Summary
Implantación de un biograft para tratar el infarto de miocardio inducido por ligadura de LAD en un modelo de roedor ha requerido convencionalmente dos cirugías a corazón abierto. Con el fin de reducir la mortalidad y proporcionar las condiciones óptimas para la fijación de biomatrices sólidos gelatinosos y asociados con las células, se han desarrollado procedimientos mínimamente invasivos.
Abstract
Terapia celular cardíaca ha ganado cada vez más interés e implantación de biomateriales asociados a células se ha convertido en un problema importante para optimizar la entrega de las células del miocardio. Modelo de roedor de infarto de miocardio (IM) que consiste en arteria descendente anterior izquierda (LAD) ligadura comúnmente se ha realizado a través de una toracotomía; una segunda operación a corazón abierto a través de una esternotomía tradicionalmente se ha realizado para la aplicación epicárdica del tratamiento. Desde la descripción del modelo de la ligadura de LAD, la tasa de mortalidad después de la cirugía se ha reducido desde 35 hasta 13%, sin embargo la segunda cirugía se ha mantenido crítico. Con el fin de mejorar la recuperación después de la cirugía y reducir el dolor y la infección, se presentan procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos. Se realizaron dos toracotomías, la inicial para la ligadura de LAD y la segunda para la administración epicárdica tratamiento. Biografts que consisten en células asociadas con matrices de tipo sólido o de gel se aplica sobre la ar infartadaea. LAD ligadura resultado la pérdida de la función del corazón como se confirmó por ecocardiografía realizada después de 2 y 6 semanas. Tricrómico de Goldner tinción realizó en secciones del corazón confirmó la formación de cicatriz transmural. Primera y segunda cirugías resultaron en menos que 10% de mortalidad post-operatorio.
Introduction
Desde finales del siglo 19, la enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de muerte en serie en los países industrializados. Entre ellos, enfermedad de la arteria coronaria representa la etiología principal. Los resultados de fase aguda en el infarto de miocardio (MI) y es seguido por la remodelación de mala adaptación que se desarrolla progresivamente hacia una fase crónica e insuficiencia cardíaca severa. A pesar de los últimos avances tecnológicos y terapéuticos significativos, la morbilidad y la mortalidad debido a la progresión de la insuficiencia cardiaca sigue creciendo 1. En este contexto, la terapia celular se ha ganado un creciente interés como una nueva opción terapéutica para detener la progresión de la enfermedad hacia la insuficiencia cardíaca y para estimular la capacidad regenerativa recientemente identificado del miocardio. Las investigaciones experimentales y clínicos han proporcionado evidencia convincente de los efectos beneficiosos obtenidos después de trasplante cardíaco de diversos tipos de células. Resultados principales incluyeron la mejora de cardifunción contráctil ac, disminuyó la remodelación ventricular izquierda, redujo el tamaño del infarto, y el aumento de la densidad vascular en la zona infartada. Sin embargo, la retención de número bajo de células después de la inyección de células se mantuvo un importante inconveniente. Asociación de células con un biomatriz para mejorar la entrega de la celda 2 han contribuido a alimentar el investigador y los intereses clínicos.
La ligadura de la arteria descendente anterior coronaria (LAD) es un método de referencia para la MI en modelo animal pequeño que resulta en infarto transmural y una cicatriz madura. La terapia celular aplicada en la fase crónica de MI requiere una segunda intervención quirúrgica. Una esternotomía media se lleva a cabo por lo general para permitir la inyección intramiocárdica de las células o la implantación epicárdica del biografts. Tales procedimientos quirúrgicos invasivos aumentan la tasa de mortalidad, después de la cirugía el tiempo de recuperación, dolor, y el riesgo de infección. El abordaje mínimamente invasivo que aquí se presenta no sólo evita que ese sesgo, sino también proporciona oaccesibilidad ptimal del corazón para la aplicación del tratamiento. MI e implantación epicárdica de células asociadas a un tipo de gel biomatriz se realizan en un corazón que late a través de una toracotomía intercostal izquierdo.
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Protocol
NOTA: Lewis ratas machos y hembras, de 200-220 g fueron alojados en condiciones de laboratorio estándar (12 horas de luz y oscuridad ciclo, agua ad libitum y alimento, IVC jaula). Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones del la Ley suiza FELASA y en materia de protección animal.
1. Cell Preparación: Aislamiento de células madre mesenquimales de la médula ósea
- Anestesiar las ratas con isoflurano al 5% y O 2 5 L / min en una cámara de inducción durante 5 min. Coloque el hocico del animal en un cono de nariz conectado al sistema de anestesia. Realizar un dedo del pie o de la cola pellizcar para confirmar la sedación.
- Quitar la piel de la pierna con unas tijeras cortando la piel desde el tobillo hasta la cadera. Quitar los músculos y cortar la arteria femoral por desangramiento animal. Exponer la articulación de la cadera y luxación de la cabeza del fémur. Es importante no dañar la cabeza del fémur. Coloque los huesos en PBS estéril en un tubo de plástico de 50 ml.
- Retire todos los muscles y ligamentos de los huesos sin romperlos. NOTA: Es importante que el hueso se mantiene intacta para evitar la vinculación de la solución de enjuague o contaminación con etanol. Enjuague los huesos pelados en etanol al 70% durante 5 min.
- Bajo la campana de flujo laminar estéril, cortar en ambos extremos de los huesos con tijeras. Enjuague la médula ósea mediante la inyección de PBS estéril desde el extremo del hueso. Recoger ósea en un tubo de 15 ml. Centrifugar 7 min a 300 x g.
- Eliminar el sobrenadante. Suspender el sedimento en 3 ml de glóbulos rojos Tampón de lisis. Incubar la suspensión durante 1 min a temperatura ambiente antes de girar de nuevo durante 7 minutos a 300 x g. En un frasco de cultivo de 150 ml, añadir medio de cultivo celular estéril (395 ml de medio IMDM, 5 ml penicilina / estreptomicina, 100 ml de FBS) y sembrar las células.
- Cambie medio del segundo día para eliminar las células no adherentes.
- Realizar cambios de medio cada dos días durante 2-3 semanas, hasta que se obtiene la cantidad de células deseada.
- Por otra parte, preparar el biograft por semillaing las células sobre la matriz sólida según sea necesario y descrito en otra parte 3.
- El día de la implantación cardiaca, preparar las células o cosechar el biograft justo antes de la aplicación del epicardio.
- Recoger las células por medio de solución de desprendimiento celular Accutase. Contar las células. Llenar un tubo de centrífuga de 1,5 ml con el volumen de suspensión celular calculada de obtener una cantidad de células deseado. Centrifugar durante 7 min a 300 xg y eliminar el sobrenadante.
- Como alternativa, recoger el biograft del medio de cultivo celular, se lava en PBS estéril, y mantenerse en medio de cultivo fresco sin suero.
2. Primera toracotomía y LAD Ligadura
- Pese la rata. Encienda la almohadilla térmica a 37 ° C. Anestesiar la rata con 5% de isoflurano y 5 L / min 100% de O 2 en una cámara de inducción de 5-7 min. Realizar un dedo del pie o de la cola pellizcar para confirmar la sedación. Coloque la rata sobre el cojín eléctrico.
- Intubar al animal con un 14T catéter iv. Conectar el catéter de intubación a un ventilador de roedores programado para 2,5 L / min de oxígeno, 2,5% de isoflurano, volumen corriente de 2 ml, y una frecuencia de respiración de 90 respiraciones / min.
- Preparar una solución de buprenorfina a 0,1 mg / kg. Inyectar por vía subcutánea un tercio de la solución. Afeitarse la parte izquierda del tórax. Desinfectar con una solución de Betadine 1%.
- Incisión en la piel perpendicular al esternón en el cuarto espacio intercostal. Separe las 3 capas de músculo torácico (pectoral mayor, ascendiendo pectoral y pectoral oblicuo externo). Abra el cuarto espacio intercostal (entre las costillas 4 y 5).
- Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y para exponer el corazón. Abra el pericardio cuidadosamente. Busque y ligar la arteria descendente anterior coronaria (LAD) con un 7,0 sutura 4 mm por debajo del atrio.
- Cerrar el espacio intercostal con dos puntos de sutura utilizando 3,0 suturas. Coloque los dos suturas proximal y distalmente desde el esternón. En primer lugar, tighten la sutura distal. Cierre la tubería de escape del ventilador durante 2 segundos con el fin de inflar el pecho y evitar cualquier neumotórax. Apriete la segunda sutura. Coloque las capas de músculos en su lugar (no se necesitan puntos de sutura). Cierre la piel con una sutura de 5,0.
- Desinfectar la sutura con una solución de Betadine 1%. Inyectar el resto de la solución de buprenorfina. Apague el sistema de anestesia. Retire el catéter de intubación.
- Mantenga la rata en la jaula bajo una lámpara caliente durante 1-2 horas. Mantenga un termómetro en la jaula y controlar la distancia entre la lámpara caliente y la jaula con el fin de evitar el exceso de calentamiento. Volver a la rata en la unidad IVC. Inyectar por vía subcutánea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg mensaje -operatively cada 6-12 h durante 48 h.
3. Administración epicárdica de la Vía Tratamiento Segundo toracotomía
- Repita los pasos 2.1 a 2.3.
- Incisión en la piel perpendicular al esternón en el quinto espacio intercostal. Se separa la capa 3s de los músculos torácicos (pectoral mayor, ascendiendo pectoral y pectoral oblicuo externo). Abra el quinto espacio intercostal (entre las costillas 5 y 6).
- Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y para exponer el corazón. Si hay alguna adherencia, retire con cuidado con unas pinzas finas.
- Localizar el área de infarto que aparece como un área pálido por debajo de la ligadura. NOTA: Cuando sea necesario, utilice un trozo de 10 cm de sutura (7.0) que se inserta en el ápice para visualizar mejor el ventrículo izquierdo. Tire suavemente a la sutura mantenido ligeramente por una abrazadera para exponer el corazón.
- Aplicar uno de los siguientes tratamientos:
- Coloque el biograft en la superficie del corazón. Utilice la jeringa precargada sellador de fibrina precalentado a temperatura ambiente durante 10 min. Aplique una gota (50-100 l) de sellador de fibrina en el biograft utilizando una aguja de 25 G Luer. Verifique que el biograft está perfectamente sellada.
- Por otra parte, aplicar el sedimento de células recogido con una punta de pipeta en la superficie of el corazón en el área de pálido por debajo de la ligadura. Aplicar una gota (50-100 l) del sellador de fibrina en el sedimento celular.
- Retire el trozo de sutura desde el vértice.
- Repita los pasos 2.6 a 2.8.
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Representative Results
Todos los animales se recuperaron dentro de 1 hora después de una toracotomía. La cicatrización de la herida fue rápida. No se observó ninguna infección o edema.
El doble toracotomía izquierda permitió un acceso óptimo al corazón (Figura 1). El dolor y la mortalidad después de la cirugía fueron bajos. El animal se recuperó rápidamente de la cirugía y aumentaron de peso (Figura 2). Kaplan Meir porcentaje de supervivencia fue del 96% para la primera toracotomía. Cuatro ratas más de 104 murieron en la siguiente aplicación de tratamiento de 24 horas a través de una segunda toracotomía. Kaplan-Meir por ciento de supervivencia varió de 100% cuando animal recibió una segunda toracotomía pero ningún tratamiento (tratamiento simulado), 96% para el MSC y el grupo de sellador de fibrina, o 86% cuando animal recibió MSC inyecta directamente dentro del miocardio (Figura 3).
M-modo de evaluación ecocardiográfica realizaron 2 semanas después de la ligadura de LAD mostró una reducción en la fracción de acortamiento (FS) de 44 ± 3%a 22 ± 4%. La representación de frecuencia de los FS registrados en 104 animales 2 semanas ligadura mensaje LAD proporcionaron pruebas de la repetibilidad del método (Figura 4). El coeficiente de variación (CV) fue del 17%. Además, la ecocardiografía lleva a cabo a las 2 y 6 semanas después de la ligadura de LAD mostró una progresión hacia la insuficiencia cardiaca sugerido por una reducción de la fracción de eyección (EF) y un aumento de los volúmenes del VI en diástole y sístole (Figuras 4 y 5). El desarrollo de un infarto transmural en el grupo de tratamiento simulado operado fue confirmada por tinción de Goldner secciones transversales del corazón (Figura 6).
Figura 1 (A) El uso de retractor permitido el acceso al corazón después de la toracotomía. LAD ligadura se realizó 2 semanas antesy la sutura es visible (flecha). Aplicación epicárdica tratamiento se realizó con exteriorización mínimo del corazón. (B) Las células de pellets fijadas con sellador de fibrina se mantuvieron a la superficie de la zona infartada.
Figura 2. diaria seguimiento postoperatorio mostró pérdida de peso durante 2 días después de la cirugía. Recuperación fue acompañado con ganancia de peso en todos los animales. Variaciones de peso fueron independientes del tipo de tratamiento.
Figura 3. de Kaplan-Meir ligadura gráfico que representa la supervivencia por ciento mensaje LAD (A) y después del tratamiento a través de un segunda toracotomía (B) mostró que ambas cirugías resultaron en la pérdida reducida de los animales. grupo de control representa animal sano que no tenía la cirugía. Dos semanas después de la primera toracotomía, los animales recibieron o bien una operación simulada, pero ningún tratamiento (tratamiento simulado), sellante de fibrina sola, células fijadas con sellador de fibrina, células o directamente inyectados dentro del miocardio (MSC inyecta).
Figura imágenes de ecocardiografía 4 (A) Representante M-mode pre registrado (sana) y 2 semanas después de la ligadura de LAD (infartado). Distribución (B) Frecuencia de los valores de la fracción de acortamiento grabado dos semanas después de la ligadura de LAD (n = 104).
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Figura 5. función del corazón se evaluó mediante ecocardiografía 2dimentional (método biplano de Simpson) y grabó 2 y 6 semanas después de la ligadura de LAD. Animal tenía dos toracotomías pero no recibió tratamiento. Media ± SD, así como los valores individuales están representados por la fracción de eyección (A) el volumen del VI durante la sístole (B) y la diástole (C). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba no paramétrica de Wilcoxon pareada.
Figura 6. Representante Goldner tinción mostrando cicatriz fibrótica (verde) y miocardio viable (rojo) a las 2 semanas (A) y 6 semanas de ligación LAD (B) post.
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Discussion
La ligadura permanente de LAD causa daño irreversible del miocardio. El primer modelo animal fue descrito en 1960 4. Desde entonces, se ha considerado como un modelo estándar y adecuado para MI crónica. Su estabilidad y reproducibilidad permite la evaluación experimental de las terapias para el MI 5. Mejora de los procedimientos posteriores a la descripción inicial reportaron una tasa de mortalidad operatoria del 35-13% 6.
Como era de esperar, la ligadura de LAD inducida función cardiaca deteriorada observado dentro de 2 semanas. Una nueva disminución de la función cardíaca se registró un máximo de 6 semanas y se asocia con una cicatriz fibrótica transmural. Además, la remodelación del VI incluyendo la dilatación del VI se observa claramente 6 semanas después de ligadura.
Se eligió un intervalo de 2 semanas entre la primera y la segunda cirugía. En esta condición, la segunda toracotomía fue facilitado por la ausencia de adherencias, ya que eran demasiado abundantes después de 1 semana para el desempeño de funcionessegunda cirugía ma en condiciones óptimas. Además, 2 semanas representaron un marco de tiempo óptimo para la aplicación del tratamiento y se les permitió evitar el prematuro pic de la inflamación inducida por la isquemia y para aplicar el tratamiento antes de la formación de un tejido fibrótico densa y la progresión de la dilatación.
Aunque la toracotomía lateral es hoy en día el procedimiento quirúrgico estándar para la ligadura de LAD en animales pequeños, una esternotomía media se realiza generalmente para la aplicación de terapia celular 7. La segunda toracotomía intercostal presentado para la aplicación del tratamiento es una novela, abordaje mínimamente invasivo; que permite el acceso al corazón a través de las costillas sin huesos corte y dividiendo el músculo. La ocurrencia de la adherencia se reduce debido a la cicatriz pequeña y limitada siguiente primera toracotomía y éstas no interfieren con la realización de la aplicación del tratamiento. El enfoque dio lugar a muy bajo riesgo de hemorragia, postoperatorio rápidorecuperación, baja mortalidad, dolor, y el riesgo de infección. Este segundo procedimiento mínimamente traumático duró 20 min para la cirugía y hasta 20 min para la fijación de la matriz. El procedimiento rápido y la exposición limitada del corazón minimizado secado tejido cardíaco. Ecografía postoperatoria resultó en la adquisición de imágenes de buena calidad para el análisis de las mediciones reproducibles. No hubo hematomas que podrían poner en peligro la imagen.
La accesibilidad del corazón permite una visibilidad óptima del miocardio infartado, así como una buena exposición del corazón para la aplicación de tratamientos epicárdicas incluyendo biografts tipo sólido y gel 8-10.
El uso de selladores de fibrina presenta varias ventajas. (I) Para solucionar parches sólidos, el uso de sellador de fibrina fue menos traumática que las suturas. (Ii) Cuando se compara con otro pegamento como Bioglue (Cryolife), sellador de fibrina era más dócil que Bioglue que formó la estructura rígida y con problemas de corazóncontracciones. (Iii) Su tiempo de polimerización fue óptima para andamio adecuada o el posicionamiento sedimento celular. (Iv) El sellador de fibrina permite una excelente adhesión inicial de parche sólido. El parche se mantiene firmemente sobre la superficie del corazón durante al menos 4 semanas 10. (V) El sellador de fibrina era fácil de proceso cuando se utiliza como un andamio para la entrega de células epicárdicas y las células se mantuvieron fijos en la superficie de la zona infartada hasta el final del procedimiento quirúrgico. Aunque el tiempo de retención de las células estaba fuera de foco de este estudio y exigiría nuevas investigaciones, se ha propuesto que la matriz permite una mejor retención de infarto de 11-14 células implantadas. Lave fuera de las células durante la contracción cardíaca, así como la hipoxia y el medio ambiente inflamatorio, puede explicar en parte la eliminación rápida. Estos inconvenientes podrían reducirse cuando las células están asociadas con una matriz.
Los principales retos técnicas, referentes a la manipulación quirúrgica debiograft un sólido. Si la matriz es rígido y no flexible, la fijación con suturas debe ser favorecida. Los siguientes pasos críticos deben ser considerados para el éxito del procedimiento. En primer lugar, se debe dar una atención especial durante la toracotomía para evitar romper las costillas. En segundo lugar, el exceso de cola debe eliminarse cuidadosamente para evitar la adherencia de otros tejidos. Finalmente, un posicionamiento ligadura estandarizada es importante ya que puede reducir la variabilidad en el tamaño del infarto. Un infarto transmural se puede obtener cuando LAD se liga a 4 mm del atrio.
En conclusión, el doble toracotomía representado un procedimiento quirúrgico seguro con baja mortalidad, el acceso adecuado al corazón que late para la aplicación del tratamiento, y por lo tanto favorecerá la optimización de la planificación experimental y número reducido de pérdida animal.
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Acknowledgments
Los autores agradecen al Prof. Hendrik Tevaearai y el Departamento de Cirugía Cardiovascular de apoyo financiero a la parte inicial del estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
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