Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Abstract

Campenot odasının mikrofluidik düzenlemeleri nörobilim eden büyük ilgi çekmiştir. Bunlar birbirine ko-kültür platformları enfeksiyon ve hastalık yayılması için gelişimsel ve fonksiyonel nörobiyoloji kapsayan, çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Ancak, geleneksel sistemleri önemli hücresel primer dopaminerjik substantia nigra, spiral ganglionlar ve Drosophilia melanogaster nöronlar gibi düşük bolluk hücrelerini inceleyerek yetersiz girdileri (bölmesi başına binlerce), ve yüksek verimlilik deney için pratik gerektirir. Kültürler de son derece yoğun yerel olarak iki kültür birbirine az çıkıntılar (<% 10) ile, dolanmış edilir. (I) microfluidic tek nöron yöntemi arraying ve plazma desenlendirme biyomateryal kaplamalar REGI için (ii) bir su maskeleme yöntemi: Bu yazıda basit mikroakışkan ve desenlendirme protokoller bu sorunları ele tarif edilmiştirnöronlar ster ve bölmeler arasında gelişimini teşvik eder. Minimalistik nöronal ko-kültürler yüksek düzeyde (> 85%) intercompartment bağlantısı ile hazırlandı ve tek bir hücre hassasiyet ile yüksek verimli neurobiology deneyleri için de kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nöronal doku oldukça karmaşıktır; uzaysal hücre kişiler ve özellikle akson ve dendrit çıkıntılar aracılığı ile tanımlanan katmanları ve bölmeler içinde ve plastik bağlantı ile sipariş heterojen bir hücre karışımı. Yeni teknikler derin anlayışlar ve hastalık, gelişme ve sağlıklı fonksiyonu merkezi unravel mekanizmaları kazanmak için daha fazla deneysel özgürlüğünü engellemediği için gereklidir. Campenot odası 1,2 ve daha yakın zamanda mikrofabrike düzenlemeleri 3,4 seçici olarak farklı somatik popülasyonları karıştırmayı ve aynı zamanda nörit çıkıntılar yeteneği ile ağ nöronal ko-kültürler ex vivo hazırlanması için kullanılabilir. Bu mikroakışkan cihazlar, örneğin kimyasal 5,6 ya da lazer axotomy 6-8, tauopathy 9, viral yayılması 10,11 ve akson 4 mRNA lokalizasyonu aşağıdaki akson dejenerasyon ve rejenerasyon incelemek için kullanılmıştır.

ent ">

Neurobiologists ulaşmak uzatmak için, teknolojik gelişmeler minimalist nöronal co-kültürler hazırlamaları gerekmektedir. Bu, tek hücre ve hücre altı hassas sistemin soruşturma için nöronal ağ çözülmesini sağlar. Minimal hücre sayıları için gereklilik, Parkinson hastalığı, kulak spiral gangliyon, periferik dopaminerjik nöronlar için ilgili substantia nigra hücreleri dahil seyrek hücre tipleri, analiz etmek ve kök hücreler imkanı açar. Bunun ötesinde, hücresel ekonomi 3R'si girişimi alakalı. Bu mikroakışkan platformları, büyük ölçekli toksisite ekranları veya diğer yüksek verim kullanma, hayvan nöronlar gerektiren veri zengin deneysel serisi şimdi kabul edilebilir.

Bu yazıda mikroakışkan cihazın imalatı ve kullanılması için protokolleri açıklanmıştır. In situ biomateri bir kombinasyon halinde mikroakışkan arrayingal desenleme yöntemi minimal hücre numaralarını kullanarak son derece birbirine bağlı nöronal ortak kültürlerin kayıt için kullanılabilir. Mikroakışkan arraying bir diferansiyel akış yaklaşım mikro yapılı pnömatik gevşetmeli bir yapı trans devresi (Şekil 1 'de SEM görüntüleri ile birlikte gösterilmiştir) içinde yer alan bu sayede 12-15, dayanmaktadır. Nörit gelişimi kanal girişleri - yol 0 1 → mikrostrüktürlü delik doğrusal bir dizi nöronlar taşınması için alt akışkan bir direnç (R2> R 1) sahiptir. Tek bir hücre tarafından tuzak doluluk yerel komşu tuzakları sonraki hücreleri yakalama için akıcılık aktarmak akışını engellemektedir. Dizideki tuzakları tam doluluk fazla nöron uzaklaştırılması için işlemin bir bypass moduna üretmek için kavisli bir yolda (0 → 2) içine akıcılık aktarmak için akışkan oranını (R 1> R 2) geçer.


Şekil 1.. Mikroakışkan Devre. Nörit gelişimi kanalları ile birbirine kültür odaları sınırdaş olan tek nöron arraying A) diferansiyel direnç akışkan devresi,. B, menisküs iğneleme micropillars ile iki tabakalı bölümlere nöron ko-kültür dizinin C) SEM görüntüleri. Bu tasarım sayesinde, trident şeklinde nöron hapsi yapılar nörit çıkıntılar fasikülasyon teşvik etmek için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Düzlemsel alt-tabakalar üzerinde micropatterned nöronal ağların hazırlanması kolayca exampl için (elde edilebilir Bizim gruptan es, Frimat vd. 16 ve Heike ve diğ. 17) bkz. Ancak, PDMS cihazlar içinde ve microfluidic kanalları bu mikrometre çaplı uyum şartı ile biyoaktif malzeme desen özetleyen bir büyük bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bölüm 3.1 'de bir protokol in-çip ya da in situ olarak, biyo-malzeme desen hazırlanması sunulmuştur. Bu desenler uzun kültür timescales sırasında nöron kayıt etkinleştirmek ve bölmeler arasında çıkıntılar teşvik. Menisküs-çivileme mikro nöron siteleri ve nörit gelişimi kanalları arraying ile adlandırılan bir su maske hizalamak için kullanılır. Maruz kalan yüzeyleri, biyo materyal bir modelin oluşturulması için parçalandı oysa su maskesi, plazma muamelesi esnasında yapışma molekülü kaplamalar korur. Buna ek olarak, protokoller, hücre kültürü için ve farklı ko-kültür bölmelerin seçici tedavisi için gerekli olan akışkan izolasyonu için temin edilmiştir.

ve_content "> protokoller Benzer şekilde, yerinde biyomalzeme desenleme buharlaşma ve yüzey gerilimi olayları istismar, basittir. poli çoğaltma (dimetilsiloksan) (PDMS) mikroakışkan cihazlar 18 için yumuşak litografi kullanıcı dostu ilkelerini güçlendirmek için tasarlanmıştır ve yalnızca ucuz bir el plazma kaynağı gerektiren. microfluidic devre bu operasyonları yapma etkili programlar hücre yükleme ve kompartman spesifik tedaviler sadece doğru alt portuna maddelerin dağıtımı ve yukarıdan aspire meselesi. Bu şekilde, bu neurobiologists vermek için tasarlanmıştır kendi laboratuarlarında microfluidic cihazlar hazırlamak ve kullanmak için özgürlük.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokoller nörologlar için tasarlanmıştır, ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Gibi ticari ya da kurumsal tesisler için dış kaynaklı olduğunu PDMS çoğaltma için kullanılan SU-8 ustaları bu mikroimalat tavsiye ederiz. İki katman maskesi tasarımları Kimya sitesinde 12 Royal Society hakkında ek bilgi (ZIP) olarak serbestçe kullanılabilir. Önemli olarak, birinci tabaka, SU-8 2,5-3,0 um derinliğe kadar imal edilmiştir ve 25-30 um'lik bir derinliğe kadar ikinci olmalıdır. Bu etkili nöron arraying için gerekli temel boyutları vardır. 3 mikron veya açısal nöronlar iki bölme 12 arasında taşınan veya göç önlemek için de gereklidir.

PDMS'nin 1. Mikroakışkan Cihaz Çoğaltma

  1. 10:1 'lik bir oranda sertleştirme maddesi (184) ile iyice karıştırın PDMS prepolimer ve tipik olarak 20 dakika boyunca bir vakumlu desikatör içinde edilen karışım gaz çıkışına. Alternatif olarak, karışımı koymakbir 50 ml Falcon tüpüne ve düşük g kullanımı ture Gaz çıkışı için santrifüje.
  2. 80 ° C ocak üzerinde 2 katmanlı mikrostrüktür SU-8 gofret yerleştirin ve gofret üzerindeki her bir aygıta polimer çerçeveleri hizalayın. ≥ 5 mm derinliğe çerçeve içine dökün ve PDMS> 1 saat tam sertleşmesini sağlamak için ısı sağlar.
  3. Tedavi kez, ocak gelen gofreti çıkarın ve düz bir yüzey üzerinde soğumasını bekleyin.
  4. Nazikçe ödül gofret çerçeve ve PDMS için sert bir neşter ile (uzakta SU-8 mikroyapılarda itibaren) bir köşesinden koruyucu gözlük ve iş giyin.
  5. Çerçevesinden PDMS kalıp kaldırmak ve aşırı PDMS'nin cihaz Döşeme bir makas kullanın. PDMS ince bir film polimer çerçeve ile gofret yüzeyi arasında yayılır, bu sözde yanıp sönen sıklıkla üretilir.
  6. Kalan PDMS tüm gofret uygulanır ve depolama sırasında gofretin korumak için tedavi edilebilir. Önceki sonraki cihaz kalıplama bu kaldırmak ve bunu yaparken herhangi bir p kaldırınyüzeyinden kirletici ifade.

2.. Cihaz Montaj ve Arabağlantı

  1. 3 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak 6 arayüzü liman hazırlayın. Iyi ışık koşullarında ve mikroakışkan kanalları ile limanların uyum yardım için yukarı bakacak mikrostrüktürlü özelliklere sahip, karanlık bir yüzey üzerinde çalışın.
  2. Partiküller için aygıtı kontrol edin. Tersinir yapışkan bant kullanarak bu çıkarın.
  3. , Bu esnek bir tabanı üzerine PDMS-sertleştirme ajanı karışımının (10:01, 601) küçük bir hacmi (~ 0.5 mi) dökülerek hazırlanır: mikroakışkan devresi, bir cam lamel üzerine monte edilen bir ince PDMS tabaka kullanılarak kapsüllenmiştir bakteriyolojik dereceli Petri. Yavaşça, PDMS tabakası üzerine bir lamel basarak birkaç dakika için ocak ve termal kür üzerine yerleştirin. Çabuk soğutulduktan sonra, Petri kabı lamel PDMS bilayeri kesip ödül için bir neşter kullanabilirsiniz. Gerekirse makasla kesin.
  4. Plazma bağ PDMS cihazıve iyi bir sızdırmazlık üretmek için destek katmanı: Optimum koşullar alet özeldir. Örneğin, 40 saniye boyunca 0,2 mbar oksijen atmosferinde 70 W ve 40 kHz'de çalışan bir plazma fırın mükemmel bir PDMS-PDMS bağı oluşturur. Plazma tedavi kez, her iki parçayı bastırarak ve tam bağ için bir dakika bırakın.
  5. Pompaları ve şırınga ile arayüzü için silikon tüp (3,2 mm OD 1,6 mm ID) kullanın.

3.. Biyomateryal desenlendirilmesi mikroakışkan İşlemleri

In situ biyomateryal modelleme, nöron kültür ve akışkan tedaviler için protokoller, Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 2,
Şekil 2.. Illustrated mikroakışkan protokolleri. A) PL ve PLL-PEG-g-yapıya model verme; hücre yapışma tabakasının ilavesi (örn.,PL, yeşil), buharlaşma hizalanmış su maskeyi B) maruz PL Atmosferik hava plazma tedavisi üreten.; İki anten pin. C) PBS aspirasyon ile (mavi) ile yıkama PLL-PEG-g PL. D) Delivery (kırmızı ile plazma ile muamele edilmiş bölge kontamine olmasını önlemek için kullanılan pembe bir yıldız ile gösterilen plazma giriş anten ile kullanılır, ) kaplamak için aspirasyon plazma tedavi bölgeler E) Hücre yükleme ile.; aspirasyon hem komşu bölmelerin nöronların eşzamanlı microfluidic arraying, bir hidrostatik tahrikli akış G) İzole akışkan tedaviler kullanılarak F) medya (pembe) perfüzyon.; Bir test maddesi (siyah) çevresel tedavi aspirasyon ve aspirasyon ile alt merkez girişinden verilen H), merkezi işlemi ile alt yan girişten verdi. Şekil ve efsane Kimya Royal Society izni ile yeniden(RSC) 12. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

PDMS mikroakışkan kanalları yapıştırılarak hemen ardından plazma (temas açısı ≤ 5 °) derece hidrofilik vardır. Bu tip yüzeyler örneğin farklılaşmış insan SH-SY5Y nöron benzeri hücreler gibi hücre hatlarının yapışması ve kültürü için uygundur. Birincil nöronlar ve bu Lund mezensefalik insan hücre hattı (LUHMES), bir poliamin kaplama, polilisin (PL) veya poliornitin (PO) ya da ön-madde olarak nöronal hücre çizgilerinin kültürünün ex vivo kültür, bir elektrostatik çapa olarak gereklidir. Buna ek olarak bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri sıklıkla integrin arabirim kaplama olarak gereklidir. Ancak, PL ve PO kaplamalar kolayca dizi sitelerine mikroakışkan teslim engelleyen ve aynı zamanda istenmeyen kayma gerilmeleri heybetli, nöronlar bağlamak. Bu sorunu çözmek için-çip biyomateryaldesenlendirme tuzak siteler ve akıbet mikrokanalların de yapışma malzemeleri lokalize için gereklidir. Bu, aynı zamanda ara bölmesi bağlantılarının gelişimini teşvik eder ve yerel dolanması azaltır. Bu protokol, aynı zamanda proteinler ve nöronlar uzun kültür sırasında istenen yerle sınırlı olduğundan emin olmak için, komşu bölgelere PEG maddelerin eklenmesini içerir. Aşağıdaki protokol, Şekil 3 belgelenmiştir:

Şekil 3,
Şekil 3.. Su plazma neticede tarafından biyomalzeme desenlendirme için maskeleme. A) PDMS micropillars plazma neticede yerinde su menisküs çivileme ile su maskeleme sürecinin İllüstrasyon. Düşey düzlemde menisküsün eğrilik ihmal edilmiştir. B) su maske menisküs p kırmızı bir boya ile görüntülenmiştir ve konumlandırılmışprotein plazma neticede. D sonra görüntülü atış. C) desenli PL-FITC kaplama) eklenmesi plazma desenli PL-FITC kaplama reddeden ve hücre itici PLL-g-PEG-TRITC. Bu SH-SY5Y hücrelerinin kayıt için ve aynı zamanda LUHMES hücreler için ek bir katman fibronektin desenlendirme için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

  1. Plazma neticede tarafından In-situ Biyomateryal Desenlendirme Su maskeleme
    1. Kısa bir süre sonra, plazma yapıştırma pipet orta alt bağlantı noktasına PL ya da PO (100 ug / ml içinde 1 x PBS) içinde bir 0.5 ul hacim. Birkaç saniye içinde tüm mikroakışkan devre kılcal hareket ile doldurulur. Birkaç dakika bekletin Polya ile tam kat hidrofil PDMS yüzeyler içinmayın.
    2. 1 dakika boyunca (Şekil 2C bakınız) 1x PBS ile aspirasyon odaklı yıkanarak bağlanmamış poliamin molekülleri çıkarın.
    3. Bağlantı noktaları tüm PBS çıkarın ve bir mikroskop ile aydınlatma aygıtı ısı. Bu hızlı su maske oluşumu için limanlarından buharlaşmayı artırır. Su maskesi (Şekil 3A'da gösterilmiş ve Şekil 3B'de belgelenen) ~ 5 dakika içinde kurulur.
    4. Su maskeleme tamamlanmasını sağlamak üzere mikroskobu ile cihazı kontrol edin. Dizi sitenin üst rezervuar yapılar su maskesi (~ 15 dk) istikrarı uzatmak için maske tasarımı dahil unutmayınız.
    5. Limanlar (Şekil 2B) içine paslanmaz çelik işaretçilerine yerleştirin. Bu boş mikroakışkan kanal içine 19,20 (2 MHz, 30 kV sinyal faaliyet, örneğin), atmosferik basınçta bir çift elle tutulan korona deşarjı ya da Tesla üreteci tarafından üretilen plazma için kullanılır. T ucu Noktao bir pim ve plazma ucuna yakın bir kaynak ≤ 1 saniye Mikrokanallı tedavi plazma. Plazma modelli gözlemlemek için düşük ışık koşullarında kullanın.
    6. Bir yıkama kademesinden ile su maskeyi çıkarın. Üst 3 limanlardan paralel aspirasyon kullanın. Paralel aspirasyon ulaşmak için bir aspirasyon pompası 4-yollu bir adaptör ile bağlı silikon tüp 4 eşit uzunlukta kullanın. Aspirasyon başlatın ve mikroakışkan devre boyunca PBS çizmek için alt 3 liman içine PBS dağıtmak. Bu şekilde, bir PDMS-poliamin kontrast madde (Şekil 3C) üretilir. Mikroakışkan devreden PBS boşaltın ve yerli, hidrofobik durumunu geri yüklemek için birkaç saat bekletin. Bu hücre yapışması PDMS tam geçirgen olmayan işler.
    7. Bu, laminin ve fibronektin gibi ek yapışma malzemeler, aşağıdaki adımlar hemen su maskenin kaldırılmasından sonra, gerekli olan ve yapılmalıdır ihtiyaç olmalıdır: Pipet greft kopolimerdir poli-L 'lik bir hacmi, 10 ul- Lizin-poli (etilen glikol) (PBS içinde PLL-PEG-g, 100 ug / ml) hem de alt yan kanal içine, 2 dakika boyunca, üst yan kanallarından aspirasyon ile izledi.
    8. Akışını kesintiye uğratmadan, bir PBS tamponu ile değişimi ile aşırı PLL-g-PEG kaldırın. PEG ünitesi protein adsorpsiyonu ve hücre yapışmasını önlemek için hareket 17,21 ile bu kat seçici olmayan poliamin kaplı bölgeleri.
    9. Bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri, daha sonra poli-amin kaplama ile ko-lokalize edilmiş olabilir: Bu ECM proteinleri (tipik olarak 10 ug / ml) pipetle 10 ul hacimli üç alt bağlantı noktalarına. Aygıt protein çözeltisi ile doldurulmuş ve kaliteli bir kaplama elde etmek için 1 saat boyunca inkübe kadar ilk üç limanlardan aspire.
    10. Taban 3 limanlardan PBS aspire fazla proteinleri çıkarın.
  2. Mikroakışkan Tek Nöron arraying
    1. ÖDENEK ile Başbakan cihazlarmedya yedik. Alt 3 limanlarına 20 ul birimler eklemek ve üst üç limanlarından paralel aspirasyon hızla medya ile mikroakışkan devresini doldurun. Bir aspirasyon pompası eşit uzunlukta silikon tüp aracılığı ile çift için bir 4 yollu hortum konnektörü 3 üst bağlantı noktaları kullanın.
    2. (Şekil 1 'de 0,) yan giriş delikleri her birine bir ayrıştırılmış hücre süspansiyonu 20 ul (1 x 10 6 hücre / ml) ilave edin.
    3. Bir akış regülatörü ile bir aspirasyon pompası donatmak veya üst 3 limanlarından nazik aspirasyon için bir şırınga kullanın. Komple nöron arraying tipik olarak 1 dakika gerektirir.
    4. Sonraki mikroakışkan cihazlarda arraying için bir pipet ile 4 yan bağlantı noktası kalan nöronlar fazla hasat.
    5. Boru çıkarın. Medya ile tüm portları doldurun ve inkübatör cihazı yerleştirin. Birkaç saat içinde hücreler, biyo materyal desen tamamen yapışkan hale gelir.
  3. Nöron Kültürü, Seçici Fluidic Tedavi ve Immunostaining
    1. Hidrostatik yem (2 mm kolon yükseklik farkı uygun şekilde yavaş olduğu) kullanarak periyodik perfüzyon ile medya değişimi.
    2. Alternatif olarak, standart hücre kültürleri gibi (2-3 gün) periyodik medya alışverişi, medya mikroakışkan cihaz daldırın.
    3. Aşağıdaki gibi nöron kültür bölmesinde veya merkezi nörit gelişimi bölmesine ya da tedavi için seçici akışkan elde edilir: ilgi kanalın alt portuna test maddesi 20 ul dağıtın ve hemen yukarıda limandan aspirat. Uzun süreli tedavi, bir akış düzenleme cihazı kullanıldığında akış oranını azaltmak ve gerektiği gibi test maddesini doldurmak için.
    4. Immün protokoller her bir moleküler hedef ve bağlantılı reaktifler için değişir. Yavaş bir akış hızı kullanıldı nöronlara kesme kaynaklı hasar riskini karşı için. Bu, normal protokol kez uzanan tam sistem perfüze edilmesi için artan uygulama süresi ile sonuçlanır. Hy(2 mm örneğin) farklı sütun yüksekliği ile bağlantı noktalarını kullanarak drostatic perfüzyon reaktifleri teslim etmek için kullanılmıştır. Bir pompa kullanılarak Daha hızlı reajan ilave etme ve çıkarma deneysel zaman ölçekleri azaltmak için kullanılabilir. Alt 3 limanlarından reaktifleri çizmek için üst 3 portlarına bir aspirasyon pompası bağlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Su maskeleme patlatır yüzey gerilimi. Hava-sıvı arayüzünde basınç tolerans [eğrilik yarıçapına sahip ters terazi , Mikroakışkan boyutlarda son derece kararlı arabirimleri üreten. Micropillars etkin yerinde su maskesi çapa. Su maske oluşumu ısıtma artmış oranı ile, mikroakışkan limanlardan buharlaştırma ile tahrik edilir. Düşük büyütme (4X - 10X) gelen ısı kullanılarak mikroskop aydınlatma, su maske tipik ≤ 5 dakika içinde kurulması oldu. Buharlaştırma, aynı zamanda su maskenin yıkılmasına yol açar. ~ (Plazma neticede için pratik) 15 dk, 18 nl rezervuar yapılar kültür bölmelerin yukarı konumlandırılmış olduğu su maskenin ömrünü artırmak için. Su maske oluşumu ve çökme oranı değişebilir ve aralıklı gözlem, plazma t için uygun bir süre belirlemek için önerilirreatment. Bununla birlikte, birden fazla cihaz aynı anda hazırlanabilirler.

Plazma stenciling ~ 1 saniye gerektirir. Uzun tedavilerin kullanımı Poliamin kaplamanın aşırı plazma dağılmasına yol açan, su maske buharlaşır. Fırsat yetersiz plazma tedavi sonuçları üzerine, (Şekil 3D bakınız) komşu Mikrokanallı duvara sağlam poliamin kaplamalar bırakarak nöron yapışma 12 destekleyebilir. Bununla birlikte, dizilmiş fare kortikal nöronlar, 6 gün boyunca kültür, aşağıdaki 89.5% 12 bir model verme etkinliği vardı. Bu etkinlik düzlemsel alt-tabakalar üzerinde PL / PEG kalıpları eşdeğerdir. Biyomalzeme desenlendirme nörit mikrokanallarda içine çıkıntılar teşvik daha da hak vardır. Sürekli bir poliamin kaplama akıbet düzeyleri ile% 70 ~ düşürülmüştür ise biyomalzeme desenleme çıkıntılar, mikrokanalların 90% ~ içinde uzatılmış. Kortikal nöronlar kullanarak, in-çip kültür 7 günü büyümek için gerekli olduHer iki bölmeleri (500 mikron kalınlığında bir mesafe) span ths. Farklılaştırılmış insan SH-SY5Y nöronlar 4-6 gün içinde bağlantılarının kurulması, yüksek akıbet oranları vardı. Kortikal, LUHMES ve SH-SY5Y nöronlar kadar 2 hafta boyunca kültüre edilmiştir. Bu, elde edilecek kendiliğinden elektrofizyolojik fonksiyonu için yeterince uzun ve dolaylı Ca 2 + görüntüleme ile ölçülebilir. Bu biyomateryal modelleme ve fonksiyonel nöron ağları kurulması için mikroakışkan arraying yöntemlerin yaygın uygulanabilirliğini doğrulamak olacaktır.

Menisküs-iğneleme yapılar ise, nörit dolanması (bkz Şekil 4C) teşvik yok. Kenar bulgu mikrostrüktürlü yüzeylerde 22 kültüre akson ortak bir özelliktir. Böyle takılmasının önlenmesi ve daha fazla ara bölmesi bağlantılarının oluşumunu teşvik etmek, menisküs-iğneleme ayağı Mikrokanallı duvarı (yani artık free-standing) ile birleştirilebilir. Buna ek olarak, çıkıntılar InMerkez mikroakışkan kanalda dağınık olabilir. Doğrusal bağlantı gerektiren deneyler için, merkezi kanal (Dinh et al. 12, tamamlayıcı bilgiler maske tasarımları bakınız) çıkartılabilir. Bu devre, hücre yapışması ya da ikinci bölme hücreleri arraying için izin veren devre oluşturmak için sözde hücre valving 14 için bir süre (ör., 4 saat) ve ardından birinci bölmenin seri arraying gerektirir.

Mikroakışkan devre önceden programlanmış akışkan operasyonlar sağlar. Farklı işlevleri boru veya uçları ile reaktif veya arayüz yüklemek için bağlantı noktası seçimi ile tespit edilir. Bu neurobiologists için tekniği son derece erişilebilir yapmak için karmaşık, pahalı ve uzay zorlu geri besleme kontrollü enstrümantasyon için gereksinimini ortadan kaldırır. Devre tasarımı 12-14 arraying microfluidic ulaşmak için optimal göreceli boyutları kritik bir şekilde bağlıdır. Küçük değişiklikler CIR önleyebilirçalışmasını CUIT ve biz bu nedenle serbestçe kullanılabilir tasarımlar 12 faydalanmak için protokollerin ilk benimseyenler önerilir. Optimal bir devre ile, mikroakışkan tek nöron arraying en az 1 dakika içinde her bir kültür odası içinde dizilmiş ~ 100 nöron ile, hızlıdır. Nöronların sınırlı olmasına rağmen, yerel yoğunluk yine de yeterli bir yaşam destek sinyal seviyelerinin temin edilmesi için standart kültürler eşdeğerdir. Şekil 4B belgelendiği gibi bu yaklaşım etkili tuzak başına 1 nöron (1.14 ± 0.09) 12 verir. Ancak, tüm nöronlar dizilir. Mikroakışkan devre laminer akışın dış bölgelerde gelen nöron serpantin kanala devam şekilde paralel akışlar oluşturur. Yine de sunulan sistem var olan sistemlere göre bölümlere hücreler ile daha ekonomik 10-100 yönlüdür. Sürgünler hücreler, bağlantı noktaları ve boru hasat edilebilir. Gelecek tasarımları, yukarı deterministik yanal deplasman23 arraying içine tüm hücreleri saptırmak için kullanılan yapılar mutlak hücresel ekonomi için kolaylaştırır.

Şekil 4,
Şekil 4. Mikroakışkan nöron arraying. A) bir şırınga ile manuel aspirasyon yumuşak nöron arraying için kullanılır. A 4-yollu boru konektör iki bölümlerinde arraying eşzamanlı nöron için üst 3 portları ile şırınga arayüzü için kullanılır. B) nöron-benzeri insan SH-SY5Y hücreleri ve diğer nöronlar tek hücre duyarlıklı (tuzak başına bir nöron ile dizilmiş Farklılaştırılmış .) C) kültür içinde 5 gün sonra, nörit uzantılar iki kültür birbirine. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve aktin immüno-boyama çıkıntılar görselleştirmek için kullanılmıştır. Modifiye şekil ve efsane Kimya Royal Society (RSC) izni ile çoğaltılabilir resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Bölümlere sistemlerinin önemli bir özelliği seçici malzeme kaçakçılığı ve uzun menzilli sinyalizasyon araştırmak için bireysel hücre popülasyonlarının tedavi yeteneğidir. Ancak, literatürde mevcut yöntemler akışkan izolasyonu için yetersiz veya kötü açıklanan ya vardır. Geliştirdiğimiz akışkan izolasyon yöntemi <(1 saat) 12 test maddeleri ve uzun süreli akışkan izolasyonun (1 dakika hızlı teslimat)> sağlar. Sonuçlar Şekil 5'te belgelenmiştir. Bu yetenek devre tasarımının kombinasyonu ile ve deney maddesinin teslim etmek için aspirasyon ile mümkün olmaktadır. Bu hidrostatik besleme ile bir şırınga pompası kullanılarak sıvı enjeksiyon tersidir. Nörit gelişimi kanallarının yüksek akışkan direnci rağmen, bu yöntemler, konveksiyon yollar t üretmekşapka hızla test maddelerini dağıtmak ve tüm cihazı kirletebilir. Üst bağlantı noktasından aspirasyon da devre (ilkesini arraying diferansiyel direnç merkezi bir özelliktir) boyunca sıvı ile etkileşime girer. Bununla birlikte, bu operasyon modu, ortam bunun yerine dağıtma deney maddesinin seyreltilmesi için başka devre çekilir. Aşırı akışkan direnç nörit gelişimi kanalları (göreli) göz önüne alındığında, seyreltme seviyesi önemsizdir. Difüzyon gradyanlar kurulmasını gerektiren deneyler için, aspirasyon yöntem seçici kimyasal gradyanın zamana bağlı gelişimi başlatmak için kullanılan akış kesilmesi ile, bir bölme tedavi etmek için de kullanılabilir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Seçici akışkan tedaviler. T A) Aspirasyon odaklı seçici tedavilero merkezi ve B) bölmeleri sınırdaş. Ok aspirasyon için kullanılan tek bir bağlantı noktasını gösterir. Tedaviler 1 dakika (kırmızı çizgi) içinde kurulmuş ve deney süresi boyunca muhafaza edilmiştir; 60 dakika (mavi çizgiler). Modifiye şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikroakışkan arraying teknik minimalist kültürleri kurulması için hassas tek bir nöron kullanım sağlar türünün ilk. Mikroakışkan yapılarla hücre desen hizalamak için in situ biyomateryal-yapıya model verme yöntemi, güçlü bir yaklaşım ile birleştiğinde, bu minimalistik kültürler azaltılmış yerel dolanması ile yüksek düzeyde intercompartment bağlantısı vardır. Basit bir tasarım değişiklikleri görselleştirme ve kantitatif analiz için tek tek aksonlar izole etmek için bir potansiyele sahip olan bu özellikler arası bölmeli iletim etkin çalışma için kullanılan ve edilebilir. Örneğin, bir sonraki nesilde trident yapılar tutamları oluşturan çoklu akson olasılığını azaltmak için bir nöron için bir sonucudur kanal ile değiştirilebilir tasarlar. Bu yetenekleri büyük ölçüde dahil nörobilim uygulamaları, çeşitli yararlanabilir; nanopartikülat toksisite 24 ve manganez yayılma 25, faaliyet synEpilepside ronizasyon, böyle prions 26, Alzheimer hastalığında 9 amiloid beta (Ab) iletim ve Parkinson hastalığı 27 alfa sinüklin gibi enfeksiyöz ajanların yayılması.

Mikroakışkan arraying yöntemin diğer bir belirgin faydası düşük bolluk nöron alt-popülasyonları ziyade karmaşık heterojen kültürler ile araştırma yapmayı yeteneğidir. Örneğin, yalnızca az sayıda izole edilebilir Parkinson araştırma veya çevresel nöronlar için uygun olan dopaminerjik substantia nigra neurons mikroakışkan platformu kullanılarak suret çalışmaları için yine de yeterli bulunmaktadır. Diğer nadir hücre uygulama örnekleri spiral ganglion nöronlar ile birlikte kültüre saç hücrelerinin deneysel bir düzenek kullanılarak işitme kaybının temelinde soruşturma veya insanlardan uyarılmış pluripotent kök hücreleri kullanarak çalışmaları içerir. Benzer şekilde, sistemin düşük hücre gereksinimleri yapmakkolayca mümkün minyatür Drosophilia melanogaster beyin 28 nöronlar ile deneyler yapan ve bu nedenle bu güçlü genetik modelin yararları kaldıraç.

Diğer bir bakış açısı hücresel ekonomisi ve yüksek hacimli araştırma yönetilebilir kılan küçük bir cihaz ayak izi pragmatizm olduğunu. Her koşul ve suret minimal nöronlar, muazzam devam 3R'si girişimi doğrultusunda hayvan sayısını azaltmak için kullanılabilecek bir özellik gerektirir. Örneğin, bileşiklerin büyük bir panelin doz tepkisi analizleri tek bir hayvan kullanılarak yapılabilir. Ekranın Türleri toksisite test ve siRNA'nın veya uzun menzilli kaçakçılığı ve sinyal iletimi üzerindeki etkileri için farmakolojik ajanların kütüphanelerin soruşturma içerir. Özetle, tarif edilen protokoller yüksek verim, nicel ve istatistik sunmak için potansiyel sunan, nörobilim deneysel ulaşmak uzatmakTek ve subsellüler çözünürlüğe sahip müttefiki güçlü bir veri. Bu ve nörobilim alanındaki diğer pek çok büyük gelişmeler altında yatan mekanizmaların nöronal gelişimi ve işlevi içine yeni anlayışlar, yanı sıra hastalığa yol açan patolojik süreçler yol açacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar SEM görüntüleme için SU-8 üretimi ve Maria Becker (ISAS) Ulrich Marggraf (ISAS) müteşekkiriz. Araştırma mali Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), bir Bundesministerium für Bildung und Forschung hibe (Bmbf 0101-31P6541) tarafından ve Ministerium für Yenilik, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen tarafından desteklenmiştir. Heike Hardelauf sayesinde Uluslararası Leibniz Enstitüsü "Systems Biology Lab-on-a-Chip" mali destek için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter