Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

सिंगल सेल प्रेसिजन साथ Neuronal सह संस्कृति की तैयारी

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

एक न्यूरॉन microfluidic arraying और biomaterial कोटिंग्स में चिप प्लाज्मा patterning के लिए पानी मास्किंग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. अत्यधिक परस्पर सह संस्कृतियों न्यूनतम सेल आदानों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.

Abstract

Campenot चैंबर के microfluidic embodiments तंत्रिका विज्ञान समुदाय से महान ब्याज को आकर्षित किया है. इन परस्पर सह संस्कृति प्लेटफार्मों संक्रमण और बीमारी प्रचार करने के लिए विकास और कार्यात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान फैले, सवालों की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, पारंपरिक प्रणालियों महत्वपूर्ण सेलुलर ऐसे प्राथमिक डोपामिनर्जिक substantia nigra, सर्पिल ganglia, और Drosophilia मेलानोगास्टर न्यूरॉन्स के रूप में कम बहुतायत कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अपर्याप्त आदानों (डिब्बे प्रति कई हजारों),,, और उच्च throughput प्रयोग के लिए अव्यावहारिक आवश्यकता होती है. घने संस्कृतियों भी अत्यधिक स्थानीय स्तर पर दो संस्कृतियों के परस्पर कुछ outgrowths (<10%) के साथ, उलझ रहे हैं. (मैं) एक microfluidic न्यूरॉन विधि arraying, और प्लाज्मा patterning biomaterial कोटिंग्स regi करने के लिए (द्वितीय) एक पानी मास्किंग विधि: इस पत्र में सीधा microfluidic और patterning प्रोटोकॉल इन चुनौतियों से निपटने के जो वर्णन किया गया हैंन्यूरॉन्स ster और डिब्बों के बीच परिणाम को बढ़ावा देने. न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों उच्च स्तर (> 85%) intercompartment कनेक्टिविटी के साथ तैयार थे और एकल कक्ष परिशुद्धता के साथ उच्च throughput तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuronal ऊतक अत्यधिक जटिल है; स्थानिक सेल संपर्क और विशेष रूप से अक्षतंतु और dendrite outgrowths के माध्यम से के माध्यम से परिभाषित परतों और डिब्बों के भीतर और प्लास्टिक कनेक्टिविटी के साथ आदेश दिया है कि एक विषम सेलुलर मिश्रण. नई तकनीक गहरी अंतर्दृष्टि और रोग, विकास, और स्वस्थ समारोह के लिए केंद्रीय सुलझाना तंत्र हासिल करने के लिए अधिक से अधिक प्रयोगात्मक स्वतंत्रता प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. Campenot कक्ष 1,2 और अधिक हाल ही में microfabricated embodiments 3,4 चुनिंदा विभिन्न दैहिक आबादी उपद्रव और भी उनके neurite outgrowths करने की क्षमता के साथ नेटवर्क neuronal सह संस्कृतियों के पूर्व vivo तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये microfluidic उपकरणों उदाहरण के लिए रासायनिक 5,6 या लेजर axotomy 6-8, tauopathy 9, वायरल प्रसार 10,11, और axons 4 में mRNA स्थानीयकरण निम्नलिखित अक्षतंतु अध: पतन और उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

ईएनटी ">

Neurobiologists की पहुंच का विस्तार, तकनीकी विकास न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों तैयार करने के लिए आवश्यक हैं. इस एकल कक्ष और उप सेलुलर परिशुद्धता के साथ प्रणाली की जांच के लिए neuronal नेटवर्क के सुलझाव सक्षम बनाता है. न्यूनतम सेल नंबर के लिए आवश्यकता पार्किंसंस रोग, कान से सर्पिल ganglia, परिधीय न्यूरॉन्स के लिए प्रासंगिक डोपामिनर्जिक substantia nigra कोशिकाओं सहित दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं, विश्लेषण, और स्टेम कोशिकाओं के लिए संभावना को खोलता है. इस के अलावा, सेलुलर अर्थव्यवस्था 3Rs पहल के लिए प्रासंगिक है. इन microfluidic प्लेटफार्मों, बड़े पैमाने पर विषाक्तता स्क्रीन या अन्य उच्च throughput का प्रयोग, पशु न्यूरॉन्स की आवश्यकता डेटा अमीर प्रयोगात्मक श्रृंखला अब माना जा सकता है.

इस पत्र में एक microfluidic डिवाइस के निर्माण और उपयोग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. सीटू biomateri में एक साथ संयोजन में microfluidic arrayingअल patterning विधि न्यूनतम सेल नंबर का उपयोग अत्यधिक परस्पर neuronal सह संस्कृतियों के पंजीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Microfluidic arraying एक अंतर प्रवाह दृष्टिकोण microstructured जाल एक fluidic सर्किट (चित्र 1 में SEM छवियों के साथ सचित्र) के भीतर तैनात हैं जिससे 12-15, पर आधारित है. neurite परिणाम चैनलों को inlets - पथ 0 → 1 microstructured apertures की एक रैखिक सरणी के लिए न्यूरॉन्स के परिवहन के लिए कम fluidic प्रतिरोध (नि. 2> आर 1) है. एक एकल कोशिका से जाल की रिहाइश स्थानीय स्तर पर पड़ोसी जाल में बाद में कोशिकाओं को फँसाने के लिए सुव्यवस्थित हटाने के प्रवाह में बाधा उत्पन्न करती. सरणी में जाल की पूरी अधिभोग अतिरिक्त न्यूरॉन्स को हटाने के लिए ऑपरेशन का एक बाईपास मोड के उत्पादन के लिए चक्करदार पथ (0 → 2) में सुव्यवस्थित हटाने की fluidic अनुपात (आर 1> आर 2) स्विच.


चित्रा 1. Microfluidic सर्किट. Neurite परिणाम चैनलों से जुड़े संस्कृति कक्षों flanking साथ एक न्यूरॉन arraying के लिए ए) अंतर प्रतिरोध fluidic सर्किट,. बी, meniscus लगाए micropillars साथ bilayer बंटे न्यूरॉन सह संस्कृति सरणी के सी) SEM छवियों. इस डिजाइन के साथ, त्रिशूल के आकार का न्यूरॉन फँसाने संरचनाओं neurite outgrowths का स्फुरण बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा और रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी (आरएससी) की अनुमति के साथ reproduced कथा 12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तलीय substrates पर micropatterned neuronal नेटवर्क की तैयारी आसानी exampl के लिए (प्राप्त किया जा सकता है हमारे समूह से तों, Frimat एट अल. 16 और Heike एट अल. 17) देखें. हालांकि, PDMS उपकरणों के भीतर और microfluidic चैनलों के लिए इनमें से सुक्ष्ममापी पैमाने संरेखण की आवश्यकता के साथ bioactive सामग्री पैटर्न encapsulating एक प्रमुख तकनीकी चुनौती बन गया है. खंड 3.1 में के लिए एक प्रोटोकॉल में चिप, या बगल में, biomaterial पैटर्न की तैयारी में प्रस्तुत किया है. इन नमूनों लंबा संस्कृति timescales दौरान न्यूरॉन पंजीकरण सक्षम और डिब्बों के बीच outgrowths को बढ़ावा देने. Meniscus-लगाए microstructures न्यूरॉन साइटों और neurite परिणाम चैनलों arraying साथ एक तथाकथित पानी मुखौटा संरेखित करने के लिए उपयोग किया जाता है. सतहों उजागर biomaterial स्वरूप को परिभाषित करने के लिए विघटित कर रहे हैं, जबकि पानी का मुखौटा, प्लाज्मा उपचार के दौरान आसंजन अणु कोटिंग्स की रक्षा करता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सेल संस्कृति के लिए और विभिन्न सह संस्कृति डिब्बों के चुनिंदा उपचार के लिए आवश्यक fluidic अलगाव के लिए प्रदान की जाती हैं.

ve_content "> प्रोटोकॉल इसी तरह, सीटू biomaterial patterning में वाष्पीकरण और सतह तनाव घटना का शोषण, सीधा है. पाली की प्रतिकृति (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic उपकरणों 18 के लिए नरम लिथोग्राफी के उपयोगकर्ता के अनुकूल सिद्धांतों का लाभ उठाने के लिए तैयार है, और कर रहे हैं केवल एक सस्ती हाथ से आयोजित प्लाज्मा स्रोत की आवश्यकता होती है. microfluidic सर्किट इन आपरेशनों बनाने को प्रभावी ढंग से कार्यक्रमों सेल लदान और डिब्बे विशिष्ट उपचार बस सही नीचे पोर्ट में सामग्री वितरण और ऊपर से aspirating की बात है. इस तरीके में, यह neurobiologists देने का इरादा है उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में microfluidic उपकरणों को तैयार करने और उपयोग करने के लिए स्वतंत्रता.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

प्रोटोकॉल neuroscientists के लिए इरादा कर रहे हैं, और चित्रा 2 में संक्षेप हैं. जैसे यह व्यावसायिक या संस्थागत सुविधाओं को आउटसोर्स है PDMS प्रतिकृति के लिए इस्तेमाल किया SU-8 स्वामी की उस microfabrication की सलाह देते है. दो परत मुखौटा डिजाइन रसायन विज्ञान वेबसाइट 12 की रॉयल सोसाइटी पर अनुपूरक जानकारी (जिप) के रूप में आसानी से उपलब्ध हैं. महत्वपूर्ण बात है, पहले SU-8 परत 2.5-3.0 मीटर की गहराई तक गढ़े, और 25-30 मीटर की गहराई तक दूसरा होना चाहिए. ये प्रभावी न्यूरॉन arraying के लिए आवश्यक प्रमुख आयाम हैं. 3 माइक्रोन ऊंचाई सीमा न्यूरॉन्स दो डिब्बों में 12 के बीच ले जाया या पलायन किया जा रहा रोकने के लिए भी आवश्यक है.

PDMS में 1. Microfluidic डिवाइस प्रतिकृति

  1. 10:01 के अनुपात में इलाज एजेंट (184) के साथ अच्छी तरह से PDMS prepolymer मिक्स और आम तौर पर 20 मिनट के लिए एक निर्वात desiccator में मिश्रण देगास. वैकल्पिक रूप से, मिश्रण डालएक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में और कम G उपयोग संरचना degassing के लिए centrifugation.
  2. एक 80 डिग्री सेल्सियस hotplate पर 2 परत microstructured SU-8 वेफर प्लेस और वेफर पर प्रत्येक डिवाइस के लिए बहुलक फ्रेम संरेखित. ≥ 5 मिमी की गहराई तक फ्रेम में PDMS डालो और> 1 घंटा पूरा थर्मल इलाज सुनिश्चित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. ठीक हो जाने के बाद, hotplate से वेफर को हटाने और एक फ्लैट सतह पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. धीरे पुरस्कार वेफर से फ्रेम और PDMS के लिए एक कठोर स्केलपेल के साथ (दूर SU-8 microstructures से) एक कोने से सुरक्षात्मक eyewear और काम पहनते हैं.
  5. फ्रेम से PDMS मोल्ड निकालें और अतिरिक्त PDMS की युक्ति ट्रिम करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें. PDMS की एक पतली फिल्म बहुलक फ्रेम और वेफर सतह के बीच फैलता है जब यह तथाकथित चमकती अक्सर उत्पादन किया जाता है.
  6. शेष PDMS पूरे वेफर करने के लिए आवेदन किया है और भंडारण के दौरान वेफर की रक्षा के लिए ठीक हो सकता है. पूर्व बाद डिवाइस ढलाई करने के लिए इस निकालें, और ऐसा करने में किसी भी पी हटानेसतह से contaminants मुखर.

2. विधानसभा डिवाइस और दूसरे का संबंध

  1. एक 3 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग 6 इंटरफेस बंदरगाहों तैयार करें. अच्छा प्रकाश की स्थिति में और microfluidic चैनलों के साथ बंदरगाहों के संरेखण सहायता करने के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ microstructured सुविधाओं के साथ, एक अंधेरे सतह पर काम करते हैं.
  2. Particulates के लिए डिवाइस का निरीक्षण किया. प्रतिवर्ती चिपकने वाला टेप का उपयोग कर इन निकालें.
  3. , ये एक लचीला के आधार पर PDMS इलाज एजेंट मिश्रण (10:1, 601) की एक छोटी मात्रा (~ 0.5 मिलीलीटर) गिरने से तैयार कर रहे हैं: microfluidic सर्किट एक गिलास coverslip पर मुहिम शुरू की एक पतली PDMS परत का उपयोग कर समझाया है जीवाणु ग्रेड पेट्री डिश. धीरे, PDMS परत पर एक coverslip प्रेस कुछ मिनट के लिए hotplate और thermally इलाज पर जगह है. जल्दी ठंडा करने के बाद, पेट्री डिश से coverslip-PDMS bilayer बाहर कटौती और पुरस्कार के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें. यदि आवश्यक हो तो कैंची से ट्रिम कर दीजिए.
  4. प्लाज्मा बंधन PDMS डिवाइसऔर एक अच्छा मुहर के उत्पादन के लिए समर्थन परत: इष्टतम स्थितियों साधन विशिष्ट हैं. उदाहरण के लिए, 40 सेकंड के लिए एक 0.2 एम्बार ऑक्सीजन वातावरण में 70 डब्ल्यू और 40 kHz पर संचालन एक प्लाज्मा ओवन एक उत्कृष्ट PDMS-PDMS बंधन पैदा करता है. प्लाज्मा इलाज एक बार, एक साथ दोनों भागों प्रेस और पूरी तरह से बंधन को एक मिनट के लिए छोड़ दें.
  5. पंप और सीरिंज के साथ इंटरफेस, सिलिकॉन टयूबिंग (3.2 मिमी आयुध डिपो 1.6 मिमी आईडी) का प्रयोग करें.

3. Biomaterial patterning और Microfluidic संचालन

सीटू biomaterial patterning, न्यूरॉन संस्कृति और fluidic उपचार के लिए प्रोटोकॉल चित्रा 2 में सचित्र हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. इलस्ट्रेटेड microfluidic प्रोटोकॉल. ए) पी एल और पीएलएल-G-खूंटी patterning; सेल आसंजन परत के अलावा (जैसे,पी एल, हरा), वाष्पीकरण गठबंधन पानी मुखौटा बी) के संपर्क में पी एल के वायुमंडलीय हवा प्लाज्मा उपचार के उत्पादन के साथ.; दो एंटीना पिंस. सी) पीबीएस आकांक्षा से (नीला) धोने पीएलएल-G-खूंटी के पी एल. डी) वितरण (लाल के साथ प्लाज्मा इलाज क्षेत्र contaminating से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है एक गुलाबी स्टार के साथ सचित्र प्लाज्मा परिचय एंटीना के साथ उपयोग किया जाता है ) कोट करने के लिए आकांक्षा प्लाज्मा इलाज क्षेत्रों ई) सेल लोडिंग से.; आकांक्षा से दोनों flanking डिब्बों को न्यूरॉन्स के एक साथ microfluidic arraying, एक हीड्रास्टाटिक संचालित प्रवाह जी) पृथक fluidic उपचार का उपयोग एफ) मीडिया (गुलाबी) छिड़काव.; एक परीक्षण एजेंट (काला) के परिधीय उपचार आकांक्षा और आकांक्षा से नीचे केंद्रीय इनलेट से बचाया एच) केंद्रीय उपचार से नीचे flanking प्रवेश से बचाया. चित्रा और किंवदंती रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी की अनुमति के साथ reproduced(आरएससी) 12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

PDMS microfluidic चैनलों संबंध तुरंत बाद प्लाज्मा (संपर्क कोण ≤ 5 °) अत्यधिक हाइड्रोफिलिक हैं. इस तरह की सतहों ऐसे भेदभाव मानव एसएच SY5Y न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह के रूप में सेल लाइनों के आसंजन और संस्कृति के लिए उपयुक्त हैं. प्राथमिक न्यूरॉन्स और इस तरह के लुंड मानव mesencephalic सेल लाइन (LUHMES) एक polyamine कोटिंग, polylysine (पीएल) या polyornithine (पीओ) के रूप में भी neuronal अग्रदूत सेल लाइनों की संस्कृति के पूर्व vivo संस्कृति के लिए, एक electrostatic एंकर के रूप में आवश्यक है. इसके अलावा इस तरह के laminin या फ़ाइब्रोनेक्टिन रूप आसंजन प्रोटीन अक्सर integrin-interfacing परत के रूप में आवश्यक हैं. हालांकि, पी एल और पीओ कोटिंग्स आसानी सरणी साइटों के लिए microfluidic वितरण निरोधक और भी अवांछित कतरनी तनाव लगाने, न्यूरॉन्स बाँध. इस समस्या को हल करने में चिप biomaterialpatterning जाल साइटों और परिणाम microchannels में आसंजन सामग्री स्थानीय बनाना आवश्यक है. यह भी अंतर - कम्पार्टमेंट कनेक्शन के विकास को बढ़ावा देता है और स्थानीय उलझाव कम कर देता है. प्रोटोकॉल भी प्रोटीन और न्यूरॉन्स लंबा संस्कृति दौरान इच्छित स्थानों के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए पड़ोसी क्षेत्रों के लिए खूंटी सामग्री के अलावा शामिल है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल चित्रा 3 में दर्ज़ है:

चित्रा 3
चित्रा 3. जल प्लाज्मा स्टेंसिलिंग द्वारा biomaterial patterning के लिए मास्किंग. ए) PDMS micropillars प्लाज्मा स्टेंसिलिंग के लिए जगह में पानी meniscus लगाए साथ पानी मास्किंग प्रक्रिया का चित्रण. ऊर्ध्वाधर विमान में meniscus की वक्रता उपेक्षा की गई है. बी) पानी मुखौटा meniscus पी ने एक लाल रंग के साथ कल्पना और तैनातप्रोटीन की प्लाज्मा स्टेंसिलिंग. डी के बाद imaged पारी. सी) नमूनों पी एल FITC कोटिंग) इसके अलावा एक प्लाज्मा नमूनों पी एल FITC कोटिंग को खारिज और सेल विकर्षक पीएलएल-G-खूंटी TRITC. इस एसएच SY5Y कोशिकाओं के पंजीकरण के लिए और भी LUHMES कोशिकाओं के लिए एक अतिरिक्त फ़ाइब्रोनेक्टिन परत patterning के लिए इस्तेमाल किया गया था. चित्रा और रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी (आरएससी) की अनुमति के साथ reproduced कथा 12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. प्लाज्मा स्टेंसिलिंग में सीटू Biomaterial patterning के लिए जल मास्किंग
    1. फौरन प्लाज्मा संबंध पिपेट के बाद नीचे केंद्र पोर्ट में पी एल या पीओ (100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में 1x पीबीएस) के एक 0.5 μl मात्रा. सेकंड के एक मामले के भीतर पूरी microfluidic सर्किट केशिका कार्रवाई से भर जाता है. कुछ मिनट के लिए छोड़ दें Polya के साथ पूरी तरह से कोट हाइड्रोफिलिक PDMS सतहों के लिएखानों.
    2. 1 मिनट के लिए (चित्रा -2 देखें) 1x पीबीएस के साथ आकांक्षा संचालित धोने से अनबाउंड polyamine अणुओं निकालें.
    3. बंदरगाहों से सभी पीबीएस निकालें और एक माइक्रोस्कोप के साथ रोशनी से डिवाइस गर्मी. यह तेजी से पानी का मुखौटा गठन के लिए बंदरगाहों से वाष्पीकरण बढ़ जाती है. पानी मुखौटा (चित्रा 3 में सचित्र और चित्रा 3 बी में दर्ज़) ~ 5 मिनट के भीतर स्थापित किया गया है.
    4. पानी मास्किंग पूरा हो गया है यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा युक्ति का निरीक्षण किया. सरणी साइट के अपस्ट्रीम जलाशय संरचनाओं पानी मुखौटा (~ 15 मिनट) की स्थिरता को लम्बा करने के लिए मुखौटा डिजाइन में शामिल किए गए हैं कृपया ध्यान दें.
    5. बंदरगाहों (चित्रा 2 बी) में स्टेनलेस स्टील पिन डालें. ये खाली microfluidic चैनलों में 19,20 (2 मेगाहर्ट्ज, 30 केवी संकेत पर सक्रिय है, उदाहरण के लिए) जोड़े एक वायुमंडलीय दबाव हाथ से आयोजित कोरोना डिस्चार्ज या टेस्ला जनरेटर द्वारा उत्पन्न प्लाज्मा के लिए उपयोग किया जाता है. टी की नोक प्वाइंटवह एक पिन और प्लाज्मा की टिप करने के लिए करीब स्रोत ≤ 1 सेकंड के लिए microchannel इलाज प्लाज्मा. प्लाज्मा patterning निरीक्षण करने के लिए कम रोशनी की स्थिति का प्रयोग करें.
    6. एक धोने के कदम के साथ पानी नकाब हटा. ऊपरी 3 बंदरगाहों से समानांतर आकांक्षा का प्रयोग करें. समानांतर आकांक्षा को प्राप्त करने के लिए एक आकांक्षा पंप करने के लिए एक 4 रास्ता एडाप्टर से जुड़े सिलिकॉन टयूबिंग के 4 बराबर लंबाई का उपयोग करें. आकांक्षा प्रारंभ और microfluidic सर्किट के माध्यम से पीबीएस आकर्षित करने के लिए नीचे 3 बंदरगाहों में पीबीएस बांटना. इस तरीके में एक PDMS-polyamine विपरीत सामग्री (चित्रा -3 सी देखें) का उत्पादन किया है. Microfluidic सर्किट से पीबीएस खाली और देशी, हाइड्रोफोबिक स्थिति बहाल करने के लिए कई घंटे के लिए छोड़ दें. यह सेल आसंजन को PDMS पूरी तरह से गैर अनुमोदक renders.
    7. ऐसे laminin या fibronectin के रूप में अतिरिक्त आसंजन सामग्री, निम्न चरणों का तुरंत पानी नकाब हटाने के बाद आवश्यक हैं और किया जाना चाहिए आवश्यक होना चाहिए: पिपेट भ्रष्टाचार के सह बहुलक पाली एल के एक 10 μl मात्रा- लाइसिन पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (पीबीएस में पीएलएल-G-खूंटी, 100 माइक्रोग्राम / एमएल) दोनों नीचे flanking चैनलों में, 2 मिनट के लिए ऊपरी flanking चैनलों से आकांक्षा द्वारा पीछा किया.
    8. प्रवाह में दखल के बिना, एक पीबीएस बफर के साथ विनिमय द्वारा अतिरिक्त पीएलएल-G-खूंटी हटा दें. खूंटी आधा भाग प्रोटीन सोखना और सेल आसंजन 17,21 को रोकने के लिए अभिनय के साथ यह चुनिंदा कोट गैर polyamine में लिपटे क्षेत्रों के.
    9. ऐसे laminin या fibronectin के रूप में प्रोटीन आसंजन तो पाली amine कोटिंग के साथ सह स्थानीयकृत किया जा सकता है: इन ईसीएम प्रोटीन (आमतौर पर 10 माइक्रोग्राम / एमएल) की पिपेट 10 μl मात्रा में सभी तीन नीचे बंदरगाहों में. डिवाइस प्रोटीन समाधान के साथ भरा और एक अच्छी गुणवत्ता की कोटिंग का उत्पादन करने के लिए 1 घंटे के लिए सेते है जब तक शीर्ष तीन बंदरगाहों से महाप्राण.
    10. नीचे 3 बंदरगाहों से पीबीएस aspirating द्वारा अतिरिक्त प्रोटीन निकालें.
  2. Microfluidic न्यूरॉन arraying
    1. उपयुक्त के साथ प्रधानमंत्री उपकरणोंमीडिया खा लिया. नीचे 3 बंदरगाहों के लिए 20 μl मात्रा में जोड़ें और ऊपरी तीन बंदरगाहों से समानांतर आकांक्षा से तेजी से मीडिया के साथ microfluidic सर्किट भरें. एक आकांक्षा पंप के बराबर लंबाई सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से जोड़े के लिए एक 4 रास्ता ट्यूबिंग कनेक्टर 3 ऊपरी बंदरगाहों का उपयोग करें.
    2. (चित्र 1 में 0,) flanking इनलेट बंदरगाहों में से प्रत्येक के लिए एक disaggregated सेल निलंबन के 20 μl (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) जोड़ें.
    3. एक प्रवाह नियामक के साथ एक आकांक्षा पंप लैस या ऊपरी 3 बंदरगाहों से कोमल आकांक्षा के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें. पूरी न्यूरॉन arraying आम तौर पर 1 मिनट की आवश्यकता है.
    4. बाद में microfluidic उपकरणों में arraying के लिए एक विंदुक के साथ 4 flanking बंदरगाहों में शेष अतिरिक्त न्यूरॉन्स हार्वेस्ट.
    5. ट्यूबिंग निकालें. मीडिया के साथ सभी बंदरगाहों भरें और इनक्यूबेटर में डिवाइस जगह है. कुछ ही घंटों के भीतर कोशिकाओं biomaterial तर्ज पर पूरी तरह से पक्षपाती हो जाते हैं.
  3. न्यूरॉन संस्कृति, चयनात्मक fluidic उपचार, और immunostaining
    1. हीड्रास्टाटिक फीड (एक 2 मिमी स्तंभ ऊंचाई अंतर उचित धीमी है) का उपयोग आवधिक छिड़काव द्वारा मीडिया आदान प्रदान.
    2. वैकल्पिक रूप से, मानक सेल संस्कृतियों के साथ के रूप में (2-3 दिन) समय समय पर मीडिया का आदान प्रदान, मीडिया में microfluidic डिवाइस डूब.
    3. इस प्रकार के रूप न्यूरॉन संस्कृति कम्पार्टमेंट या केंद्रीय neurite परिणाम कम्पार्टमेंट या तो चयनात्मक fluidic उपचार प्राप्त कर रहे हैं: ब्याज के चैनल के नीचे पोर्ट में परीक्षण पदार्थ के 20 μl बांटना, और सीधे ऊपर बंदरगाह से महाप्राण. लंबा उपचार एक प्रवाह नियामक का उपयोग कर प्रवाह की दर को कम करने और आवश्यक के रूप में परीक्षण पदार्थ की भरपाई के लिए.
    4. Immunostaining प्रोटोकॉल प्रत्येक आणविक लक्ष्य और जुड़े अभिकर्मकों के लिए बदलती हैं. एक धीमी प्रवाह दर का इस्तेमाल किया गया था न्यूरॉन्स के लिए कतरनी प्रेरित क्षति के संभावित खतरे का मुकाबला करने के लिए. यह सामान्य प्रोटोकॉल बार बढ़ा है, पूरी तरह से प्रणाली छिड़कना के लिए बढ़ा आवेदन के समय में यह परिणाम है. लुका(2 मिमी से जैसे,) भिन्न स्तंभ हाइट्स के साथ बंदरगाहों का उपयोग drostatic छिड़काव अभिकर्मकों देने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक पंप का उपयोग कर अधिक तेजी अभिकर्मक अलावा और हटाने प्रयोगात्मक timescales कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नीचे 3 बंदरगाहों से अभिकर्मकों आकर्षित करने के लिए ऊपरी 3 बंदरगाहों के लिए एक आकांक्षा पंप से कनेक्ट करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

जल मास्किंग कारनामे तनाव सतह. हवा तरल इंटरफेस पर दबाव सहिष्णुता वक्रता [की त्रिज्या के साथ inversely तराजू , Microfluidic आयामों पर अत्यधिक स्थिर इंटरफेस का निर्माण किया. micropillars प्रभावी ढंग से जगह में पानी मुखौटा लंगर. जल मुखौटा गठन हीटिंग की वृद्धि दर के साथ, microfluidic बंदरगाहों से वाष्पीकरण से प्रेरित है. कम बढ़ाई (4X - 10X) से गर्मी का प्रयोग माइक्रोस्कोपी रोशनी, पानी मुखौटा आमतौर पर ≤ 5 मिनट में स्थापित किया गया था. वाष्पीकरण भी पानी मुखौटा के अंतिम पतन की ओर जाता है. ~ (प्लाज्मा स्टेंसिलिंग के लिए व्यावहारिक) 15 मिनट, 18 NL जलाशय संरचनाओं संस्कृति डिब्बों के ऊपर को तैनात किया गया है पानी मुखौटा का जीवनकाल बढ़ाने के लिए. पानी मुखौटा गठन और पतन की दर भिन्न हो सकते हैं, और रुक - रुक कर अवलोकन प्लाज्मा टी के लिए एक उपयुक्त अवधि की पहचान करने के लिए सिफारिश की हैreatment. फिर भी, कई उपकरणों एक साथ तैयार किया जा सकता है.

प्लाज्मा स्टेंसिलिंग ~ 1 सेकंड की आवश्यकता है. लंबा उपचार के उपयोग polyamine कोटिंग के अत्यधिक प्लाज्मा विघटन के लिए अग्रणी, पानी मुखौटा वाष्पीकृत. इस अवसर अपर्याप्त प्लाज्मा उपचार के परिणाम में, (चित्रा 3 डी देखें) आसन्न microchannel दीवार पर बरकरार polyamine कोटिंग्स छोड़ने न्यूरॉन आसंजन 12 का समर्थन कर सकते हैं. फिर भी, arrayed माउस cortical न्यूरॉन्स 6 दिनों के लिए संस्कृति निम्नलिखित 89.5% 12 की एक patterning क्षमता थी. यह दक्षता तलीय substrates पर पी एल / खूंटी पैटर्न के बराबर है. Biomaterial patterning neurite microchannels में outgrowths को बढ़ावा देने के लिए आगे योग्यता है. एक निरंतर polyamine कोटिंग परिणाम के स्तर के साथ 70% ~ तक कम हो गई थी, जबकि biomaterial patterning outgrowths, microchannels की 90% ~ भीतर बढ़ाया. Cortical न्यूरॉन्स का प्रयोग, में चिप संस्कृति के 7 दिनों के विकसित हो जाना के लिए आवश्यक थादोनों डिब्बों (500 माइक्रोन की दूरी) अवधि के लिए ths. विभेदित मानव एसएच SY5Y न्यूरॉन्स 4-6 दिनों में कनेक्शन की स्थापना, उच्च परिणाम की दर थी. Cortical, LUHMES और एसएच SY5Y न्यूरॉन्स करने के लिए 2 सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया है. यह प्राप्त किया जा करने के लिए सहज electrophysiological समारोह के लिए पर्याप्त रूप से लंबा है और परोक्ष रूप से सीए 2 + इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है. इस biomaterial patterning और कार्यात्मक neuronal नेटवर्क स्थापित करने के लिए microfluidic arraying तरीकों के व्यापक प्रयोज्यता मान्य होगा.

meniscus-लगाए संरचनाओं, तथापि, neurite उलझाव (चित्रा 4C देखें) को बढ़ावा देने है. एज खोज microstructured सतहों 22 सुसंस्कृत axons की एक आम सुविधा है. इस तरह के उलझाव को रोकने और आगे अंतर - कम्पार्टमेंट कनेक्शन के गठन को बढ़ावा देने, meniscus-लगाए खंभे microchannel दीवार (यानी अब कोई मुक्त खड़े) के साथ विलय किया जा सकता है. इसके अलावा, outgrowths मेंकेंद्रीय microfluidic चैनल में बेतरतीब किया जा सकता है. रेखीय कनेक्टिविटी की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए, केंद्रीय चैनल (दिन्ह एट अल. 12, अनुपूरक जानकारी में मुखौटा डिजाइन देखें) हटाया जा सकता है. इस सर्किट सेल आसंजन या दूसरे डिब्बे में कोशिकाओं arraying के लिए अनुमोदक सर्किट रेंडर करने के लिए तथाकथित सेलुलर valving 14 के लिए एक अवधि (जैसे, 4 घंटा) के बाद पहली डिब्बे के धारावाहिक arraying, की आवश्यकता है.

microfluidic सर्किट पूर्व क्रमादेशित fluidic आपरेशन प्रदान करता है. विभिन्न कार्यों ट्यूबिंग या सुझाव के साथ अभिकर्मकों या अंतरफलक लोड करने के लिए बंदरगाह की पसंद से निर्धारित होते हैं. इस neurobiologists के लिए तकनीक अत्यधिक सुलभ बनाने के लिए जटिल, महंगी और अंतरिक्ष की मांग की प्रतिक्रियाएं नियंत्रित इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए जरूरत से बचा जाता. सर्किट डिजाइन 12-14 arraying microfluidic को प्राप्त करने के लिए इष्टतम सापेक्ष आयामों पर निर्भर है. छोटे परिवर्तन Cir रोका जा सकता हैकामकाज से CUIT, और इसलिए हम स्वतंत्र रूप से उपलब्ध डिजाइनों 12 का उपयोग करना प्रोटोकॉल का प्रारंभिक adopters की सिफारिश की. एक इष्टतम सर्किट के साथ, microfluidic न्यूरॉन arraying कम से कम 1 मिनट में प्रत्येक संस्कृति कक्ष में arrayed ~ 100 न्यूरॉन्स के साथ, तेजी से है. न्यूरॉन्स की सीमित संख्या के बावजूद स्थानीय घनत्व अभी भी पर्याप्त जीवन रक्षक संकेतन स्तर प्रदान करने के लिए मानक संस्कृतियों के बराबर है. चित्रा 4 बी में दस्तावेज के रूप में इस दृष्टिकोण को प्रभावी ढंग से फंसाने के प्रति 1 न्यूरॉन (1.14 ± 0.09) 12 पैदावार. लेकिन, नहीं सभी न्यूरॉन्स arrayed रहे हैं. microfluidic सर्किट लामिना का प्रवाह के बाहरी क्षेत्रों में पहुंचने के न्यूरॉन्स टेढ़ा चैनल के लिए जारी है कि इस तरह के समानांतर सुव्यवस्थित, उत्पन्न करता है. फिर भी प्रस्तुत प्रणाली मौजूदा बंटे प्रणालियों की तुलना में कोशिकाओं के साथ और अधिक किफायती 10-100 गुना है. निष्कासित कर दिया कोशिकाओं बंदरगाहों और टयूबिंग से काटा जा सकता है. भविष्य के डिजाइन में, नदी के ऊपर नियतात्मक पार्श्व विस्थापन23 arraying में सभी कोशिकाओं से ध्यान हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता संरचनाओं पूर्ण सेलुलर अर्थव्यवस्था के लिए सुव्यवस्थित.

चित्रा 4
चित्रा 4. Microfluidic न्यूरॉन arraying. ए) एक सिरिंज का उपयोग मैनुअल आकांक्षा कोमल न्यूरॉन arraying के लिए प्रयोग किया जाता है. एक 4 रास्ता ट्यूबिंग कनेक्टर दोनों डिब्बों में arraying एक साथ न्यूरॉन के लिए ऊपरी 3 बंदरगाहों के साथ सिरिंज इंटरफेस करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बी) न्यूरॉन की तरह मानव एसएच SY5Y कोशिकाओं और अन्य न्यूरॉन्स एकल कक्ष परिशुद्धता (जाल प्रति एक न्यूरॉन के साथ arrayed रहे विभेदित ). सी) संस्कृति के 5 दिनों के बाद, neurite एक्सटेंशन दो संस्कृतियों को आपस में. नाभिक DAPI के साथ दाग रहे हैं और actin immunostaining outgrowths कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. संशोधित आंकड़ा और लेजेंड रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी (आरएससी) की अनुमति के साथ reproduced बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

बंटे प्रणालियों की एक प्रमुख विशेषता चुनिंदा सामग्री के अवैध व्यापार और लंबी दूरी के संकेत दे जांच करने के लिए व्यक्तिगत सेल आबादी का इलाज करने की क्षमता है. हालांकि, साहित्य में उपलब्ध तरीकों fluidic अलगाव के लिए अपर्याप्त या खराब वर्णित हैं या तो कर रहे हैं. हम विकसित किया है fluidic अलगाव विधि <(1 घंटा) 12 परीक्षण पदार्थों और लंबे समय तक fluidic अलगाव की (1 मिनट तेजी से वितरण)> सक्षम बनाता है. परिणाम चित्रा 5 में दर्ज हैं. यह क्षमता सर्किट डिजाइन के संयोजन से और परीक्षण पदार्थ वितरित करने के लिए आकांक्षा का उपयोग करके संभव बनाया है. इस हीड्रास्टाटिक फ़ीड द्वारा की एक सिरिंज पंप का उपयोग द्रव इंजेक्शन के विपरीत है. Neurite परिणाम चैनलों के उच्च fluidic प्रतिरोध के बावजूद, इन तरीकों संवहन रास्तों टी का उत्पादनटोपी तेजी से परीक्षण पदार्थों फैलाने और पूरे उपकरण को दूषित. ऊपरी बंदरगाह से जुड़ी उम्मीदें भी सर्किट (सिद्धांत arraying अंतर प्रतिरोध करने के लिए केंद्रीय एक विशेषता) भर में तरल पदार्थ के साथ सूचना का आदान प्रदान. हालांकि, ऑपरेशन के इस मोड में, मीडिया के बजाय यह dispersing का परीक्षण पदार्थ को कमजोर करने के लिए कहीं और सर्किट में से लिए गए हैं. चरम fluidic प्रतिरोध neurite परिणाम चैनलों की (रिश्तेदार) को देखते हुए, कमजोर पड़ने का स्तर नगण्य है. प्रसार ढ़ाल की स्थापना entailing प्रयोगों के लिए, आकांक्षा विधि चुनिंदा रासायनिक ढाल के समय पर निर्भर विकास आरंभ करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रवाह समाप्ति के साथ, एक डिब्बे के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. चयनात्मक fluidic उपचार. टी के ए) आकांक्षा संचालित चयनात्मक उपचारउन्होंने कहा कि केन्द्र और बी) डिब्बों flanking. तीर आकांक्षा के लिए इस्तेमाल एक बंदरगाह इंगित करता है. उपचार 1 मिनट (लाल लाइनों) में स्थापित किए गए थे और प्रयोग की अवधि के लिए बनाए रखा गया; 60 मिनट (ब्लू लाइन). संशोधित आंकड़ा और रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी (आरएससी) की अनुमति के साथ reproduced कथा 12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

microfluidic arraying तकनीक न्यूनतर संस्कृतियों की स्थापना के लिए सटीक एक न्यूरॉन से निपटने में सक्षम बनाता है कि अपनी तरह का पहला है. Microfluidic संरचनाओं के साथ सेल पैटर्न के लिए पंक्ति में सीटू biomaterial patterning विधि में, एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के साथ युग्मित, इन न्यूनतर संस्कृतियों कम स्थानीय उलझाव के साथ उच्च intercompartment कनेक्टिविटी स्तर है. साधारण डिजाइन संशोधनों दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत axons को अलग करने की क्षमता है के साथ इन सुविधाओं अंतर - कम्पार्टमेंट प्रसारण के कुशल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अगली पीढ़ी में त्रिशूल संरचनाओं बंडलों के गठन कई axons की संभावना को कम करने के लिए न्यूरॉन प्रति एक परिणाम चैनल के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है डिजाइन. इन क्षमताओं बहुत सहित तंत्रिका विज्ञान आवेदनों की एक किस्म फायदा हो सकता है; nanoparticulate विषाक्तता 24 और मैंगनीज प्रचार 25, गतिविधि synमिर्गी में chronization, ऐसे prions 26, अल्जाइमर रोग 9 में amyloid बीटा (अब) संचरण, और पार्किंसंस रोग 27 में अल्फा synuclein के रूप में संक्रामक एजेंटों के प्रसार.

Microfluidic arraying पद्धति का एक स्पष्ट लाभ कम बहुतायत न्यूरॉन उप आबादी के बजाय जटिल विषम संस्कृतियों के साथ शोध करने की क्षमता है. उदाहरण के लिए, केवल कम संख्या में अलग किया जा सकता है कि पार्किंसंस अनुसंधान या परिधीय न्यूरॉन्स के लिए उपयुक्त डोपामिनर्जिक substantia nigra न्यूरॉन्स microfluidic मंच का उपयोग दोहराने के अध्ययन के लिए अभी भी पर्याप्त हैं. अन्य दुर्लभ सेल आवेदन उदाहरण सर्पिल ganglia न्यूरॉन्स के साथ सह सुसंस्कृत बालों की कोशिकाओं का एक प्रयोगात्मक व्यवस्था का उपयोग करते हुए सुनवाई हानि के आधार की जांच, या मनुष्यों से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन में शामिल हैं. इसी तरह, सिस्टम की कम सेल आवश्यकताओं को यह करनाआसानी से संभव लघु Drosophilia मेलानोगास्टर मस्तिष्क 28 से न्यूरॉन्स के साथ प्रयोग करने के लिए और इस तरह इस शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल के लाभों का लाभ उठाने के लिए.

अन्य परिप्रेक्ष्य सेलुलर अर्थव्यवस्था और उच्च throughput अनुसंधान प्रबंधनीय बनाता है कि छोटा सा उपकरण पदचिह्न की व्यावहारिकता है. प्रत्येक शर्त और दोहराने के न्यूनतम न्यूरॉन्स काफी चल रही 3Rs पहल के साथ लाइन में पशु संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सुविधा की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, यौगिकों की एक बड़ी पैनल की खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण एक भी जानवर का उपयोग किया जा सकता है. स्क्रीन के प्रकार विषाक्तता परीक्षण और siRNA या लंबी दूरी की तस्करी और संकेत पारगमन पर उनके प्रभाव के लिए औषधीय एजेंटों के पुस्तकालयों की जांच में शामिल हैं. संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल उच्च throughput, मात्रात्मक और आंकड़ा देने की क्षमता की पेशकश, न्यूरोसाइंटिस्ट की प्रयोगात्मक पहुंच का विस्तारएकल और subcellular संकल्प के साथ सहयोगी शक्तिशाली डेटा. यह और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में कई अन्य महान घटनाओं अंतर्निहित तंत्र neuronal विकास और समारोह में नए अंतर्दृष्टि, साथ ही बीमारी के कारण रोग प्रक्रियाओं को बढ़ावा मिलेगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों SEM इमेजिंग के लिए SU-8 निर्माण और मारिया बेकर (ISAs) के लिए Ulrich Marggraf (ISAs) के लिए आभारी हैं. अनुसंधान आर्थिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), एक Bundesministerium फर Bildung und Forschung अनुदान (BMBF 0101-31P6541) द्वारा और Ministerium फर अभिनव, Wissenschaft und Forschung डेस लैंडेस Nordrhein-Westfalen द्वारा समर्थित किया गया. Heike Hardelauf धन्यवाद अंतर्राष्ट्रीय लाइबनिट्स ग्रेजुएट स्कूल "सिस्टम्स बायोलॉजी लैब पर एक चिप" वित्तीय सहायता के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
सिंगल सेल प्रेसिजन साथ Neuronal सह संस्कृति की तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter