterning door Plasma Stenciling
    1. Kort na plasma hechting pipet 0,5 ul volume PL of PO (100 ug / ml in 1x PBS) in het midden onderaan poort. Binnen enkele seconden de hele microfluïdische circuit wordt gevuld door capillaire werking. Laat enkele minuten volledig vacht van de hydrofiele PDMS oppervlakken met polyamidemijnen.
    2. Verwijder ongebonden polyamine moleculen door-aspiratie gedreven wassen met 1x PBS (zie figuur 2C) gedurende 1 minuut.
    3. Verwijder alle PBS uit de havens en verwarm het apparaat door belichting met een microscoop. Dit verhoogt de verdamping van de poorten voor een snelle water masker vorming. Het water masker (getoond in figuur 3A en gedocumenteerd in figuur 3B) wordt op ~ 5 minuten vastgesteld.
    4. Inspecteer het apparaat met behulp van microscopie om ervoor te zorgen het water masking is voltooid. Let reservoir structuren stroomopwaarts van de array site zijn in het masker ontwerp om de stabiliteit van de water masker (~ 15 min.) verlengen.
    5. Plaats roestvrijstalen pinnen in de poorten (figuur 2B). Deze worden gebruikt voor het koppelen van het plasma opgewekt door een atmosferische druk in de hand gehouden corona-ontlading of Tesla generator (bijvoorbeeld, die op 2 MHz, 30 kV signaal) 19,20 in de vacante microfluïdische kanalen. Richt de punt van thij plasma bron dicht bij de punt van een pen en plasma behandeling van de microchannel voor ≤ 1 sec. Gebruik weinig licht om de plasma patronen observeren.
    6. Verwijder het water masker met een wasstap. Gebruik parallel aspiratie van de bovenste 3 poorten. Gebruik 4 gelijke stukken siliconenslangen verbonden door een 4-weg adapter om een ​​streven pomp parallel aspiratie bereiken. Start aspiratie en afzien PBS in de bodem 3 poorten aan PBS trekken door de microfluïdische circuit. Op deze wijze wordt een PDMS-polyamine materiaal contrast wordt geproduceerd (zie Figuur 3C). Evacueren PBS uit de microfluïdische circuit en laat gedurende enkele uren aan de inheemse, hydrofobe staat te herstellen. Dit maakt de PDMS volledig niet-permissief celadhesie.
    7. Indien extra hechting materialen, zoals laminine en fibronectine, vereist de volgende stappen nodig en onmiddellijk na het verwijderen van het water masker vereist: Pipetteer 10 ul volume van de ent-polymeer poly-L- Lysine-poly (ethyleenglycol) (PLL-g PEG 100 ug / ml in PBS) in beide onderste flankerende kanalen, gevolgd door afzuiging van de bovenste flankerende kanalen voor 2 minuten.
    8. Zonder onderbreking van de stroom, verwijder overtollig PLL-g-PEG door uitwisseling met een PBS-buffer. Dit selectief bedekt de niet-polyamine gecoate gebieden met de PEG-groep optreden om eiwitadsorptie en celadhesie 17,21 voorkomen.
    9. Adhesie eiwitten zoals laminine en fibronectine kan dan samen gelokaliseerd met het polyamine coating: Pipetteer 10 ul volumes van deze ECM eiwitten (typisch 10 ug / ml) in alle drie bodem poorten. Zuig de top drie poorten tot het apparaat is gevuld met de eiwitoplossing en incubeer gedurende 1 uur tot een goede kwaliteit deklaag te produceren.
    10. Verwijder het teveel aan eiwitten door opzuigen PBS van de bodem 3 poorten.
  2. Microfluidic Single Neuron arraying
    1. Prime de apparaten met appropriaten media. Voeg 20 ul volumes naar de bodem 3 havens en door parallelle aspiratie van de bovenste drie havens snel vullen de microfluïdische circuit met media. Gebruik een 4-weg buiskoppelstuk het koppelen van de 3 bovenste poorten via gelijke lengte siliconen slang aan een aspiratie pomp.
    2. Voeg 20 ul van een opgesplitste celsuspensie (1 x 10 6 cellen / ml) aan elk van de flankerende inlaatpoorten (0, in figuur 1).
    3. Voorzie een aspiratie pomp met een debietregelaar of gebruik een spuit voor behoedzame aspiratie van de bovenste 3 poorten. Compleet neuron arraying vereist meestal 1 min.
    4. Oogst teveel neuronen die nog in de 4 flankerende poorten met een pipet voor arraying in de daaropvolgende microfluïdische apparaten.
    5. Verwijder de slang. Vul alle poorten met media en plaats het apparaat in de incubator. Binnen een paar uur worden de cellen volledig hechtende op het biomateriaal patroon.
  3. Neuron Cultuur, Selectieve Fluidic Behandeling en Immunostaining
    1. Wisselen de media door middel van periodieke perfusie met behulp van hydrostatische voeding (een 2 mm kolom hoogte verschil is adequaat langzaam).
    2. Als alternatief, dompel de microfluïdische apparaat in de media, het uitwisselen van de media periodiek (2-3 dagen) als met standaard celculturen.
    3. Selectieve vloeibare behandelingen om ofwel neuron cultuur compartiment of de centrale neurietuitgroei compartiment worden als volgt bereikt: Verdeel 20 ul van de teststof in de bodem haven van het kanaal van belang, en zuig van de haven direct boven. Voor langdurige behandelingen verminderen het debiet met behulp van een debietregelaar en vervult de teststof zoals vereist.
    4. Immunokleuring protocollen verschillen per moleculair doel en bijbehorende reagentia. Om het potentiële risico van afschuiving geïnduceerde schade aan de neuronen een trage stroomsnelheid werd gebruikt tegen. Dit resulteert in een verhoogde invaltijden om het systeem volledig doortrekken, normale protocol keer verlengd. Hydrostatic perfusie met poorten met verschillende kolomhoogten (bijvoorbeeld 2 mm) werd gebruikt voor reagentia leveren. Snellere reagens en verwijdering met een pomp kan worden gebruikt voor experimentele tijdschema verminderen. Sluit een aspiratie pomp naar de bovenste 3 poorten aan reagentia te trekken uit de bodem 3 poorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Water maskeren exploits oppervlaktespanning. De druk tolerantie voor lucht-vloeistof grensvlak schalen tegengesteld aan de kromtestraal [ , Het produceren van zeer stabiele interfaces op microfluïdische dimensies. De micropillars effectief verankeren het water masker op zijn plaats. Water masker vorming wordt door verdamping uit de microfluïdische havens, de steeg door verhitting. Met behulp van de warmte van een lage vergroting (4X - 10X) microscopie verlichting, werd het water masker meestal oprichting in ≤ 5 minuten. Verdamping leidt ook tot de uiteindelijke ineenstorting van het water masker. Om de levensduur van het water masker te verhogen tot ~ 15 min (praktisch voor plasma sjabloneren), 18 nl reservoir structuren zijn stroomopwaarts van de cultuur compartimenten. De snelheid van water masker vorming en instorting kan variëren, en intermitterende observatie wordt aanbevolen om een ​​geschikte periode voor plasma t identificerenEHANDELING. Toch kunnen meerdere apparaten gelijktijdig worden voorbereid.

Plasma sjabloneren vereist ~ 1 sec. Het gebruik van langdurige behandelingen verdampt het water masker, waardoor overmatige plasma desintegratie van het polyamine coating. Bij gelegenheid onvoldoende plasma behandeling resultaten, waardoor intact polyamine coatings op de aangrenzende microchannel wand (zie figuur 3D) die kunnen neuron hechting 12 ondersteunen. Toch gekleed muis corticale neuronen had een patroonvorming rendement van 89,5% 12 volgende cultuur voor 6 dagen. Dit rendement is gelijk aan PL / PEG patronen op vlakke substraten. Biomateriaal patroonvorming heeft de verdere verdienste van het bevorderen van uitwassen in de neuriet microkanalen. Met uitgebreid biomateriaal patronen uitwassen in ~ 90% van de microkanalen, terwijl een continue polyamine coating uitgroei werden verlaagd tot ~ 70%. Met behulp van corticale neuronen, werd 7 dagen van in-chip cultuur die nodig is voor het ontgroeienths beide compartimenten (een afstand van 500 urn) omvatten. Gedifferentieerde menselijke SH-SY5Y neuronen hadden hogere uitgroei tarieven, het leggen van verbanden in 4-6 dagen. Corticale, LUHMES en SH-SY5Y neuronen werden gekweekt tot 2 weken. Dit is voldoende lang voor spontane elektrofysiologische functie die moet worden bereikt en kan indirect worden gemeten door Ca 2 + imaging. Dit zou de wijdverbreide toepassing van het biomateriaal patronen en microfluïdische arraying methoden voor het vaststellen van functionele neuronale netwerken te bestuderen.

De meniscus pinning structuren Wel bevorderen neuriet verstrengeling (zie Figuur 4C). Edge bevinding is een gemeenschappelijk kenmerk van axonen gekweekt op microgestructureerde oppervlakken 22. Om dergelijke verstrengeling te voorkomen en verdere bevordering van de vorming van inter-compartiment verbindingen, kan-meniscus pinning pijlers worden samengevoegd met de microchannel wand (dwz niet langer vrijstaand). Bovendien uitwassenin het centrale microfluïdische kanaal kan worden ontregeld. Voor experimenten waarbij lineaire connectiviteit, kan het centrale kanaal worden verwijderd (zie het masker ontwerpen in Dinh et al.. 12, aanvullende informatie). Dit circuit vereist seriële arraying van het eerste compartiment, gevolgd door een periode (bijvoorbeeld 4 uur) voor celadhesie of zogenaamde cellulaire kleppen 14 naar de schakeling voor permissieve rangschikken van cellen in het tweede compartiment te maken.

De microfluïdische circuit biedt voorgeprogrammeerde vloeibare operaties. De verschillende functies worden bepaald door de keuze van poort reagentia of interface vullen met slangen of tips. Dit voorkomt de noodzaak voor complexe, kostbare en ruimte veeleisende-feedback gecontroleerde instrumentatie om de techniek zeer toegankelijk voor de neurobiologen maken. Circuit ontwerp is sterk afhankelijk van een optimale relatieve afmetingen voor het bereiken van microfluïdische arraying 12-14. Kleine veranderingen kunnen de cir voorkomencuit meer functioneert, en we daarom aanbevolen initiële adopters van de protocollen om gebruik te maken van de vrij beschikbare ontwerpen 12. Met een optimale circuit, microfluïdische enkel neuron arraying is snel, met ~ 100 neuronen gekleed in elke cultuur kamer in minder dan 1 minuut. Ondanks het beperkt aantal neuronen, de lokale dichtheid is nog steeds gelijk aan standaard culturen om voldoende life-support signalering niveaus bieden. Zoals gedocumenteerd in figuur 4B deze aanpak effectief levert 1 neuron per val (1,14 ± 0,09) 12. Toch zijn niet alle neuronen gekleed. De microfluïdische circuit genereert parallel stroomlijnen, zodanig dat de neuronen die aankomen in de buitenste regionen van de laminaire stroming blijven de slangachtige kanaal. Toch is de gepresenteerde systeem is 10-100 maal zuiniger met cellen dan de bestaande verzuilde systemen. Verdreven cellen kunnen worden geoogst uit de havens en slangen. In de toekomst ontwerpen, stroomopwaarts deterministische laterale verplaatsingstructuren 23 kan worden gebruikt om alle cellen te buigen in de reeksoplossing stroomlijnt absolute cellulaire economie.

Figuur 4
Figuur 4. Microfluidic neuron arraying. A) Manual aspiratie met behulp van een spuit wordt gebruikt voor zachte neuron arraying. Een 4-weg slang connector wordt gebruikt om de spuit met de bovenste 3 poorten voor het gelijktijdig neuron arraying in beide compartimenten communiceren. B) Gedifferentieerde neuron-als menselijke SH-SY5Y cellen en andere neuronen worden getooid met enkele cel precisie (een neuron per val ). C) Na 5 dagen van cultuur, neuriet extensies onderlinge verbinding van de twee culturen. Kernen zijn gekleurd met DAPI en actine immunokleuring werd gebruikt om het uitwassen visualiseren. Gemodificeerde figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry (RSC) Klik hier voor grotere afbeelding.

Een belangrijk kenmerk van verzuilde systemen is de mogelijkheid om individuele celpopulaties selectief trakteren op materiaal mensenhandel en lange afstand signalering onderzoeken. Echter, methoden die in de literatuur zijn ofwel ontoereikend voor vloeibare isolatie of slecht beschreven. De vloeibare isolatie methode die we hebben ontwikkeld, kan de snelle levering (<1 min) van teststoffen en langdurig vloeibare isolatie (> 1 uur) 12. De resultaten worden beschreven in Figuur 5. Dit vermogen wordt mogelijk gemaakt door de combinatie van het circuit ontwerp en door afzuiging aan de teststof leveren. Dit in tegenstelling tot vloeistofinjectie behulp van een injectiespuit pomp met hydrostatische voer. Ondanks de hoge vloeibare weerstand van de neurietuitgroei kanalen, deze methoden produceren convectie paden thoed snel verspreiden testen stoffen en vervuilen het gehele apparaat. Aspiratie van de bovenste poort werkt ook met vloeistof in de hele schakeling (een functie centraal in de differentiële weerstand arraying principe). In deze modus, media getrokken van elders in het circuit aan de teststof in plaats van te dispergeren verdunnen. Gelet op de zeer vloeibare weerstand (relatief) van de neuriet uitgroei kanalen, de mate van verdunning onbeduidend. Voor experimenten hetgeen de invoering van diffusie gradiënten, kan de aspiratie methode worden gebruikt om selectief te behandelen een compartiment, met stroom stopzetting gebruikt om de tijdsafhankelijke evolutie van de chemische gradiënt te initiëren.

Figuur 5
Figuur 5. Selectieve vloeibare behandelingen. A) Aspiration-driven selectieve behandelingen van thij centraal en B) flankerende compartimenten. De pijl geeft de enkele poort gebruikt voor aspiratie. Behandelingen werden 1 min (rode lijnen) vastgesteld en werden gedurende de duur van het experiment; 60 min (blauwe lijnen). Gemodificeerde figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De microfluïdische arraying techniek is de eerste in zijn soort die precisie enkel neuron handling maakt voor het vaststellen van minimalistische culturen. In combinatie met de in situ biomateriaal patroonvorming methode, een krachtige aanpak van de cel patronen af te stemmen op microfluïdische structuren, deze minimalistische culturen hebben hoge intercompartment connectiviteit niveaus met beperkte lokale verstrengeling. Deze functies kunnen worden gebruikt voor de efficiënte onderzoek tussen compartimenten transmissie en met eenvoudige wijzigingen hebben het potentieel om individuele axonen isoleren visualisatie en kwantitatieve analyse. Bijvoorbeeld, in de volgende generatie ontwerpen de drietand structuren kunnen worden vervangen door een uitgroei kanaal per neuron om de waarschijnlijkheid van meerdere axonen vormen bundels verminderen. Deze mogelijkheden kunnen veel baat hebben een verscheidenheid van de neurowetenschappen toepassingen, waaronder; toxiciteit nanodeeltjes 24 en mangaan propagatie 25, activiteit synchronisatie bij epilepsie, de verspreiding van infectieuze agentia zoals prionen 26, amyloid beta (Ab) transmissie in Alzheimer ziekte 9, en alfa-synucleïne in de ziekte van Parkinson 27.

Een ander duidelijk voordeel van de microfluïdische reeksoplossing methode is de mogelijkheid om onderzoek te doen met een lage overvloed neuron subpopulaties in plaats van complexe heterogene culturen. Bijvoorbeeld, dopaminerge substantia nigra neuronen voor het onderzoek van Parkinson en perifere neuronen die alleen kan worden geïsoleerd in kleine aantallen nog voldoende voor repliceren studies op de microfluïdische platform. Andere zeldzame celtoepassing voorbeelden zijn het onderzoek naar de basis van gehoorverlies met behulp van een experimentele opstelling van haarcellen samen gekweekt met spiraalvormige ganglia neuronen, of studies met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen van de mens. Ook de lage cel eisen van het systeem maakt hetgoed mogelijk om experimenten uit te voeren met de neuronen van de miniatuur Drosophilia melanogaster hersenen 28 en dus profiteren van de voordelen van deze krachtige genetische model.

Het andere perspectief is het pragmatisme van cellulaire economie en de kleine apparaat voetafdruk die high throughput onderzoek beheersbaar maakt. Elke voorwaarde en repliceren vereist minimale neuronen, een functie die kan worden gebruikt om het aantal dieren enorm verminderen in lijn met de aan de gang 3 V's initiatief. Zo kunnen dosis-respons analyse van een groot panel van verbindingen worden uitgevoerd met een enkel dier. Soorten van het scherm onder de toxiciteit testen en het onderzoek van de bibliotheken van siRNA of farmacologische agenten voor hun effect op lange afstand handel en signaaltransductie. Samengevat, de beschreven protocollen verlengen de experimentele bereik van de neuroloog, biedt de mogelijkheid om hoge doorvoer, kwantitatieve en statistische leverenbondgenoot krachtige data met enkele en subcellulaire resolutie. Deze en de vele andere grote ontwikkelingen op het gebied van de neurowetenschappen zal leiden tot nieuwe inzichten in de mechanismen onderliggende neuronale ontwikkeling en functie, alsook pathologische processen die ziekte veroorzaken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar Ulrich Marggraf (ISA's) bij SU-8 fabricage en Maria Becker (ISA) voor SEM beeldvorming. Het onderzoek werd financieel ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), een Bundesministerium für Bildung und Forschung subsidie ​​(BMBF 0101-31P6541) en door het Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf dankzij de Internationale Leibniz Graduate School "Systems Biology Lab-on-a-Chip" voor financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter