Summary
Protokoll för enda neuron mikroflödes ordnande och vatten maskering för in-chip plasma mönstring av biomaterial beläggningar beskrivs. Tätt sammanlänkad samkulturer kan framställas med användning av minimala cellingångar.
Abstract
Mikroflödes utföranden av Campenot kammare har rönt stort intresse från neurovetenskap samhället. Dessa sammankopplade co-kultur-plattformar kan användas för att undersöka en rad olika frågor, som spänner över utvecklings och funktionell neurobiology till infektion och sjukdomsutbredning. Men konventionella system kräver betydande cellulära ingångar (många tusen per fack), otillräcklig för att studera låga överflöd celler, såsom primär dopaminerga substantia nigra, spiral ganglier, och Drosophilia melanogaster nervceller, och opraktiskt för hög genomströmning experiment. De täta kulturer är också starkt lokalt intrasslade med få utväxter (<10%) som sammanbinder de två kulturerna. I detta papper okomplicerade microfluidic och mönstring protokoll beskrivs som itu med dessa utmaningar: (i) en mikroflödes enda neuron grupperande metod, och (ii) ett vattenmaskningsmetod för plasma mönstring biomaterial beläggningar till REGIster nervceller och främja utväxt mellan fack. Minimalistic neuronala samkulturer bereddes med hög nivå (> 85%) intercompartment anslutning och kan användas vid hög genomströmning neurobiology experiment med enstaka cell precision.
Introduction
Neuronal vävnad är mycket komplexa; en heterogen cellblandning som rumsligt beställs inom definierade lager och fack och med plast anslutning via cellkontakter och speciellt via axon och dendrit utväxter. Nya tekniker behövs för att ge ökad experimentell frihet att få djupare insikter och avslöja mekanismer centrala för sjukdomen, utveckling, och friska funktion. Den Campenot kammare 1,2 och mer nyligen mikrofabricerade utföringsformema 3,4 kan användas för ex vivo-framställning av nätverks neuronala samkulturer med förmågan att selektivt störa de olika somatiska populationer och även deras neurite utväxter. Dessa mikroflödessystem enheter har till exempel använts för att studera axon degeneration och regeneration följande kemiska 5,6 eller laser axotomy 6-8, tauopathy 9, viral spridning 10,11, och mRNA-lokalisering i axoner 4.
ent ">För att utöka räckvidden för de neurobiologists, är den tekniska utvecklingen som krävs för att förbereda minimalistiska neuronala co-kulturer. Detta möjliggör lösgörande av det neuronala nätverket för undersökning av det system med enskild cell och sub-cellulära precision. Kravet på minsta cell nummer öppnar möjligheten att analysera sällsynta celltyper, inklusive dopaminerga substantia nigra celler relevanta för Parkinsons sjukdom, spiral ganglier från örat, perifera nervceller, och stamceller. Utöver detta, är cellulära ekonomi relevans för 3R-initiativet. Med hjälp av dessa mikroflödes plattformar, toxicitet skärmar storskaliga eller annan hög genomströmning kan data rika försöksserier som kräver djur nervceller nu beaktas.
I detta papper protokoll för tillverkning och användning av en mikrofluidanordning beskrivs. Microfluidic ordnande i kombination med en in situ biomaterial mönstring metod kan användas för registrering av starkt sammankopplade neuronala co-kulturer som använder minimal cell nummer. Microfluidic grupperings är baserad på en differentialflödes metod 12-15, varvid mikrostrukturerade fällor är placerade inom en fluidkrets (illustrerad tillsammans med SEM-bilderna i fig 1). Vägen 0 → 1 har den nedre fluidic motståndet (R2> R1) för transport av nervceller till en linjär grupp av mikrostrukturerade öppningar - inloppen till de neuritutväxt kanalerna. Inflyttning i fällan av en enda cell lokalt hindrar flödet för att avleda de effektiviserar för att fånga efterföljande celler i grann fällor. Komplett beläggning av fällorna i arrayen växlar fluidic förhållandet (R1> R2) för att avleda de strömlinjerna i den slingrande väg (0 → 2) för att producera en bypass driftsform för att avlägsna överskott av nervceller.
Figur 1. Microfluidic Circuit. A) Den differentiella motstånd fluidkrets för enda neuron grupperings, med flankerande odlingskamrarna är sammankopplade av neuritutväxt kanaler. B, C) SEM-bilder av dubbelskiktet compartmentalized neuron samodling array med menisk pinning micropillars. Med denna konstruktion var treudd formade neuron fångst strukturer användas för att främja fascikulering av neurite utväxter. Bild och legend återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klicka här för att visa en större bild.
Beredningen av micropatterned neuronala nätverk på plana underlag kan lätt uppnås (för exampl es från vår grupp, se Frimat et al. 16 och Heike et al. 17). Men kapsla in bioaktiva materialmönster inom PDMS-enheter och med kravet på mikrometerskala anpassning av dessa till mikroflödessystem kanaler innebär en stor teknisk utmaning. I avsnitt 3.1 ett protokoll för i-chip, eller in situ, beredning av biomaterial mönster presenteras. Dessa mönster aktivera neuron registrering under långa kulturtidsramar och främja utväxter mellan fack. Menisk-pinning mikrostrukturerna används för att rikta in ett så kallat vatten mask med neuronen grupperande platser och neuritutväxt kanaler. Vattnet mask skyddar adhesionsmolekyl beläggningar under plasmabehandling, medan exponerade ytor sönderdelas för att definiera biomaterial mönstret. Dessutom är protokoll tillhandahålls för cellodling och för fluidic isolering är nödvändig för selektiv behandling av de olika sam-odlings fack.
ve_content "> är De protokoll som syftar till att utnyttja de användarvänliga principer för mjuk litografi för replikering av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) mikrofluidikanordningar 18. På samma sätt, in situ biomaterial mönstring är okomplicerad, utnyttja avdunstning och ytspänning fenomen, och endast kräver en billig handhållen plasmakälla. Den mikroflödeskretsen effektivt program cell lastning och fack specifika behandlingar gör dessa operationer bara om att fördela material i rätt nedre porten och aspire ovanifrån. På detta sätt den är avsedd att ge neurobiologists friheten att förbereda och använda mikroflödessystem enheter i sina egna laboratorier.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen är avsedda för neuroforskare, och sammanfattas i Figur 2. Som sådant är det rekommenderar att mikrofabrikation av SU-8 mästare som används för PDMS replikering är utlagd på kommersiella eller institutionella anläggningar. De två lagermask mönster är fritt tillgängliga som kompletterande information (ZIP) på Royal Society of Chemistry webbplats 12. Huvudsakligen bör det första SU-8 skikt tillverkas till ett djup av 2,5 till 3,0 | im, och den andra till ett djup av 25 till 30 | im. Dessa är viktiga dimensioner som krävs för en effektiv neuron ordnande. Den 3 mikron höjdsbegränsningen är också nödvändigt att förhindra nervceller som transporteras eller migrera mellan de båda avdelningarna 12.
1. Mikroflödessystem enhet replikering i PDMS
- Blanda PDMS prepolymer noggrant med härdaren (184) i ett förhållande av 10:01 och avlufta blandningen i en vakuumexsickator för typiskt 20 min. Alternativt sätta mixenning i en 50 ml Falcon rör och använd låga g centrifugering under avgasning.
- Placera 2-lagers mikro SU-8 rånet på en 80 ° C kokplatta och rikta polymer ramar till varje enhet i rånet. Häll PDMS i ramarna till ett djup av ≥ 5 mm och låt> 1 h för att säkerställa fullständig termisk härdning.
- Härdat ta bort skivan från plattan och låt svalna på en plan yta.
- Bär skyddsglasögon och arbeta från ett hörn (bort från SU-8 mikrostrukturer) med en styv skalpell för att försiktigt den ramen och PDMS från skivan.
- Avlägsna PDMS mögel från ramen och använda en sax för att klippa anordningen av överskott PDMS. Denna så kallade flashning är ofta produceras när en tunn film av PDMS sprider mellan polymerramen och skivytan.
- Kvar PDMS kan appliceras på hela wafern och härdas för att skydda skivan under lagring. Ta bort detta före efterföljande enhet gjutning, och därmed ta bort eventuella partikulera föroreningar från ytan.
2. Enhets Montering och samtrafik
- Förbered gränssnittsportar 6 med hjälp av en 3 mm biopsi diameter punch. Arbetet med en mörk yta, i goda ljusförhållanden och med den mikrostrukturerade funktioner vända uppåt för att underlätta anpassningen av hamnarna med mikroflödessystem kanaler.
- Inspektera enheten för partiklar. Ta bort dessa med reversibel tejp.
- Den mikroflödeskretsen är inkapslad med en tunn PDMS skikt monterat på ett täckglas: Dessa framställs genom att hälla en liten volym (~ 0,5 ml) av PDMS-härdningsmedel-blandning (10:01, 601) på basen av en flexibel, bakteriologisk grade petriskål. Tryck försiktigt ett täckglas på PDMS lagret, placera på kokplattan och termiskt botemedel för några minuter. Snabbt efter kylning, använd en skalpell för att skära ut och pristäck-PDMS dubbelskikt från petriskål. Trimma med sax om det behövs.
- Plasma bond PDMS-enhetenoch stödlager för att producera en bra tätning: Optimala förhållanden är instrumentspecifika. Till exempel kan en plasma ugn som arbetar vid 70 W och 40 kHz i en 0,2 mbar syreatmosfär under 40 sek alstrar en utmärkt PDMS-PDMS bindning. När plasma behandlad, tryck på båda delarna ihop och låt stå i en minut för att helt band.
- Använd silikonslang (1,6 mm ID, 3,2 mm OD) för att kommunicera med pumpar och sprutor.
3. Biomaterial Mönstring och Microfluidic Operations
Protokollen för in situ biomaterial mönstring, neuron kultur och fluidiska behandlingar är illustrerad i figur 2.
Figur 2. Illustrerade microfluidic protokoll. A) PL och PLL-g-PEG mönstring; tillsats av cellvidhäftningslager (t.ex.PL, grön), med avdunstning producera linje vatten mask B) Atmosfärplasmabehandling av den exponerade PL.; två antennstift används, med plasma introduktion antennen illustrerad med en rosa stjärna. C) PBS (blå) tvättning genom aspiration används för att undvika kontaminerande plasmabehandlad region med PL. D) Leverans av PLL-g-PEG (röd ) genom aspiration för att belägga de plasmabehandlade områdena E) cellbelastning. samtidig mikroflödes ordnande av nervceller till båda flankerande fack genom aspiration, F) media (rosa) perfusion med en hydrostatisk-driven flöde G) Isolerade fluidiska behandlingar.; perifer behandling av ett testmedel (svart) levererade från botten flankerande inlopp genom aspiration och H) central behandling levereras från botten centrala inloppet genom aspiration. Bild och legenden återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Klicka här för att visa en större bild.
Omedelbart efter plasma limning PDMS mikroflödessystem kanaler är mycket hydrofila (kontaktvinkel ≤ 5 °). Sådana ytor är lämplig för vidhäftning och kultur av cellinjer såsom differentierade humana SH-SY5Y-neuron-liknande celler. För ex vivo-odling av primära neuroner och kulturen av neuronala prekursor cellinjer såsom Lunds humant mesencephalic cellinje (LUHMES) en polyamin beläggning, antingen polylysin (PL) eller polyornitin (PO), krävs som en elektrostatisk ankare. Dessutom vidhäftningsproteiner såsom laminin eller fibronektin krävs ofta som integrin-gränssnitt beläggning. Men PL och PO beläggningar binder lätt nervceller, vilket hindrar mikroflödes leverans till array platser och även införa oönskade skjuvspänningar. För att lösa detta problem på-chip biomaterialmönstring krävs för att lokalisera vidhäftningsmaterial på trap platser och utväxt mikrokanaler. Detta främjar också utvecklingen av inter-fack-anslutningar och minskar lokala sammanflätning. Protokollet innebär också tillägg av PEG-material till angränsande områden för att se till proteiner och nervceller är begränsade till de önskade platser under långa kultur. Följande protokoll är dokumenterad i figur 3:
Figur 3. Vatten maskering för biomaterial mönstring av plasma stenciling. A) Illustration av vattenmaskeringsprocessen med PDMS micropillars sätter vatten menisk i stället för plasma stenciling. Krökning av menisken i vertikalplanet har försummats. B) Vattenmask visualiseras med ett rött färgämne och positioneras menisk pinningen. C) Den mönstrade PL-FITC beläggning avbildas efter plasma stenciling. D) Tillsats av protein avvisa och cellavvisande PLL-g-PEG-TRITC till en plasma-mönstrad PL-FITC beläggningen. Detta användes för registrering av SH-SY5Y-celler och även för mönstring av ett ytterligare fibronektin skikt för LUHMES celler. Bild och legend återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klicka här för att visa en större bild.
- Vatten Maskering för in situ Biomaterial Mönstring av Plasma Schablon
- Kort efter plasma limning pipett en 0,5 l volym av PL eller PO (100 mikrogram / ml i 1x PBS) i den nedre mitten porten. Inom några sekunder hela mikroflödeskretsen fylls av kapillärkraften. Låt stå i några minuter för att helt belägga hydrofila PDMS ytor med polyagruvor.
- Avlägsna obunden polyamin-molekyler genom aspiration driven tvättning med 1 x PBS (se figur 2C) för 1 min.
- Ta bort alla PBS från hamnarna och värma upp enheten genom belysning med ett mikroskop. Detta ökar avdunstningen från hamnarna för snabb vattenmask bildning. Vattnet mask (illustreras i figur 3A och dokumenteras i figur 3B) är etablerad inom ~ 5 min.
- Inspektera enheten i mikroskop för att säkerställa vatten maskering är klar. Observera reservoar strukturerna uppströms av arrayen site ingår i maskdesign för att förlänga stabiliteten hos vatten mask (~ 15 min).
- För in stift av rostfritt stål i portarna (Figur 2B). Dessa används för att koppla den plasma som alstras av en atmosfärstryck handhållen koronaurladdning eller Tesla generator (t.ex., som arbetar vid 2 MHz, 30 kV signal) 19,20 in i de vakanta mikroflödeskanaler. Rikta spetsen på tHan plasma källa nära spetsen av ett stift och plasma behandla mikro för ≤ 1 sek. Använd svagt ljus för att observera plasma mönstring.
- Ta bort vattenmask med ett tvättsteg. Använd parallell strävan från de övre 3 portar. Använd 4 lika stora längder av silikonslang som förbinds med en 4-vägs adapter till en aspirationspump för att uppnå parallell aspiration. Starta aspiration och fördela PBS i de nedre 3 portar för att dra PBS genom mikroflödeskretsen. På detta sätt en PDMS-polyamin material kontrast produceras (se figur 3C). Evakuera PBS från mikroflödeskretsen och låt stå i flera timmar för att återställa de infödda, hydrofoba tillstånd. Detta gör PDMS helt icke-tillåtande till celladhesion.
- Skulle ytterligare vidhäftningsmaterial, såsom laminin och fibronektin, behövs följande steg behövs och bör göras omedelbart efter avlägsnande av vatten mask: pipett en 10 pl volym av transplantatet co-polymer poly-L- Lysin-poly (etylenglykol) (PLL-g-PEG, 100 ^ g / ml, i PBS) i de båda undre flankerande kanaler, följt av aspiration från de övre flankerande kanaler för 2 min.
- Utan att avbryta flödet, avlägsna överskott av PLL-g-PEG genom utbyte med en PBS-buffert. Detta selektivt rockar de icke-polyamin belagda regioner med PEG-delen som verkar för att förhindra protein adsorption och celladhesion 17,21.
- Vidhäftningsproteiner såsom laminin eller fibronektin kan sedan samlokaliserade med poly-amin beläggning: Pipettera 10 | il volymer av dessa ECM-proteiner (typiskt 10 ^ g / ml) i alla tre bottenanslutning. Sug från de tre hamnarna tills enheten är fylld med proteinlösning och inkubera i 1 timme för att ge en god kvalitet beläggning.
- Ta bort överflödiga proteiner genom att aspirera PBS från botten 3 portar.
- Microfluidic Single Neuron ordnande
- Prime apparater med lämpåt media. Lägg 20 il volymer till botten 3 portar samt genom parallell strävan från de övre tre hamnar snabbt fyller mikroflödeskrets med media. Använd en 4-vägs slangkopplingen att koppla de tre övre öppningarna via lika längd silikonslang till en aspirationspump.
- Tillsätt 20 | il av en uppdelad cellsuspension (1 x 10 6 celler / ml) till var och en av de flankerande inloppsportar (0, i Figur 1).
- Utrusta en aspirationspump med en flödesregulator eller använda en spruta för försiktig uppsugning från de övre 3 portar. Komplett neuron grupperings kräver vanligen 1 min.
- Harvest överskott nervceller kvar i de 4 flankerar portar med en pipett för arraying i efterföljande mikroflödessystem enheter.
- Avlägsna slangen. Fyll alla portar med media och placera enheten i inkubatorn. Inom några timmar blir cellerna fullständigt vidhäftande på biomaterialet mönster.
- Neuron Kultur, Selektiv Fluidic behandling, och Immunostaining
- Byt ut media genom periodisk perfusion hjälp av hydrostatisk matning (en 2 mm spalt höjdskillnaden är lämpligt långsam).
- Alternativt dränka mikroflödessystem enheten i media, utbyta media med jämna mellanrum (2-3 dagar) som med vanliga cellkulturer.
- Selektiva fluidic behandlingar till antingen neuron kultur utrymmet eller den centrala neuritutväxt utrymmet uppnås på följande sätt: Tillsätt 20 | il av testsubstansen in i bottenöppningen hos kanalen av intresse, och aspirera från porten direkt ovanför. För långa behandlingar minskar flödet genom att använda en flödesregulator och fylla testämnet efter behov.
- Immunfärgning protokoll varierar för varje molekylärt mål och tillhörande reagenser. I syfte att motverka den potentiella risken för skjuv-inducerad skada på nervceller en långsam flödeshastighet användes. Detta resulterar i ökade ansökningstider till fullo BEGJUTA systemet, utvidga normala protokolltider. Hydrostatic perfusion använder portar med olika kolumn höjder (t.ex. genom 2 mm) användes för att leverera reagens. Snabbare reagenstillsats och avlägsnande med användning av en pump kan användas för att minska experimentella tidsskalor. Anslut en aspirationspump till de övre 3 portar för att dra reagenser från de nedersta 3 portar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vatten maskering bedrifter ytspänning. Toleransen trycket vid luft-vätskegränssnittet skalor omvänt med krökningsradien [ 
, Som producerar mycket stabila gränssnitt på mikroflödes dimensioner. De micropillars effektivt förankra vatten masken på plats. Vatten mask bildning drivs av avdunstning från mikroflödes hamnarna, med den räntesats ökade med uppvärmning. Med hjälp av värme från låg förstoring (4x - 10X) mikroskopi belysning, vattnet masken typiskt upprättande i ≤ 5 min. Avdunstning leder också till en eventuell kollaps av vatten mask. För att öka livslängden på vatten mask till ~ 15 min (praktisk för plasma Schablon), 18 nl reservoar strukturer har placerats uppströms om odlings fack. Graden av vatten mask bildning och kollaps kan variera, och intermittent observation rekommenderas för att identifiera en lämplig period för plasma treatment. Icke desto mindre kan flera enheter framställas samtidigt.
Plasma stenciling kräver ~ 1 sek. Användningen av långa behandlingar förångar vattnet masken, vilket leder till överdriven plasma sönderfall polyaminen beläggningen. Vid tillfälle otillräckliga plasmabehandlingsresultat, vilket intakta polyamin beläggningar på intilliggande mikrokanalväggen (se figur 3D) som kan stödja neuron vidhäftning 12. Ändå klädd mus kortikala neuroner hade en mönstring verkningsgrad 89,5% 12 efter kultur i 6 dagar. Denna effektivitet är likvärdig med PL / PEG mönster på plana underlag. Biomaterial mönstring har den ytterligare fördelen att främja utväxter i neurite mikrokanaler. Med biomaterial mönstring utväxter förlängas inom ~ 90% av mikrokanalerna, medan med en kontinuerlig polyamin beläggnings utväxt nivåerna reducerades till ~ 70%. Med hjälp av kortikala neuroner, var 7 dagar av i-chip kultur krävs för VÄXA URTHS att spänna båda avdelningarna (ett avstånd på 500 nm). Differentierade humana SH-SY5Y nervceller hade högre utväxt priser, upprättande av anslutningar i 4-6 dagar. Kortikala, LUHMES och SH-SY5Y nervceller har odlats i upp till 2 veckor. Det är tillräckligt lång tid för spontan elektrofysiologiska funktion som ska uppnås och kan indirekt mätas med Ca 2 + avbildning. Detta skulle validera den utbredda tillämpningen av biomaterial mönstring och mikroflödes ordnande metoder för att fastställa funktionella neuronala nätverk.
Menisken-pinning strukturer har dock främja neurite fastna (se figur 4C). Fynd Edge är ett vanligt inslag i axoner odlade på mikrostrukturerade ytor 22. För att förhindra en sådan sammanflätning och ytterligare främja bildandet av inter fack anslutningar, kan menisk-pinning pelarna slås samman med mikrokanalväggen (dvs. inte längre fristående). Dessutom utväxteri den centrala mikroflödeskanalen kan oorganiserad. För experiment som kräver linjär anslutning, kan den centrala kanalen tas bort (se maskdesigner i Dinh et al. 12, kompletterande information). Denna krets kräver seriella ordnande av den första kammaren, följt av en period (t ex, 4 timmar) för celladhesion eller s.k. cellulär ventilsystem 14 för att göra kretsen permissiva för grupperande celler i den andra kammaren.
Den mikroflödesKretsen ger förprogrammerade fluidic verksamhet. De olika funktioner bestäms av valet av port för att ladda reagens eller gränssnitt med slangar eller tips. Detta undviker behovet av komplicerade, kostsamma och utrymmeskrävande återkopplingsstyrd instrumentering för att göra tekniken mycket tillgänglig för neurobiologists. Circuit design är kritiskt beroende av optimala relativa mått för att uppnå mikroflödes arraying 12-14. Små förändringar kan hindra circuit från att fungera, och vi rekommenderar därför initiala användare av protokollen att använda sig av de fritt tillgängliga mönster 12. Med en optimal krets, är mikroflödes enda neuron ordnande snabb, med ~ 100 nervceller klädd i varje odlingskammare på mindre än 1 minut. Trots det begränsade antalet nervceller, är den lokala tätheten fortfarande motsvarar standard kulturer för att ge tillräckligt med livsuppehållande signaleringsnivåer. Som dokumenterat i figur 4B detta tillvägagångssätt ger effektivt 1 neuron per fälla (1,14 ± 0,09) 12. Dock är inte alla nervceller klädd. Den mikroflödesKretsen genererar parallella strömlinjer, så att nervceller som anländer i de yttre regionerna av laminärt flöde fortsätter att serpentinkanalen. Trots det presenterade systemet är 10-100 gånger mer ekonomiskt med celler än befintliga compartmentalized system. Utvisas celler kan skördas från de hamnar och slangar. I framtida konstruktioner, uppströms deterministisk sidoförskjutningstrukturer 23 kan användas för att avleda alla celler i grupperings effektiviserar för absolut cellulär ekonomi.
Figur 4. Microfluidic neuron ordnande. A) Manual aspiration med hjälp av en spruta används för skonsam neuron ordnande. En 4-vägsslangkopplingen används som gränssnitt sprutan med de övre 3 portar för samtidig neuron arraying i båda avdelningarna. B) Differentierad neuron-liknande humana SH-SY5Y celler och andra nervceller är klädd med en enda cell precision (en neuron per fälla ). C) Efter 5 dagar av kultur, neurite förlängningar koppla samman de två kulturerna. Kärnor färgades med DAPI och aktin-immunofärgning användes för att visualisera utväxter. Modifierad figur och legenden återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry (RSC)
En viktig funktion i compartmentalized system är förmågan att selektivt behandla enskilda cellpopulationer för att undersöka materialhandel och långväga signalering. Men metoder som finns i litteraturen är antingen otillräckliga för fluidic isolering eller dåligt beskrivna. Den fluidic isolering metod som vi har utvecklat gör det möjligt för snabb leverans (<1 min) av testsubstanser och långvarig fluidic isolering (> 1 tim) 12. Resultaten dokumenteras i figur 5. Denna förmåga är möjligt genom en kombination av kretskonstruktionen och genom att använda aspiration för att leverera testsubstansen. Detta är i motsats till vätskeinjektion med användning av antingen en sprutpump av genom hydrostatiskt flöde. Trots den höga fluidmotståndet hos neuritutväxt kanaler, dessa metoder alstra konvektionsströmmar vägar thatt snabbt skingra testsubstanser och förorena hela enheten. Aspiration från övre porten samverkar också med vätska hela kretsen (en funktion som central till differentialmotstånd arraying princip). Men i detta driftsätt, är medier dras från någon annanstans i kretsen för att späda testsubstans istället för att dispergera den. Med tanke på den extrema fluidic motstånd (relativ) av neuritutväxt kanaler, är nivån av utspädning obetydlig. För experiment som innebär inrättande av diffusion gradienter, kan aspirationsmetoden användas för att selektivt behandla en avdelning, med flödes upphörande som används för att initiera den tidsberoende utvecklingen av den kemiska gradienten.
Figur 5. Selektiva fluidic behandlingar. A) Spray-drivna selektiva behandlingar av tHan central och B) som flankerar fack. Pilen visar den enda port som används för aspiration. Behandlingar var etablerade i ett min (röda linjer) och bibehölls under hela experimentet; 60 min (blå linjer). Modifierad figur och legenden återges med tillstånd av Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikroflödesgrupperings teknik är den första i sitt slag som gör det möjligt för upprättande av minimalistiska kulturer precision enda neuron hantering. Tillsammans med in situ biomaterialmönstringsmetod, en kraftfull metod för att justera cellmönster med mikroflödesstrukturer, dessa minimalistiska kulturer har höga intercompartment anslutningsnivåer med minskad lokal sammanflätning. Dessa funktioner kan användas för effektiv undersökning av mellanutrymmet transmission, och med enkla konstruktionsändringar har potential att isolera enskilda axoner för visualisering och kvantitativ analys. Till exempel, i nästa generation designar treudd strukturer kan ersättas med en utväxt kanal per neuron att minska sannolikheten för att flera axoner som bildar buntar. Dessa möjligheter kan vara till stor nytta en mängd olika neurovetenskap tillämpningar, inklusive; nanoparticulate toxicitet 24 och mangan förökning 25, aktivitets synchronization i epilepsi, spridning av smittämnen såsom prioner 26, amyloid beta (Ab) sändning i Alzheimers sjukdom 9 och alfa synuklein i Parkinsons sjukdom 27.
En annan uppenbar fördel med mikroflödesgrupperingsmetoden är förmågan att bedriva forskning med låga överflöd neuron delpopulationer snarare än komplexa heterogena kulturer. Till exempel, dopaminerga substantia nigra neuroner lämpliga för Parkinsons forskning eller perifera nervceller som endast kan isoleras i litet antal är fortfarande tillräckligt för upprepade studier med mikroflödessystem plattform. Andra sällsynta cellanvändnings exempel är utredningen av grunden för hörselnedsättning med hjälp av en experimentell arrangemang av hårceller co-odlade med spiral ganglierna nervceller, eller studier med inducerade pluripotenta stamceller från människa. Likaså är låga krav cell i systemet gör detlätt möjligt att genomföra experiment med nervceller från miniatyr Drosophilia melanogaster hjärna 28 och på så sätt utnyttja fördelarna med denna kraftfulla genetiska modell.
Det andra perspektivet är att pragmatism av cellulära ekonomi och liten enhet fotavtryck som gör hög genomströmning forskning hanterbar. Varje tillstånd och replikera kräver minimal nervceller, en funktion som kan användas för att oerhört minska antalet djur i linje med den pågående 3R-initiativet. Till exempel kan dosrespons analys av en stor panel av föreningar skall utföras med användning av ett enda djur. Typer av skärmen inkluderar toxicitetstestning och utredningen av bibliotek av siRNA eller farmakologiska agenter för deras effekt på långväga handel och signaltransduktion. Sammanfattningsvis de beskrivna protokollen förlänga försöksräckhåll för hjärnforskare, som erbjuder möjligheten att leverera hög genomströmning, kvantitativ och statistikbundsförvant kraftfull data med enkel och subcellulär upplösning. Detta och många andra stora utvecklingen inom området neurovetenskap kommer att leda till nya insikter i mekanismer bakom neuronal utveckling och funktion, samt patologiska processer som orsakar sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Ulrich Marggraf (ISA) för SU-8 tillverkning och Maria Becker (ISA) för SEM avbildning. Forskningen har genomförts med finansiellt stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), en Bundesministerium für Bildung und Forschung bidrag (BMBF 0101-31P6541) och av Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf tackar Internationella Leibniz forskarskolan "Systembiologi Lab-on-a-chip" för ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm biopsy punches | Kai Medical | Handle with care - extremely sharp | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way tubing connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polylysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Polyornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted fluorescent microscope | |||
| Example aspiration pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand held corona discharge device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto plasma oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum dessicator or centrifuge |
References
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
