Summary
Implantasjon av en biograft å behandle hjerteinfarkt indusert av LAD ligation i en gnager modellen har konvensjonelt kreves to åpen hjertekirurgi. For å redusere dødelighet og gi optimale betingelser for fiksering av faste og geleaktige biomatrices forbundet med cellene, har minimalt invasive prosedyrer blitt utviklet.
Abstract
Cardiac celle terapi har fått økende interesse og implantasjon av biomaterialer forbundet med celler har blitt et stort problem for å optimalisere myocardial celle levering. Gnager modell av hjerteinfarkt (MI) som består av Venstre fremre nedstigende arterie (LAD) ligation har ofte blitt utført via en Thoracotomi; en annen åpen hjertekirurgi via en sternotomi har tradisjonelt blitt utført for epikardiell anvendelse av behandlingen. Siden beskrivelsen av LAD ligation modell, har etter operasjonen dødeligheten sank 35-13%, men den andre operasjonen har vært kritisk. For å bedre post-kirurgi utvinning og redusere smerte og infeksjon, er minimalt invasive kirurgiske prosedyrer presentert. To thoracotomies ble utført, den første en for LAD ligering, og den andre for behandlingen epikardiell administrering. Biografts som består av celler forbundet med faste eller gel typen matriser ble brukt på infarkt area. LAD ligation resulterte i tap av hjertefunksjonen som bekreftes av ekkokardiografi utført etter 2 og 6 uker. Goldner Trichrome flekker utført på hjerte seksjoner bekreftet transmural arrdannelse. Første og andre operasjoner førte til mindre enn 10% postoperativ dødelighet.
Introduction
Siden slutten av det 19. århundre, har hjerte-og karsykdommer forble nummer én seriemorder i industrialiserte land. Blant dem, representerer koronarsykdom hoved etiologi. De akutte fase resulterer i myokardinfarkt (MI) og etterfølges av mistilpasset remodeling som gradvis utvikler seg mot en kronisk fase og alvorlig hjertesvikt. Til tross for betydelige, teknologiske og terapeutiske fremskritt, er sykelighet og dødelighet på grunn av progresjon av hjertesvikt fortsatt vokser en. I denne sammenheng har celleterapi fått økende interesse som en ny terapeutisk alternativ for å stoppe utviklingen av sykdommen mot hjertesvikt og for å stimulere den nylig identifiserte evne til reproduksjon av myokard. Eksperimentelle og kliniske undersøkelser har gitt overbevisende bevis for de gunstige effektene som oppnås etter hjertetransplantasjon av ulike celletyper. Store utfall inkludert forbedret cardiac kontraktile funksjon, nedsatt venstre ventrikulær remodellering, redusert infarktstørrelse og økt vaskulær tetthet i infarktområdet. Men den lave cellenummer retensjon etter celleinjeksjon forble en viktig ulempe. Sammenslutning av celler med en BioMatrix å forbedre celle levering 2 har nylig fostret forsker og klinisk interesser.
Ligering av venstre fremre nedstigende koronar (LAD) er en referansemetode for MI i små dyremodell som resulterer i transmural infarkt og en moden arr. Celle terapi anvendes i den kroniske fase av MI krever et andre kirurgisk inngrep. En median sternotomi blir vanligvis utført for å tillate intramyocardial injeksjon av cellene eller epikardiell implantering av biografts. Slike invasive kirurgiske prosedyrer øke dødeligheten, etter kirurgi utvinning tid, smerte og risiko for infeksjon. Den minimalt invasive tilnærmingen presenteres her ikke bare hindrer en slik skjevhet, men gir også optimal tilgjengelighet av hjertet for behandling søknad. MI og epikardiell implantasjon av celler forbundet med en gel typen BioMatrix er utført på et bankende hjerte via venstre interkostal thoracotomies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Lewis Mannlige og kvinnelige rotter ble 200-220 g plassert under standard laboratorieforhold (12 t lys og mørke syklus, ad libitum vann og mat, IVC bur). Alle dyrene ble behandlet i samsvar med anbefalingene fra FELASA og sveitsisk lov om dyrevern.
1. Cell Forberedelse: Mesenchymale Stem Cell Isolasjon fra Bone Marrow
- Bedøve rotter med isofluran 5% og O 2 5 l / min i en induksjonskammeret i 5 min. Plasser dyrets snute inn i et nesepartiet som er koblet til anestesisystem. Utfør en tå eller hale knipe for å bekrefte sedasjon.
- Fjern skinnet fra benet med saks ved å kutte huden fra ankelen til hofta. Fjern musklene og kutte lårarterien for dyr exsanguination. Expose hofteleddet og forrykke femur hode. Det er viktig ikke å skade femur hode. Plasser bein i steril PBS i et 50 ml plastrør.
- Fjern alle muscles og leddbånd fra bein uten å bryte dem. MERK: Det er viktig at benet forblir intakt for å unngå kobling av flushing løsning eller forurensning med etanol. Skyll de skrelte bein i 70% etanol i 5 min.
- Under den sterile laminær hette, kuttet både tips av bein med saks. Skyll benmarg ved å injisere sterilt PBS fra benet ekstremiteten. Samle marg til et 15 ml rør. Sentrifuger 7 min ved 300 x g i.
- Fjern supernatanten. Suspendere pellet i 3 ml Red Blood Cell Lysis buffer. Inkuber suspensjon i 1 min ved romtemperatur før spinne igjen i 7 minutter ved 300 x g. I en 150 ml kultur kolbe, tilsett sterilt cellekulturmedium (395 ml IMDM medium, 5 ml pen / strep, 100 ml FBS) og frø cellene.
- Skift medium den annen dag for å fjerne ikke-adherente celler.
- Utfør mellom endringer annenhver dag i 2-3 uker før ønsket celle mengden er oppnådd.
- Alternativt forberede biograft ved frøing cellene bort på solid matrise etter behov og beskrevet andre steder tre.
- Dagen for hjerte implantasjon, forberede cellene eller høste biograft like før epikardiell søknad.
- Samle celler ved hjelp Accutase celle løsgjøring løsning. Tell cellene. Fyll en 1,5 ml sentrifugerør med volumet av cellesuspensjon beregnet å oppnå ønskede cellemengde. Sentrifuger i 7 min ved 300 xg og fjern supernatanten.
- Alternativt høste biograft fra cellekulturmedium, skyll i steril PBS, og holde seg på fersk kulturmedium uten serum.
2. Først Torakotomi og LAD Ligation
- Vei rotte. Slå på varmeputen ved 37 ° C. Bedøve rat med 5% isofluran og 5 l / min 100% O 2 i en induksjonskammeret for 5-7 min. Utfør en tå eller hale knipe for å bekrefte sedasjon. Plasser rotte på varmeputen.
- Intubere dyret med en 14G iv kateter. Koble intubasjon kateter til en gnager ventilator programmert for 2,5 l / min oksygen, 2,5% isofluran, tidevolum på 2 ml, og en pustefrekvens på 90 åndedrag / min.
- Forbered en buprenorfin løsning på 0,1 mg / kg. Injiser subkutant en tredjedel av løsningen. Barbere venstre del av brystkassen. Desinfisering med en 1% Betadine løsning.
- Incise huden vinkelrett på brystbenet på det fjerde interkostalrom. Skill de tre lagene i thorax muskler (pectoralis major, stigende pectoralis og ytre skrå pectoralis). Åpne det fjerde interkostalrom (mellom ribbene 4 og 5).
- Bruk en liten retractor å spre ribbeina og å eksponere hjertet. Åpne hjerteposen nøye. Finn og ligate venstre fremre nedstigende koronar (LAD) med en 7,0 sutur 4 mm under atrium.
- Lukk interkostalrommet med to sting med 3,0 sting. Plasser de to sting proksimalt og distalt fra sternum. Først, tighten den distale sutur. Klem ventilator eksosslangen i 2 sekunder for å blåse opp brystet og unngå pneumothorax. Stram den andre sutur. Plasser muskler lagene tilbake på plass (ingen sting er nødvendig). Lukk huden med en 5,0 sutur.
- Desinfiser sutur med 1% Betadine løsning. Injiser resten av buprenorfin løsning. Slå av anestesi system. Fjern intubasjon kateter.
- Hold rotte i bur under en varm lampe for 1-2 hr. Hold et termometer i buret og styre avstanden mellom den varme lampe og buret for å unngå overoppheting. Returnere rotte i IVC-enhet. Injisere subkutant Buprenorfin 0,05-0,1 mg / kg innlegg -operatively hver 6-12 timer i 48 timer.
3. Epikardial Administrasjon av behandling via en Second Torakotomi
- Gjenta trinn 02.01 til 02.03.
- Incise huden vinkelrett på brystbenet ved det femte interkostalrom. Separer 3 lagsS for thorax muskel (pectoralis major, stigende pectoralis og ytre skrå pectoralis). Åpne det femte interkostalrom (mellom ribbene 5 og 6).
- Bruk en liten retractor å spre ribbeina og å eksponere hjertet. Hvis det er noen tilslutning, forsiktig fjerne dem med fin pinsett.
- Finn infarktet område som fremstår som en blek området under ligaturen. MERK: Når det er nødvendig, kan du bruke en 10 cm stykke sutur (7,0) satt på toppen og til bedre visual venstre hjertekammer. Trekk forsiktig til sutur vedlikeholdes løst av en klemme for å blottlegge hjertet.
- Påfør en av følgende behandlinger:
- Plasser biograft på overflaten av hjertet. Bruke den ferdigfylte fibrinvevslim sprøyte forvarmet ved romtemperatur i 10 min. Påfør en dråpe (50-100 mL) av fibrinvevslim under biograft ved hjelp av en 25 G Luer nål. Kontroller at biograft er helt forseglet.
- Alternativt kan anvende cellepelleten oppsamlet med en pipettespiss på overflaten of hjertet på blekt område under ligaturen. Påfør en dråpe (50-100 mL) av fibrinvevslim på cellen pellet.
- Fjern stykke sutur fra spissen.
- Gjenta trinn 02.06 til 02.08.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle dyr restituert innen 1 time etter thoracotomies. Den sårtilheling var rask. Ingen infeksjon eller ødem ble observert.
Den doble venstre torakotomi tillot en optimal adkomst til hjertet (Figur 1). Smerte og dødelighet etter kirurgi var lave. Dyret utvinnes raskt fra kirurgi og gått opp i vekt (figur 2). Kaplan Meir overlevelse prosent var 96% for første Thoracotomi. Fire rotter over 104 døde i løpet av den 24-timers etter behandling søknad via et sekund Thoracotomi. Kaplan-Meir prosent overlevelse varierte fra 100% når dyret mottok en andre torakotomi, men ingen behandling (sham), 96% for MSC og fibrin-tetningsmiddel gruppe, eller 86% når dyret mottok MSC direkte injisert i hjertemuskelen (figur 3).
M-modus ekkokardiografisk evaluering utført to uker etter LAD ligation viste en reduksjon i brøk forkorting (FS) fra 44 ± 3%til 22 ± 4%. Frekvensen representasjon av FS innspilt på 104 dyr to uker etter LAD ligation tilgjengelig bevis på repeterbarhet av metoden (figur 4). Variasjonskoeffisienten (CV) var 17%. Videre ekkokardiografi utført ved 2 og 6 uker etter LAD ligation viste en progresjon mot hjertesvikt foreslått av en reduksjon av ejeksjonsfraksjon (EF) og en økning på LV volumer i diastolen og systolen (bilde 4 og 5). Utviklingen av en transmural infarkt i humbug opererte gruppen ble bekreftet av Goldner farging av hjerte tverrsnitt (figur 6).
Figur 1. (a) bruk av rullen tillates tilgang til hjertet følgende torakotomi. LAD ligering ble utført 2 uker tidligereog sutur er synlig (pil). Epikardiell behandling søknaden ble utført med minimum exteriorization av hjertet. (B) Cellene pelleten løst med fibrin-tetningsmiddel ble opprettholdt på overflaten av infarktområdet.
Figur 2. Daglig postoperativ oppfølging viste vekttap for 2 dager etter operasjonen. Recovery ble akkompagnert med vektøkning i alle dyr. Vekt variasjoner var uavhengig av hvilken type behandling.
Figur 3. Kaplan-Meir grafen representerer prosent overlevelse innlegg LAD ligation (A) og etter behandling via en sekund torakotomi (B) viste at begge operasjoner førte til redusert tap av dyr. Kontrollgruppe representerer sunne dyr som ikke hadde noen operasjon. To uker etter den første torakotomi, mottok dyrene enten en falsk operasjon, men ingen behandling (sham), fibrinvevslim alene, cellene fiksert med fibrin-tetningsmiddel, eller cellene direkte injisert i hjertemuskelen (MSC injisert).
Figur 4. (A) Representant M-mode ekkokardiografi bilder registrert pre (sunn) og to uker etter LAD ligation (infarkt). (B) Frekvens fordeling av brøkforkorting verdiene registrert to uker etter LAD ligation (n = 104).
390fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. hjertefunksjon ble vurdert av 2dimentional ekkokardiografi (biplan Simpsons metode) og spilt inn to og seks uker etter LAD ligation. Animal hadde to thoracotomies men fikk ingen behandling. Middel ± SD, så vel som individuelle verdier er representert for ejeksjonsfraksjon (A) LV volum i systole (B) og diastole (C). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en sammenkoblet nonparametric Wilcoxon test.
Figur 6. Representative Goldner flekker viser fibrotiske arr (grønn) og levedyktig hjertemuskelen (rød) på to uker (A) og 6 uker (B) innlegg LAD ligation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den permanente ligation av LAD medfører irreversible skade på hjertet. Den første dyremodell ble beskrevet i 1960 fire. Siden da har det vært ansett som en standard og egnet modell for kronisk MI. Dens stabilitet og reproduserbarhet tillatt eksperimentell evaluering av terapi for MI 5. Forbedrede prosedyrer etter den innledende beskrivelse rapporterte en operativ dødelighet på 35-13% 6.
Som forventet, LAD ligation indusert nedsatt hjertefunksjon observert innen 2 uker. En ytterligere reduksjon i hjertefunksjon ble spilt opp til 6 uker, og forbundet med transmural fibrotisk arr. I tillegg ble LV ombygging inkludert LV dilatasjon klart observert seks uker etter ligation.
Et intervall på to uker mellom den første og andre operasjon ble valgt. I denne tilstand ble den andre torakotomi lettes ved fravær av adherences, slik de var for rikelig etter 1 uke for å utføma andre kirurgi i optimale forhold. I tillegg, 2 uker representerte en optimal tidsramme for behandling påføring og tillatt å unngå tidlig bilde av inflammasjon indusert ved ischemi og å anvende behandling før dannelsen av en tett fibrotisk vev og progresjon av strekkingen.
Selv om lateral torakotomi er i dag standard kirurgiske prosedyren for LAD ligation på små dyr, er en median sternotomi vanligvis utføres for celleterapi program 7. Den presenterte andre interkostalrom Thoracotomi for behandling programmet er en roman, minimal invasiv tilnærming; det gir tilgang til hjertet gjennom ribbeina uten å kutte bein og ved å splitte muskelen. Forekomsten av tilslutning blir redusert på grunn av liten og begrenset arr etter første torakotomi, og disse ikke forstyrrer gjennomføringen av behandlingsprogrammet. Tilnærmingen førte til svært lav risiko for blødning, rask postoperativgjenvinning, lav dødelighet, smerte og risiko for infeksjon. Denne andre minimalt traumatisk fremgangsmåte varte i 20 min for kirurgi og opp til 20 min for matrisefiksering. Den raske fremgangsmåte og begrenset eksponering av hjerte minimert hjertevev tørking. Postoperativ ultralydavbildning resulterte i god kvalitet image oppkjøpet for reproduserbare målinger analyse. Det var ingen hematomer som kan svekke bildebehandling.
Tilgjengeligheten av hjertet tillot en optimal synligheten av infarkt myokardium, så vel som en god eksponering av hjertet for påføring av epikardiale behandlinger inkludert faste og gel-typen biografts 8-10.
Bruken av fibrin-tetningsmiddel presentert flere fordeler. (I) For å løse faste plaster, bruk av fibrin-tetningsmiddel var mindre traumatisk enn suturer. (Ii) sammenlignet med andre lim som Bioglue (Cryolife), fibrinvevslim var mer kompatibel enn Bioglue som dannet rigid struktur og nedsatt hjertesammentrekninger. (Iii) Det Polymerisasjonstiden var optimal for tilstrekkelig stillaset eller cellepelleten posisjonering. (Iv) fibrinvevslim tillatt utmerket initial adhesjon av solid patch. Lappen ble tett opprettholdt på overflaten av hjertet i minst 4 uker 10. (V) Fibrin tetningsmasse var lett å behandle når det brukes som et stillas for epikardiell celle levering og faste celler ble opprettholdt på overflaten av infarktområdet til slutten av den kirurgiske prosedyren. Selv om oppholdstiden for cellene var ute av fokus for denne studien, og vil kreve ytterligere undersøkelser har det blitt foreslått at matrisen muliggjør forbedret myokardial retensjon av implanterte celler 11-14. Vask av cellene under hjertestans sammentrekning, så vel som den hypoksiske og inflammatorisk miljø, kan delvis forklare den hurtige klaring. Disse ulemper kan reduseres når cellene er forbundet med en matriks.
De viktigste tekniske utfordringer gjaldt kirurgisk behandling aven solid biograft. Hvis grunnmassen er stiv og ikke- fleksible, bør fiksering med suturer bli begunstiget. Bør vurderes følgende kritiske trinn for vellykket prosedyre. Først bør en være spesielt oppmerksom under Thoracotomi å unngå å bryte ribbeina. For det andre bør overflødig lim fjernes forsiktig for å unngå etterlevelse av andre vev. Til slutt, er en standardisert ligatur posisjonering viktig da det kan redusere variabiliteten i infarktstørrelsen. En transmural infarkt kan oppnås når LAD er ligert 4 mm under atrium.
Som konklusjon, representert dobbelt torakotomi et sikkert inngrep med lav dødelighet, tilstrekkelig tilgang til bankende hjerte for behandling applikasjon, og derfor vil favorisere optimalisering av de eksperimentelle planlegging og redusert antall dyr tap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Prof Hendrik Tevaearai og Institutt for kardiovaskulær kirurgi for økonomisk støtte til den første delen av studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
- Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
- Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
- Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
- Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
- Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
- Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
- Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
- Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
- Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
- Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
- Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).
