Udnyttelsen af ​​Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration og Bronchoalveolære at evaluere Host immunrespons i mus

Summary

Reaktionen på patogeninfektion værtsimmunrespons er en stramt reguleret proces. Ved hjælp af en lipopolysaccharid lunge eksponering model i mus, er det muligt at foretage høj opløsning evalueringer af de komplekse mekanismer, der er forbundet med sygdom patogenese.

Abstract

Svaret på patogener værtsimmunrespons er en kompleks biologisk proces. Hovedparten af undersøgelser in vivo klassisk anvendes til at karakterisere host-patogen interaktioner drage fordel af intraperitoneale injektioner af udvalgte bakterier eller patogener associeret molekylære mønstre (PAMPs) i mus. Selv om disse teknikker har givet enorme data i forbindelse med smitsomme sygdomme Patobiologi, intraperitoneal injektion modeller er ikke altid hensigtsmæssigt for host-patogen interaktionsundersøgelser i lungen. Ved hjælp af en akut lungebetændelse model i mus, er det muligt at gennemføre en høj opløsning analyse af værtens medfødte immunreaktion udnytte lipopolysaccharid (LPS). Her beskriver vi metoder til at administrere LPS ved hjælp af kirurgisk svælg intratracheal administration overvåge kliniske parametre, der er forbundet med sygdommen patogenese og anvende bronkoalveolærvaskevæsken at evaluere værtens immunrespons. De teknikker, der er beskreveter bredt anvendelig til at studere reaktion værten medfødte immun over for en bred vifte af PAMPs og patogener. Ligeledes, med mindre modifikationer, disse teknikker kan også anvendes i undersøgelser evaluerer allergisk luftvejsinflammation og farmakologiske applikationer.

Introduction

Lungeinfektioner forbundet med patogene bakteriearter er en almindelig årsag til den globale sygelighed og dødelighed. Bestemmelse af de mekanismer, der driver værtens immunrespons til disse patogener vil fremme udviklingen af ​​nye forebyggelsesstrategier og terapeutiske midler, der vil dæmpe virkningen af ​​disse infektioner. Det overordnede mål med protokollen beskrevet her er at give brugeren med en fleksibel metode til at evaluere respons værten medfødte immunforsvar til patogeninfektion hjælp af et patogen forbundet molekylær mønster (PAMP) som erstatning for levende bakterier. Hovedparten af ​​tidligere undersøgelser evaluerede svar værten medfødte immunforsvar bakterier har fokuseret på peritoneale modeller på grund af den relative lethed af udførelse. Mens disse modeller er meget nyttige, og har resulteret i betydelige fremskridt inden for host-patogen interaktioner og systemisk inflammation, de data, der genereres fra disse modeller er ikke altid hensigtsmæssig til undersøgelser involving åndedrætsorganerne. Her er en pulmonal model af akut lungebetændelse foreslået som en praktisk og klinisk relevant udvidelse af de klassiske intraperitoneal (ip) injektion modeller. Den foreslåede teknik gør det muligt for den lokale vurdering af medfødte immunrespons i en organspecifik modelsystem.

De her beskrevne metoder er designet til at give en enkel og robust teknik til at tillade brugere at vurdere værtens immunrespons til LPS, som er en almindelig PAMP. Metoderne er baseret på intratracheal (it) instillation af LPS, som fremkalder en robust immunrespons medfødte i lungerne hos mus og efterligner mange af de patofysiologiske funktioner observerede i de humane patienter, der lider af luftvejsinfektioner og akut lungeskade ^1. En primær fordel ved denne teknik er, at det giver brugeren mulighed for at vurdere værtens immunrespons uden forstyrrende faktorer og sikkerhedsmæssige problemer, der er forbundet med at gennemføre in vivo-undersøgelserbrug af levende bakterier. Ligeledes oropharyngeale det administration eksponeringsvej beskrevet i denne protokol har betydelige fordele frem for andre almindeligt anvendte teknikker, herunder intranasal (i) administration og kirurgisk det administration. For eksempel svælg det administration tillader relativt præcis dosaging og lungedeponering forhold til i administration, der typisk lider af øget variabilitet lungedeponering på grund af tabet af agenter i næsehulen og bihulerne ^2-4. Det er det administrationsvej omgår disse hulrum og giver direkte adgang til luftrøret og luftveje. Ligeledes den kirurgiske det tilgang er et betydeligt mere morbid administration metode og kræver omfattende uddannelse til master. De her beskrevne protokoller omfatter også en beskrivelse af de almindelige teknikker og surrogat markører, der anvendes til at evaluere betændelse progression og ender med en protokol, der beskriver de korrekte teknikker til forberedelse af lungs til histopatologi vurderinger. Disse protokoller er fokuseret på at minimere antallet af mus, der kræves for hver undersøgelse ved at maksimere de genererede data fra hver enkelt dyr.

De beskrevne protokoller er meget fleksible og kan let modificeres til at vurdere en bred vifte PAMPs og skader molekylære mønstre (dæmper). Desuden, med et par yderligere modifikationer, disse protokoller kan også anvendes til studier, der evaluerer allergisk luftvejs sygdomsprogression eller host-patogen interaktioner med levende bakterier, vira eller svampe ^5-10.

Protocol

Alle undersøgelser blev gennemført i henhold til godkendelse af Institutional Care og brug Udvalg (IACUC) for Virginia Tech og i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1.. Intratracheale (it) Podning af LPS Brug Oropharyngeal Administration

1. Sørg for, at hvert dyr entydigt identificeres ved hjælp af enten en øre punch, øremærke eller andet institutionelt godkendt metode.
2. Optag baseline kropsvægt og temperatur for hvert dyr.
3. Forbered arbejder bestand af LPS. Hver mus modtager en 50 gl dosis på 1 mg / kg LPS i 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Mock behandlede dyr vil modtage en 50 gl dosis 1x PBS.
4. Forbered et passende kammer til administration af isofluran ved hjælp af følgende slip-metoden. Institutionelle retningslinjer variere med hensyn til brugen af ​​isofluran og andre anæstesimidler og før initiatning nogen undersøgelser, bør personer, kontakte deres institutions Institut for Animal Care / Welfare at forsikre alle retningslinjer er tilstrækkeligt opfyldt. Hvis slip-metoden isofluran er ikke en mulighed, er andre anæstesimidler acceptable alternativer.
   1. In en sikkerhedsanalyse kabinet Anbring ca 3 ml isofluran to foldet trækpapir håndklæde og place nederst i 500 ml bægerglas.
   2. Læg et lille stykke aluminiumsfolie på toppen af ​​køkkenrulle og tildækkes med gennemsigtigt låg.
5. Forbered værktøjer og reagenser, der vil blive anvendt i løbet af det inokulering. Placer elastik, der vil sikre dyrene hovedet på intubation standen. Denne procedure kræver et par lige pincet, et par vinklede eller buede pincet og en p200 pipette tips.
6. Belastning 50 pi LPS i pipettespidsen og sted i en let tilgængelig placering ved siden af ​​intubation stativet.
7. Bedøver musenved at anbringe dyret i isofluran kammeret og omfatter kammeret med det gennemsigtige låg. Overhold dyrets vejrtrækning mønstre, som vil være hurtig og overfladisk, når først ind i kammeret. Dyret vil blive tilstrækkeligt bedøvet, når vejrtrækning satser nærmer 1 åndedrag / 2 sek, som normalt nås inden 30 sek for at placere i kammeret. Musen skal bedøves som anført i den godkendte dyr protokollen hjælp dråbemetode isofluran.
8. Tag den bedøvede mus fra kammeret og suspendere dyret på intubation stå ved sine forreste fortænder. Sikre, at dyret er sikkert fastholdt, og at munden og tungen er tilgængelige.
9. Forsigtigt sikre tungen med de lige pincet. Tag fat i tungen med de vinklede pincet og træk det forsigtigt ud af munden indtil let modstand mærkes. Denne handling er tilstrækkelig til at blokere strubelåget og få adgang til luftrøret.
10. Mens du fortsætter med at holde tungen iudstrakte position, administrere dosis på 50 pi LPS ind i bagsiden af ​​halsen og straks dækker dyrets næsebor med en behandsket finger. LPS vil være synlig på bagsiden af ​​halsen, indtil musen inhalerer.
11. Fortsæt med at dække næsebor og holde tungen forlænges 5-10 ekstra vejrtrækninger.
12. Fjern musen fra intubation stå og sende dyret tilbage i en ny bur indtil den genindvinder fra anæstesi.
13. Overvåg surrogatmarkører forbundet med sygdomsprogression. Kropsvægt og temperaturen skal monitoreres hver 4-8 timer for varigheden af ​​undersøgelsen. Ligeledes evaluere adfærdsmæssige karakteristika og kliniske symptomer forbundet med øget morbiditet.
14. At evaluere sygdomsprogression høst mus på bestemte tidspunkter efter LPS eksponering. Typiske tidspunkter for høst efter LPS eksponering omfatter 0, 6, 12, 18, 24 og 48 timer. At evaluere nyttiggørelse og overlevelse, evaluere musene for 7 days post-inokulering.

2. Serum og bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) Indsamling

1. Sacrifice musen ved hjælp af en institutionelt godkendt metode.
2. Placer dyret på ryggen og fastgør den til en obduktion bestyrelse, ideelt 0,5 i (1,27 cm) i højden.
3. Fugt hele mus med 70% ethanol.
4. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 27 G kanyle, foretage en cardialpunktur inden du gør nogen indsnit. Det bør være muligt at trække 500-800 pi af fuldblod fra en enkelt mus.
5. Fjern kanylen fra sprøjten og overføre fuldblod en prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugerør. For serum samling tillade helblodet at koagulere for mindst 30 minutter ved stuetemperatur. Foruden serum-samling, kan denne procedure også modificeres ved inkorporering af et anti-koaguleringsmiddel i røret og sprøjte før opsamling af fuldblod, studere cirkulerende immunceller.
6. Lav et vandret snit etkors længden af ​​bughulen og et lodret snit fra bughulen underkæben på musen.
7. Ved hjælp af en pincet, fatte begge sider af snittet og træk forsigtigt huden væk fra de underliggende peritoneale og brysthule hulrum.
8. Foretag en stort snit langs længden af ​​peritonealhulen fra kønsdelene til brystbenet, idet man for at undgå at skære membranen. Forsigtigt flytte tarmene i bughulen for at give adgang til en af ​​nyrerne.
9. Skær nyrevenen fører til nyrerne for at tjene som et dræn punkt for perfusion.
10. Nick mellemgulvet med en saks, idet man undgår lungerne og hjertet, at afsløre den venstre side af hjertet.
11. Manuelt perfundere hjertet anvendelse af en 10 ml sprøjte med en 27 G kanyle og 1 x PBS-opløsning. Undgå at bruge overdreven magt under perfusionen at sikre, at saltvand ikke tvinges ind i lungerne. Det resterende blod skal løbe fra vena indsnit.
12. Skær forsigtigt brystkassen langs brystbenet ved stump / stump saks, idet man undgå at skære i hjerte og lunger. Tilfældigvis skære lungerne under denne procedure vil reducere mængden af ​​BALF indsamles og vil resultere i en manglende evne til at puste lungerne med fiksativ.
13. Forsigtigt isolere hjertet og lungerne væk fra brystkassen ved hjælp af pincet. Skær forsigtigt hver sektion af brystkassen ved stump / stump saks så tæt på rygsøjlen som muligt og fuldt ud at fjerne begge sektioner.
14. Adskil spytkirtlerne hjælp pincet eller fjerne dem med en saks, for at blotlægge trachea.
15. Skær forsigtigt de muskler, der overlay luftrøret med en saks. Det er vigtigt, at luftrøret ikke skæres under denne proces.
16. Ved hjælp af saks, adskille kraveben overliggende luftrøret.
17. Klem forsigtigt brissel med pincet og løfte væv væk fra hjertet. Fjern brissel med saks, samtidig med, atundgå at skære i hjerte eller lunger.
18. Lav en lille vandret snit i luftrøret 1-2 ringe under strubehovedet bruge vinklede saks (45-90 º vinkel, skarp / skarpe). Snittet skal være stort nok til at fastgøre kanylen.
19. Indsæt kanylen, således at den tilspidsede ende strækker 2-3 tracheale ringe under snittet og sikre kanylen på plads ved hjælp af en silkesutur. Sikre, at suturen passerer mellem luftrøret og spiserøret og trækkes stramt på kanylen.
20. Fyld en 1 ml sprøjte med 1 ml Hanks saltopløsning (HBSS), og indsæt forsigtigt sin luer i kanylen.
21. Ved hjælp af en langsom, men konstant bevægelse, injicere ~ 900 ul i luftrøret, oppustning lungerne, og straks trække HBSS. Placer genvundet BALF i en 15 ml konisk rør.
22. Gentag denne udskylning 2 ekstra gange for at samle cirka 3 ml BALF til fremtidig analyse. Opbevar BALF på is eller ved 4 º C, indtil klar til brug.

1. Indsæt en 10 ml sprøjte ind i lungen inflation stativet. Saml slangen til luer, luer til stophanen og stophane på sprøjten. Sørg for stophanen er i lukket position. De 10 ml sprøjte vil tjene som en tyngdekraft flow reservoir. Beholderen skal være knyttet til inflationen stå 4.75 i over dyret og toppen af ​​reservoiret bør udvide 10,5 i over dyret.
2. Fyld sprøjten med neutral pufret formalin opløsning. Kontroller, at sprøjten er helt fyldt med fiksativ.
3. Placer en absorberende håndklæde under den åbne ende af røret og åbne stophanen at tillade fiksativ at fylde slangen. Når fiksativet begynder flyder fra slangen, straks lukke stophanen og fyld sprøjten til toppen med fiksativ. Det er vigtigt, at sprøjten fyldes helt at tilvejebringe den passende mængde af pres for lunge inflation.
4. Bind en enkelt løs knude i suturen; dog ikke trække knuden stramt.
5. Sæt slangen fra musen inflation stå i kanylen.
6. Åbn vandhanen og lade lungerne til at fylde ved tyngdekraft inflation.
7. Når lungerne nå deres maksimale inflationsniveau, træk suturen stramme og binde en anden knude.
8. Vandhanen lukkes, og fjern slangen fra kanylen.
9. Fjern forsigtigt kanylen fra luftrøret ved at gribe sutur med en tang og holde kanylen med fingrene. Træk i den suturen ned mod brysthulen og kanylen tilbage mod musens næse.
10. Forsigtigt fat i luftrøret eller suturerne med pincet og løfte luftrøret væk fra halsen hulrum.
11. Afskære luftrøret caudale til den bundne sutur ved stump saks.
12. Når trachea er fri fra de underliggende væv begynde at trække luftrøret bort fra musen. Løft forsigtigt lungerne ud af brysthulen.
13. Skær forsigtigt bindevævet holde lungerne i brysthulen. Fortsæt med at trække luftrøret væk fra musens krop og anvende støt opadgående kraft, mens der skæres de underliggende forbindelser. Vær omhyggelig med at undgå at skære lungerne. Bemærk, at hjertet skal blive siddende til lungerne ved hjælp af denne metode.
14. Når lungerne er blevet fjernet, skal du placere dem i 10 ml bufferet formalin.
15. Fjern en sektion af mus hale til genotypebestemmelse.
16. Bortskaf musen slagtekroppen efter passende institutionelle retningslinjer.

4.. Cytokin Evaluering

1. Centrifuger fuldblod indsamlet i trin 2,5, ved 12.000 x g i 5 minutter for at isolere serum. Overfør serum til en prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
2. Vurdere serum cytokinniveauer ved ELISA eller en anden lignende analysen. Fortynd serum fra 1:05 til 01:20 i en passende fortyndingspuffer, afhængigt af assayet efter fabrikantens anvisninger. Disse fortyndinger bør bestemmes empirisk, inden du kører hovedparten af ​​prøverne.
3. På grund af det lave volumen af ​​serum indsamlet reducere prøvevolumenet fyldt på ELISA-pladen med halvdelen. For eksempel har de fleste kommercielle ELISAs udnytte mængder af standarder og prøver 100 gl. For at spare på prøver, belastning 50 ul af standarder og fortyndet serum pr godt.
4. Centrifuger BALF i en nedkølet bordcentrifuge ved 200 xg i 5 min. Overfør cellen fri supernatant i to prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
5. Vurdere BALF cytokiner ved ELISA eller en anden lignende analyse uden at udvande.
6. Opbevar ubrugt serum og BALF ved -80 ° C.

5.. Differential Farvning og BAL cellularity Evaluering

1. Efter BALF centrifugering og komplet HBSS fjernelse lysere de pelleterede røde blodlegemer ved hjælp af hypotonisk saltvand. Resuspender cellerne i 900 pi destilleret vand. Straks tilføje 100 pi 10x PBS.
2. Individuelt lysere hver prøve. Hvis prøverne indeholder store mængder af røde blodlegemer, kan cellerne pelleteret i bordcentrifuge ved 400 xg i 5 minutter, og de røde blodlegemer lysis protokol kan gentages.
3. Bestem den samlede BALF cellulariteten i 1 ml suspension ved hjælp af en hæmacytometer under 10X eller 20 X forstørrelse med trypanblåt farvning. Vurdere og præsentere disse data som celler / ml.
4. Forbered materialer til cytospin og differentieret farvning. Mærk standard objektglas ved hjælp af en blyant eller opløsningsmiddel resistent pen. Fastgør glider ind i en cytospin beslag og tragt. Fastgør glideskinnemontagen i cytospin rotoren.
5. Cytospin 150 pi BALF 100 xg i 5 minutter. Hvis celletæthed er alt for stor til effektivt atevaluere celle morfologi, reducere mængden spundet ned på dias. Lad objektglassene lufttørre natten over.
6. Differential plette dias efter fremstiller protokoller. Lad objektglassene lufttørre natten over. Dækglas dias ved hjælp Permount og vurdere dias ved hjælp af et mikroskop udstyret med en 20X og 40X mål.
7. Høste de resterende celler til efterfølgende analyse, såsom FACS, elektronmikroskopi, konfokal mikroskopi, RNA-ekstraktion til genekspression evaluering og / eller proteinekstraktion til western blot.

6.. Histopatologi Evaluering

1. Forbered lungerne til histopatologi evaluering. Efter 24-48 timers formalin fiksering, ventralt orientere hele oppustede lunger og indlejret i paraffin. Skær de resulterende blokke for at blotlægge det primære ledende luftveje.
2. For at forbedre scoring nøjagtighed placere lungerne i samme position og trim hver blok for at give den maksimale langsgående visualisering af than Intrapulmonære vigtigste aksial luftveje. Fra dette punkt sender 5 mikron seriesnit og pletten med hematoxylin og eosin (H & E). Ekstra sektioner kan skæres og forberedt til in situ-hybridisering under anvendelse af standardprotokoller.
3. Vurdere histopatologi ved hjælp af en semi-kvantitativ pointsystem baseret på følgende inflammatoriske parametre, som er ridsede mellem 0 (fraværende) og 3 (alvorlig): mononukleære og polymorfkernede celle infiltration; luftvejs epithelial celle hyperplasi og skade; ekstravasation; perivaskulære og peribroncheolar infiltration; og procentdelen af ​​de involverede med inflammation lunge. Lung histopatologisk undersøgelse skal vurderes af en erfaren patolog.
4. Gennemsnitlig alle de parameter scores til at generere en samlet histopatologi score eller anvende individuelle scoringer at kvantificere specifikke aspekter af sygdomsprogression. Gennemføre alle scoring i en dobbeltblind mode, med korrekturlæsere blindet for både genotype og behandling. Dette pointsystem har været previously beskrevet ^6,7,10.

Representative Results

Cellevæggene på gram-negative bakterier er sammensat af LPS, som er meget udbredte i miljøet. Indånding af LPS i følsomme befolkningsgrupper forværrer luftvejsreaktivitet og er i stand til at udløse en robust immunforsvar response11. LPS er også et fælles PAMP anvendes i musemodeller for at fremkalde en reaktion robust medfødte immunreaktion. I protokollen beskrevet her, fik musene en den dosis af LPS isoleret fra E. coli (serotype 0111: B4) under anvendelse af oropharyngeal det administration. I modeller af LPS eksponering både legemstemperatur og-vægt er typiske surrogatmarkører for sygelighed og sygdomsprogression. LPS-udfordring vil medføre et betydeligt fald i kropstemperatur i de første 6 timer, som gradvist vil stige tilbage til basislinien i løbet af 24 timer (figur 1A). Dog vil legemsvægt falde støt i løbet af 24 timer (figur 1 B), hvor den vil toppe og gradvist komme over nekst 48-72 timer. Således kropstemperatur er et mere passende markør for at vurdere de tidlige stadier af inflammation indledning; henviser til, at kropsvægten er mere pålidelige i de senere stadier af patogenese og nyttiggørelse.

Airway LPS eksponering resulterer i en betydelig tilstrømning af leukocytter til lungerne. Inden for den første 6 timer, kan celler i forbindelse med svar værten medfødte immunforsvar ses i BALF (figur 1C). Den BALF cellularity fortsætter med at stige over de næste 24-48 hr (figur 1C), hvor immunrespons toppe og efterfølgende går ind i en periode med betændelse opløsning. Ved 24 timer, et betydeligt antal neutrofiler er til stede i lungerne og kan iagttages i BALF efter forskellen farvning (figur 1D og 1E). BALF cellularity vurderinger giver en robust og kvantificerbar teknik til at karakterisere de celler i forbindelse med immunrespons værten i lungerne. Den incrlethed i BALF cellularity er konsistent med en betydelig tilstrømning af neutrofiler i luftvejene, blodkar og i lungeparenkym (figur 1F og 1G). Lung histopatologi effektivt kan evalueres ved hjælp af en semi-kvantitativ pointsystem (figur 1F). Det er muligt præcist at score histopatologi på bestemte lokaliteter i lungerne hos forskellige dyr, når lungerne nøjagtigt pumpes op til det samme størrelse med fiksativ og sektioner behandles for at afsløre den maksimale langsgående visualisering af intrapulmonal vigtigste aksiale luftveje. Den tyngdekraft baseret inflation protokol, der er beskrevet her, er designet til at lette dette pointsystem. LPS inducerer en betydelig stigning i perivaskulær, peribroncheolar og parenkym inflammation (figur 1G).

LPS administration inducerer høje niveauer af lokale og systemiske pro-inflammatoriske mediatorer, herunder flere cytokiner, der er forbundet medden medfødte immunreaktion. Lokale cytokinniveauer kan vurderes i BALF hjælp af konventionelle teknikker, såsom ELISA. Almindelige cytokiner som opreguleres i lungerne efter LPS administration indbefatter TNF-α, IL-1β og IL-6 (figur 2A). Systemisk cytokinniveauer kan evalueres i serum ved hjælp af de samme teknikker som beskrevet for BALF vurderingerne (figur 2B). Det er ikke ualmindeligt for nogle mediatorer at være til stede i det lokale mikromiljø, men fraværende i serum. For eksempel er TNF-α rutinemæssigt findes i store mængder i lungerne efter LPS, men er ikke typisk findes systemisk under de betingelser, der er beskrevet i denne protokol (figur 2A og 2B, under niveauet for detektion).

Figur 1. Oropharyngeal Intratracheal LPS Administration øger sygeligheden og luftvejsinflammation i mus. Mand mus modtog 1 mg / kg af E. coli LPS (serotype 0111: B4) det og sygdom patogenese blev evalueret i løbet af 24 timers AB) LPS inducerer en betydelig reduktion i kropstemperatur indenfor 6 timer på administration;. mens vægttab er mere synlige på senere tidspunkter. C)   LPS inducerer en betydelig stigning i den samlede BALF cellularitet. DE) Neutrofiler er den dominerende celletype er til stede i lungerne 24 timer efter LPS-administration, som afsløret ved differentiel farvning af celler isoleret fra BALF. Disse data er typisk illustreret som procent af hver celletype stede i BALF. Kan F) Lunge histopatologi vurderes ved hjælp af en semi-kvantitativ pointsystem baseret på to uafhængige evaluerings af betændelse omkring intrapulmonal vigtigste aksiale luftveje. G) En betydelig del af perivaskulær og peribroncheolar infiltration, mild parenkymal inflammation og nogle mindre alveolær okklusion er typisk observeret 24 timer efter lunge LPS eksponering. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Airway Udsættelse for LPS resulterer i øgede koncentrationer af lokale og systemiske cytokiner. A)   Efter LPS-eksponering kan observeres lokale niveauer af et bredt spektrum af pro-inflammatoriske cytokiner i BALF inden for de første 24 timer, herunder TNF-α, IL-1β og IL-6. Disse cytokiner kan evalueres ved hjælp afELISA, som vist her 24 hr efter LPS eksponering. B) Flere cytokiner kan også påvises systemisk i serummet. Men der er nogle bemærkelsesværdige undtagelser, herunder TNF-α, som findes i høje niveauer i BALF men ikke i serum. Cytokiner af interesse i serum bør vurderes empirisk før omfattende evaluering. Klik her for at se større billede .

Figur 3. Lung Inflationen Brug Gravity Displacement Resultater i Reduceret Histopathology Variability og Forbedret visualisering. Forskydningen metode til fiksering beskrevet i denne protokol tyngdekraft giver mulighed for optimal histopatologi evaluering sammenlig ed til uninflated lunger eller manuel inflation. AB) Lunger fastsat af tyngdekraften inflation demonstrere ensartede funktioner giver mulighed for præcis scoring, reduceret alveolær skade, forbedret visualisering, og højere evalueringer af inflammation. CD) Manuel inflation af lungerne opløsning typisk resulterer i uensartede områder inflation. C) Disse uensartede områder er ofte delvist oppustet, hvilket resulterer i kollapsede områder, der er almindeligt fejl som patologiske træk ved uerfarne anmeldere. D) Manuel inflation resulterer også i områder af lungerne, der er over-oppustede, hvilket resulterer i omfattende skader alveolær rum. E) uoppustet lunger demonstrere sammenfaldne alveolære rum og områder, der er vanskelige at løse og evaluere uden omfattende uddannelse. Ligeledes har på grund af orglet blive kollapsede denne teknik ikke tillader visualisering af lungerne, som de vises i stedet.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Discussion

De mest kritiske trin for vellykket evaluering immunrespons værten i muselunger er som følger: 1) vælge den rette mus stamme og køn for modellen blive evalueret; 2) optimere PAMP levering til lungerne; 3) at indsamle og bearbejde BALF korrekt; og 4) fastsætte ordentligt og forberede af lungerne for histopatologiske vurderinger.

Valget af musestamme er en vigtig faktor i evalueringen værtens immunrespons. C57BI / 6 mus typisk betragtes som den optimale muse baggrund for at studere medfødte immunitet på grund af deres Th1 skævvridning og robust respons på de fleste PAMPs. Ligeledes er BALB / c-mus, der typisk anvendes til at studere allergiske sygdomsmodeller på grund af deres Th2 skråstilling. En tredje almindeligt anvendte stamme i lungerne modeller er mus på 129SvEv baggrund, på grund af deres fælles anvendelse ved generering af genetisk modificerede dyr. I alle tilfælde bør der udvises forsigtighed ved eksperimentel design og når det er muligt, alder og køn matched liter-mate kontroldyr skal bruges til studier, der sammenligner genmodificerede mus med vildtype dyr. Typisk for LPS beskrevne protokol her, bør 6-12 uger gamle sex matchede C57BI / 6 mus anvendes, og skal veje mindst 20 g. Det er muligt, at LPS eksponering vil resultere i høje niveauer af sygelighed og dødelighed i mus følsomme stammer eller genotyper. Hvis dette sker, kan det være nødvendigt at justere flere aspekter af denne protokol, herunder at reducere LPS dosis ved hjælp af større dyr, og skifte køn for de dyr, der anvendes i forsøget. Små skala eksperimenter bør indledningsvis udført for at bestemme dyr følsomhed, og betingelserne for hvert forsøg bør være baseret på den mest modtagelige genotype eller eksperimentel tilstand.

Oropharyngeal det administration har vist sig at være mere præcis end andre former for agent levering til lungerne ^2. Dette er i stor del på grund af den direkte adgang til airway og omgå problemer forbundet med nasal og sinus hulrum deposition. , Som med alle dyreforsøg, er det forvaltning kræver dog omfattende håndelag og praksis for at opnå færdigheder. Ukorrekt teknik kan resultere i ineffektiv lungedeponering og i nogle tilfælde resultere i dyre skader. Typisk kan Evans blåt farvestof (EBD) udnyttes effektivt som enten et træningsredskab til denne procedure eller for at foretage fejlfinding potentielle problemer forbundet med aflejring ^4. EBD kan administreres denne og efterfølgende ekstraheret fra vævet med formamid. Mængden af ​​EBD kan beregnes ved absorption niveauer sammenlignet med en standardkurve. I vores hænder, typisk EBD opsving svinger mellem 90-98%. Forventes hovedparten af ​​den udækkede farvestoffet at være forbundet med lækage i spiserøret. På grund af sin nøjagtighed, det er det administration teknik er ideel til at levere en bred vifte af dosis følsomme agenter til lungerne, såsom farmaceutiske midlereller smitsomme organismer.

Analyse af BALF og BALF cellularitet kan give en betydelig mængde af indsigt i den samlede progression af værtens immunrespons. Inflammatoriske mediatorer frigivet lokalt i lungerne efter stimulering effektivt kan kvantificeres i BALF hjælp af almindelige immunologiske teknikker, såsom ELISA og Western Blot. Ligeledes kan den cellulære sammensætning af BALF vurderes enten ved hjælp af forskellen cellefarvning eller flowcytometri. Udvikling af den rette teknik og håndelag er den mest kritiske del af at udføre den bronchoalveolar lavage (BAL). En af de mest almindelige problemer, der opstår under BAL er manglende fuldstændige trække den maksimale mængde af væske oprindelig placeret i lungerne. Dette er ofte forbundet med en ukorrekt sikret kanyle eller når nåle anvendes i stedet for faktiske kanyler. Specialized tracheale kanyler er kommercielt tilgængelige. Det er også vigtigt, at bevægelse og kraftbruges til at indsætte og trække saltvand er glat og ensartet hele proceduren. Den her beskrevne protokol er blevet optimeret til differentieret farvning af celler, der er indsamlet i BALF. Differentialfarvning er en modificeret Wright Giemsa farve og er en meget effektiv teknik til at gennemføre morfologi baseret celleidentifikation. Denne farvning teknik giver mulighed for differentiering af neutrofiler og eosinofiler baseret på deres unikke granulat farvningsprocedurer egenskaber. Monocytafledt celler er også let at identificere og ses ofte i BALF. Heriblandt makrofager og dendritiske celler. Ligeledes er T-celler og B-celler også almindeligt forekommende. Men disse monocytiske celler og lymfocytter er ofte vanskeligt for de fleste forskere til præcist at differentiere baseret på morfologi alene. Udnyttelsen af ​​flowcytometri kan tilføje meget højere opløsning til disse evalueringer. Men lavt celletal inddrives fra kontroldyr er ofte en begrænsende faktor. Så hvis flow cytomEtry skal anvendes, den eksperimentelle design skal indeholde yderligere negative kontroldyr at øge celleindvinding.

Lung histopatologi vurderinger er en anden vigtig komponent i denne protokol, og giver mulighed for direkte visualisering af sygdomsprogression (3A og 3B). Når lungerne er ordentligt forberedt, kan histopatologi vurderes præcist, kvantificeret og karakteriseret. Det mest kritiske skridt i forberedelsen lungerne for histopatologi er korrekt oppumpning dem med fiksativ. Manuelle metoder til inflation typisk resultere i lungerne, som er over-oppustet under oppustet eller delvist oppustet, hvilket resulterer i suboptimal visualisering og morfologi vurderinger (figurerne 3C og 3D, henholdsvis). Ligeledes er meget vanskeligt præcist at vurdere lungerne, der ikke er pustet før fiksering og resulterer ofte i meget varierende histopatologi scorer (Figur 3 E). Grovhed metode inflation diskuteret her giver en meget reproducerbar metode til inflation med minimal variation. Med denne teknik er det muligt at vurdere specifikke lokaliteter i lungerne, som er konsistente mellem forsøgsdyr. Desuden tyngdekraften inflation ved hjælp af en inflation stativ er blevet vist, at oppuste lungerne ved et fiksativ tryk på 20 mm ^12. Denne teknik muliggør visualisering af lungerne i deres mest fysiologisk relevante størrelse og form og har vist sig at være yderst effektiv til evaluering af følsomme patofysiologiske processer ^12. Det er kritisk, at inflationen stativet sættes i den korrekte højde fra musen for at generere det korrekte tryk. Hvis der observeres suboptimal inflation skal højden af ​​inflationen stativet bestemmes empirisk. Det anbefales at anvende et kommercielt tilgængeligt lille gnaver lunge inflation stativ, som vil sikre den rette højde.

t "> Denne procedure er blevet optimeret til levering af LPS og andre PAMPs til lungerne hos mus. Når disse teknikker beherskes, kan yderligere undersøgelser også indledes ved hjælp af modificerede protokoller til effektivt at vurdere værtspatogene interaktioner anvendes levende patogener. Ligeledes de teknikker, der er beskrevet her er meget alsidige og kan anvendes til en undersøgelse, er interesseret i at vurdere den kliniske og fysiologiske relevans af et eksperimentelt eller farmaceutisk middel. grund af nøjagtigheden i doseringen, denne teknik er også ideel til in vivo-undersøgelser, der kræver en høj præcision i agent levering.

Denne procedure er blevet optimeret til levering af LPS og andre PAMPs til lungerne af mus. Når disse teknikker beherskes, kan yderligere undersøgelser også indledes ved hjælp af modificerede protokoller til effektivt at vurdere host-patogen interaktioner med levende patogener. Ligeledes de teknikker der er beskrevet her er meget alsidige og kan be anvendes på enhver undersøgelse er interesseret i at vurdere den kliniske og fysiologiske relevans af et eksperimentelt eller farmaceutisk middel. På grund af nøjagtigheden i doseringen, denne teknik er også ideel til in vivo-undersøgelser, der kræver en høj grad af præcision i agent levering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500