Summary
استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.
Abstract
استجابة المضيف المناعي لمسببات الأمراض هو عملية بيولوجية معقدة. غالبية العاملين في الدراسات المجراة كلاسيكي لتوصيف التفاعلات المضيف الممرض الاستفادة من الحقن داخل الصفاق من البكتيريا أو الممرض حدد المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) في الفئران. في حين أن هذه التقنيات قد أسفرت عن البيانات الهائلة المرتبطة البيولوجيا المرضية الأمراض المعدية، ونماذج حقن داخل الصفاق ليست دائما ملائمة للدراسات التفاعل المضيف الممرض في الرئة. استخدام نموذج التهاب الرئة الحادة في الفئران، فمن الممكن إجراء تحليل عالية الدقة للمضيف الاستجابة المناعية الفطرية باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS). هنا، نحن تصف الأساليب لإدارة LPS استخدام غير الجراحية الإدارة داخل القصبة الهوائية والبلعوم، ورصد المعلمات السريرية المرتبطة المرضية المرض، والاستفادة من السائل غسل القصبات لتقييم الاستجابة المناعية المضيف. التقنيات التي تم وصفهاقابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة لمجموعة متنوعة من PAMPs ومسببات الأمراض. وبالمثل، مع تعديلات طفيفة، وهذه التقنيات يمكن أن تطبق أيضا في دراسات تقييم التهاب الشعب الهوائية التحسسي والتطبيقات الدوائية.
Introduction
الالتهابات الرئوية المرتبطة بالأنواع البكتيريا المسببة للأمراض هي سبب شائع للمراضة والوفيات في العالم. وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المضيف المناعية لهذه الجراثيم تعزيز تنمية استراتيجيات الوقاية الرواية والعوامل العلاجية التي من شأنها أن تخفف من وقع هذه الالتهابات. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير للمستخدم مع طريقة مرنة لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للإصابة الممرض باستخدام الممرض المرتبطة نمط الجزيئية (PAMP) كبديل للبكتيريا حية. وقد ركزت معظم الدراسات السابقة تقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للبكتيريا على نماذج البريتوني بسبب السهولة النسبية التنفيذ. في حين أن هذه النماذج مفيدة للغاية وأدت إلى تقدم كبير في مجال التفاعلات المضيف الممرض والتهاب النظامية، والبيانات الناتجة من هذه النماذج ليست دائما ملائمة للدراسات involviنانوغرام الجهاز التنفسي. هنا، يقترح نموذجا الرئوي التهاب الرئة الحاد كما توسع عملية وذات الصلة سريريا من النماذج الكلاسيكية حقن داخل الصفاق (IP). تقنية المقترح يسمح للتقييم المحلي للاستجابة المناعية الفطرية في نظام الجهاز نموذج محدد.
وقد صممت الطرق الموضحة هنا لتوفير تقنية بسيطة وقوية للسماح للمستخدمين لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف LPS، وهو PAMP المشتركة. وتستند طرق على داخل الرغامى (ذلك) من تقطير LPS، والذي يؤدي الى الاستجابة المناعية الفطرية قوية في الرئتين من الفئران ويقلد الكثير من الميزات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي وإصابة الرئة الحادة 1. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يتيح للمستخدم لتقييم الاستجابة المناعية المضيف دون عوامل خارجية ومخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بإجراء الدراسات المجراةاستخدام البكتيريا الحية. وبالمثل، فإن الفم والبلعوم الطريق الادارة انها التعرض الموصوفة في هذا البروتوكول لديه مزايا هامة على التقنيات المستخدمة عادة أخرى، بما في ذلك الأنف (في) الإدارة والإدارة أنه الجراحية. على سبيل المثال، الادارة انها البلعوم يسمح dosaging دقيقة نسبيا وترسب الرئة مقارنة في الإدارة، الذي يعاني عادة من زيادة تقلب ترسب الرئة بسبب فقدان وكلاء في تجويف الأنف والجيوب 2-4. الطريق الادارة انها تلتف هذه التجاويف ويتيح الوصول مباشرة إلى القصبة الهوائية والشعب الهوائية. وبالمثل، فإن النهج الذي الجراحية هو أسلوب الإدارة بشكل ملحوظ أكثر المهووسين ويتطلب التدريب المكثف لإتقان. وتشمل البروتوكولات وصفها هنا أيضا وصفا لتقنيات مشتركة وعلامات بديلة تستخدم لتقييم تطور التهاب وينتهي بروتوكول يصف التقنيات المناسبة لإعداد لوخ ع لتقييم التشريح المرضي. وتركز هذه البروتوكولات على التقليل من عدد من الفئران المطلوبة لكل دراسة من خلال تعظيم البيانات المتولدة من كل حيوان على حدة.
البروتوكولات وصفها مرنة للغاية ويمكن تعديلها بسهولة لتقييم PAMPs مجموعة متنوعة والأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). علاوة على ذلك، مع بضعة تعديلات إضافية، هذه البروتوكولات يمكن أن تطبق أيضا على دراسات تقييم مجرى الهواء حساسية تطور المرض أو التفاعلات المضيف الممرض مع البكتيريا الحية أو الفيروسات أو الفطريات 5-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات بموجب موافقة لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) لجامعة فرجينيا للتكنولوجيا وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. داخل الرغامى (عليه) تلقيح LPS طريق إدارة البلعوم
- تأكد من أن كل حيوان يتم التعرف بشكل فريد باستخدام لكمة الأذن، العلامة الأذن، أو طريقة أخرى وافق مؤسسيا.
- تسجيل وزن الجسم ودرجة حرارة الجسم الأساسية لكل حيوان.
- إعداد الأوراق المالية تعمل من LPS. سوف تتلقى كل الماوس جرعة 50 ميكرولتر من 1 ملغ / كغ LPS في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). سوف تتلقى معاملة الحيوانات وهمية جرعة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- إعداد غرفة المناسبة لإدارة isoflurane وباستخدام طريقة الإسقاط التالية. تختلف المبادئ التوجيهية المؤسسية فيما يتعلق باستخدام isoflurane وكلاء مخدر وغيرها وقبل initiatجي أي دراسات، ينبغي أن الأشخاص الاتصال بقسم مؤسستهم لرعاية الحيوان / رفاهية لضمان استيفاء جميع المبادئ التوجيهية على نحو كاف. إذا الأسلوب انخفاض isoflurane وليس خيارا، وكلاء مخدر الأخرى هي بدائل مقبولة.
- في خزانة السلامة المناسبة، وتطبيق ما يقرب من 3 مل من isoflurane وعلى منشفة ورقية ماصة مطوية ومكان في الجزء السفلي من كوب 500 مل.
- وضع قطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم على رأس منشفة ورقية، وتغطي الدورق مع غطاء شفاف.
- إعداد الأدوات والكواشف التي سيتم استخدامها أثناء ذلك التلقيح. ضع الشريط المطاطي من شأنها تأمين الحيوانات يتوجه على الوقوف التنبيب. وهذا الإجراء يتطلب زوج من ملقط على التوالي، وزوج من ملقط الزاوية أو منحنية، وماصة P200 مع نصائح.
- تحميل 50 ميكرولتر من LPS في تلميح ماصة ووضعه في مكان يسهل الوصول إليه بجانب موقف التنبيب.
- تخدير الماوسعن طريق وضع الحيوان في غرفة isoflurane وتغطي وغرفة مع غطاء شفاف. مراقبة أنماط التنفس الحيوان، والتي سوف يكون سريعا وسطحية عندما وضعت لأول مرة في الغرفة. سيتم تخدير الحيوان بما فيه الكفاية عندما تقترب معدلات التنفس التنفس 1/2 ثانية، والتي يتم التوصل عادة في غضون 30 ثانية من وضع في الغرفة. يجب تخدير الماوس كما جاء في بروتوكول الحيوانية المعتمدة باستخدام طريقة انخفاض isoflurane و.
- إزالة الماوس تخدير من غرفة وتعليق الحيوان على الوقوف إلى جانب القواطع التنبيب صدر صفحتها الأولى. تأكد من أن الحيوان هو ضبط النفس بشكل آمن والفم واللسان يمكن الوصول إليها.
- تأمين بلطف اللسان مع ملقط على التوالي. فهم اللسان مع ملقط الزاوية وسحب بلطف عليه للخروج من الفم حتى يشعر مقاومة طفيفة. هذا العمل هو كاف لمنع سان المزمار والوصول إلى القصبة الهوائية.
- مع الاستمرار في عقد اللسان فيموقف الموسعة، إدارة جرعة 50 ميكرولتر من LPS في الجزء الخلفي من الحلق، وتغطي على الفور الخياشيم الحيوان مع إصبع القفاز. سوف LPS تكون مرئية في الجزء الخلفي من الحلق حتى يستنشق الماوس.
- مواصلة لتغطية الأنف وعقد اللسان تمديدها لمدة 5-10 الأنفاس إضافية.
- إزالة الماوس من الوقوف التنبيب ووضع الحيوان مرة أخرى في قفص جديدة حتى يتعافى من التخدير.
- رصد علامات بديلة متوافقة مع تطور المرض. وينبغي رصد وزن الجسم ودرجة حرارة الجسم كل 4-8 ساعة لمدة الدراسة. وبالمثل، وتقييم الخصائص السلوكية والأعراض السريرية يرتبط مع زيادة المراضة.
- لتقييم تطور المرض والفئران الحصاد عند نقطة زمنية محددة عقب التعرض LPS. نموذجية الوقت نقاط للحصاد بعد التعرض LPS تشمل 0، 6، 12، 18، 24، و 48 ساعة. لتقييم الانتعاش والبقاء على قيد الحياة، وتقييم الفئران لمدة 7 دايس بعد التلقيح.
2. المصل والقصبات الغسل الموائع (BALF) جمع
- التضحية الماوس باستخدام أسلوب معتمد مؤسسيا.
- وضع الحيوان على ظهرها وثبته إلى لوحة التشريح، من الناحية المثالية 0.5 في (1.27 سم) في الطول.
- الرطب الماوس كامل مع الايثانول 70٪.
- باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 27 G، إجراء ثقب في القلب قبل اتخاذ أي شقوق. وينبغي أن يكون من الممكن سحب 500-800 ميكرولتر من الدم الكامل من ماوس واحدة.
- إزالة الإبرة من الحقنة ونقل الدم الكامل إلى prelabeled 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لجمع المصل، والسماح للتخثر الدم الكامل لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى جمع مصل، ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الإجراء من خلال دمج مضاد للتخثر في أنبوب والمحاقن، وقبل جمع الدم كله، لدراسة تعميم الخلايا المناعية.
- جعل شق أفقي وعبور طول التجويف البريتوني وشق عمودي من التجويف البريتوني في الفك السفلي من الماوس.
- باستخدام ملقط، فهم كلا الجانبين من شق وبرفق الجلد بعيدا عن تجاويف البريتوني والصدري الأساسي.
- إجراء شق كبير على طول التجويف البريتوني من الأعضاء التناسلية إلى القص، مع الحرص على تجنب قطع الحجاب الحاجز. تحول بلطف الأمعاء في التجويف البريتوني للسماح بالوصول إلى واحدة من الكليتين.
- قطع الوريد الكلوي مما يؤدي إلى الكلى لتكون بمثابة نقطة الصرف لنضح.
- نيك الحجاب الحاجز باستخدام مقص، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب، لفضح الجانب الأيسر من القلب.
- يدويا يروي القلب باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 27 G والحل برنامج تلفزيوني 1X. تجنب استخدام القوة المفرطة خلال نضح لضمان أن المياه المالحة لا اضطر إلى الرئتين. الدم المتبقية يجب أن تستنزف من شق الوريد البابي.
- قطع بعناية القفص الصدري على طول القص باستخدام كليلة / مقص حادة، مع الحرص على تجنب قطع القلب والرئتين. وقطع بطريق الخطأ الرئتين أثناء هذا الإجراء خفض كبير في كمية BALF جمعها وسوف يؤدي إلى عدم القدرة على تضخيم الرئتين بشكل صحيح مع مثبت.
- بلطف عزل القلب والرئتين بعيدا عن القفص الصدري باستخدام ملقط. قطع بعناية كل قسم من القفص الصدري باستخدام مقص حادة / حادة أقرب إلى العمود الفقري ممكن، وإزالة كل المقاطع بشكل كامل.
- فصل الغدد اللعابية باستخدام ملقط أو إزالتها باستخدام مقص، لفضح القصبة الهوائية.
- قطع بعناية العضلات التي تراكب القصبة الهوائية باستخدام المقص. فمن الضروري أن لا يتم قطع القصبة الهوائية أثناء هذه العملية.
- باستخدام مقص، فصل الترقوة المغطي القصبة الهوائية.
- فهم بلطف الغدة الصعترية باستخدام ملقط ورفع الأنسجة بعيدا عن القلب. إزالة الغدة الصعترية باستخدام مقص، مع الحرص على تجنب قطع القلب أو الرئتين.
- جعل شق أفقي صغير في القصبة الهوائية 1-2 حلقات تحت الحنجرة باستخدام مقص الزاوية (زاوية 45-90 درجة مئوية، حاد / حاد). ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لشق تأمين بحزم قنية.
- إدراج قنية بحيث نهاية مدبب يمتد 2-3 حلقات القصبة الهوائية أسفل شق وتأمين قنية في مكان باستخدام الخيط الحرير. تأكد من أن يمر بين خياطة القصبة الهوائية والمريء ويتم سحبها مشددة على قنية.
- ملء حقنة 1 مل مع 1 مل من محلول هانكس مخزنة المالحة (HBSS) وإدراج بلطف بالتركيبة لها في قنية.
- باستخدام حركة بطيئة، ولكن ثابتة، وضخ 900 ميكرولتر ~ في القصبة الهوائية، تضخيم الرئتين، والانسحاب فورا HBSS. وضع BALF تعافى في أنبوب مخروطي 15 مل.
- كرر هذا غسل 2 مرات إضافية لجمع ما يقرب من 3 مل من BALF لتحليل المستقبل. تخزين BALF على الجليد أو على 4 º مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
الحمار = "jove_title"> 3. إعداد التشريح المرضي
- إدراج حقنة 10 مل في موقف التضخم الرئة. تجميع أنابيب إلى بالتركيبة، وبالتركيبة إلى محبس، ومحبس إلى الحقنة. ضمان محبس هو في موقف مغلقة. سوف الحقنة 10 مل بمثابة خزان تدفق الجاذبية. يجب أن يرفق الخزان إلى الوقوف التضخم 4.75 في أعلاه الحيوان والجزء العلوي من الخزان ينبغي أن تمتد 10.5 في أعلاه الحيوان.
- ملء المحاقن مع حل الفورمالين محايدة مخزنة. تأكد من أن حقنة يمتلئ تماما مع تثبيتي.
- وضع منشفة ماصة تحت نهاية مفتوحة للأنابيب وفتح محبس للسماح للتثبيتي لملء الأنابيب. مرة واحدة يبدأ تثبيتي تتدفق من الأنابيب، فورا بإغلاق محبس وإعادة ملء الحقنة إلى الأعلى مع تثبيتي. من المهم أن حقنة يكون شغلها تماما لتوفير كمية مناسبة من الضغط للتضخم الرئة.
- ربط عقدة فضفاضة واحد في خياطة؛ ومع ذلك، لا سحب ضيق عقدة.
- إدراج أنابيب من التضخم الماوس الوقوف في قنية.
- فتح محبس والسماح لملء الرئتين عن طريق التضخم الجاذبية.
- مرة واحدة تصل إلى الرئتين أقصى مستوى التضخم بها، وسحب الخيط ضيقة وربط عقدة الثاني.
- إغلاق محبس وإزالة أنابيب من قنية.
- بلطف إزالة قنية من القصبة الهوائية من خلال استيعاب خياطة مع زوج من ملقط وعقد قنية مع الأصابع. بحزم سحب الخيط إلى أسفل نحو التجويف الصدري وقنية إلى الخلف نحو الأنف الفأر.
- فهم بلطف القصبة الهوائية أو الغرز مع ملقط ورفع القصبة الهوائية بعيدا عن تجويف الرقبة.
- قطع القصبة الهوائية والذيلية للخياطة مرتبطة باستخدام مقص حادة.
- مرة واحدة في القصبة الهوائيةوخالية من الأنسجة الكامنة، والبدء في سحب القصبة الهوائية بعيدا عن الماوس. رفع بلطف الرئتين من التجويف الصدري.
- قطع بعناية النسيج الضام عقد الرئتين في التجويف الصدري. مواصلة سحب القصبة الهوائية بعيدا عن الجسم الماوس، وتطبيق قوة صاعد مستمر في حين قطع الاتصالات الأساسية. الحرص على تجنب قطع الرئتين. نلاحظ أن القلب ينبغي أن يترك تعلق على الرئتين باستخدام هذا الأسلوب.
- بمجرد إزالة الرئتين، ووضعها في 10 مل من الفورمالين مخزنة.
- إزالة جزء من ذيل الماوس لالتنميط الجيني.
- التخلص من الذبيحة الماوس التالية المبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة.
4. التقييم خلوى
- أجهزة الطرد المركزي الدم كله، جمعت تحت الخطوة 2.5، في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق لعزل المصل. نقل المصل إلى prelabeled 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تقييم سيرومستويات م خلوى بواسطة ELISA أو مقايسة أخرى مماثلة. تمييع الدم 1:05 حتي 1:20 في وجود مخزن مؤقت التخفيف المناسبة، اعتمادا على الفحص، بعد بتصنيع التعليمات. وينبغي أن تحدد هذه التخفيفات تجريبيا قبل تشغيل الجزء الأكبر من العينات.
- ويرجع ذلك إلى انخفاض حجم الدم التي تم جمعها، والحد من حجم العينة تحميلها على لوحة ELISA بمقدار النصف. على سبيل المثال، فإن معظم ELISAs التجارية الاستفادة من 100 مجلدا ميكرولتر من المعايير والعينات. للحفاظ على العينات، تحميل 50 ميكرولتر من المعايير والمصل المخفف لكل بئر.
- أجهزة الطرد المركزي في BALF في جهاز للطرد المركزي الطاولة المبردة في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف الخلية الحرة إلى قسمين prelabeled 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تقييم السيتوكينات BALF بواسطة ELISA أو مقايسة أخرى مماثلة دون تمييع.
- مخزن المصل غير المستخدمة وBALF في -80 درجة مئوية.
5. الفرق تلطيخ وBAL الخلوية التقييم
- بعد الطرد المركزي BALF وكاملة إزالة HBSS، ليز خلايا الدم الحمراء مكعبات باستخدام المياه المالحة ناقص التوتر. resuspend الخلايا في 900 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة على الفور 100 ميكرولتر من 10X PBS.
- ليز بشكل فردي كل عينة. إذا العينات تحتوي على كميات كبيرة من خلايا الدم الحمراء، وخلايا يمكن مكعبات في أجهزة الطرد المركزي في أعلى الجدول 400 x ج لمدة 5 دقائق ويمكن تكرار الدم الحمراء بروتوكول تحلل الخلية.
- تحديد إجمالي الخلوية BALF في تعليق 1 مل باستخدام عدادة الكريات تحت 10X أو 20 X التكبير مع التريبان الأزرق تلطيخ. تقييم وتقديم هذه البيانات في خلية / مل.
- إعداد مواد للcytospin تلطيخ والتفضيلية. تسمية شرائح المجهر القياسية باستخدام قلم رصاص أو قلم مقاومة المذيبات. تأمين الشرائح في شريحة cytospin والقمع. تأمين الشريحة التجمع في الدوار cytospin.
- Cytospin 150 ميكرولتر من BALF في 100 x ج لمدة 5 دقائق. إذا كانت كثافة الخلية كبيرة جدا على نحو فعالتقييم مورفولوجيا الخلايا والحد من حجم نسج أسفل على الشرائح. تسمح الشرائح على الهواء بين عشية وضحاها الجافة.
- الفرق وصمة عار على الشرائح التالية المصنوعات البروتوكولات. تسمح الشرائح على الهواء بين عشية وضحاها الجافة. ساترة الشرائح باستخدام Permount وتقييم الشرائح باستخدام المجهر مجهزة الهدف 20X 40X و.
- حصاد الخلايا المتبقية لتحليلها لاحقا، مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية، المجهر الإلكتروني، المجهري متحد البؤر، واستخراج الحمض النووي الريبي لتقييم التعبير الجيني، و / أو استخراج البروتين لطخة غربية.
6. تقييم التشريح المرضي
- إعداد الرئتين لتقييم التشريح المرضي. بعد 24-48 ساعة من الفورمالين التثبيت، توجيه البطني تضخم الرئتين كله وجزءا لا يتجزأ من البارافين. قطع الكتل الناتجة لفضح الهوائية الموصلة الرئيسي.
- لتحسين دقة التهديف، ضع الرئتين في نفس الموقف وتقليم كل كتلة لأقصى قدر من التصور طولية رانه داخل الرئة الهوائية المحوري الرئيسي. من هذه النقطة، وقطع 5 ميكرون المقاطع المسلسل وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). أقسام إضافية ويمكن خفض وإعدادها للفي الموقع التهجين باستخدام البروتوكولات القياسية.
- تقييم التشريح المرضي باستخدام نظام التهديف نصف الكمية على أساس المعايير التالية التهابات، والتي سجل بين 0 (تغيب) و 3 (شديدة): وحيدات النوى والنوى تسلل خلية؛ مجرى الهواء تضخم الخلايا الظهارية والإصابات؛ التسرب؛ حول الوعاء واستكفاف peribroncheolar؛ و٪ من الرئة تشارك مع التهاب. وينبغي تقييم التشريح من قبل الطبيب الشرعي الرئة من ذوي الخبرة.
- متوسط جميع الدرجات المعلمة لتوليد ما مجموعه نقاط التشريح المرضي أو استخدام عشرات الفردية لقياس جوانب معينة من تطور المرض. إجراء جميع التهديف بطريقة التعمية المزدوجة، مع المراجعين أعمى إلى كل من النمط الجيني والعلاج. وكان هذا النظام التهديف previouslوصف ذ 6،7،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتتكون جدران الخلايا من البكتيريا سالبة الجرام من LPS، والتي هي وفيرة للغاية في البيئة. استنشاق LPS في التجمعات البشرية حساسة يزيد من تفاقم تفاعل مجرى الهواء، وقادر على إحداث response11 مناعية قوية. LPS هو أيضا PAMP الشائعة المستخدمة في نماذج الماوس لاستثارة الاستجابة المناعية الفطرية القوية. في وصف بروتوكول هنا، تلقت الفئران جرعة من أنها معزولة عن LPS E. القولونية (المصلي 0111: B4) باستخدام الادارة انها الفم والبلعوم. في نماذج من التعرض LPS، سواء درجة حرارة الجسم والوزن هي علامات بديلة نموذجية من الاعتلال الحيوانية وتطور المرض. سيكون التحدي LPS يسبب انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم ضمن 6 ساعة الأولى، والتي سوف تزيد تدريجيا إلى خط الأساس على مدار 24 ساعة (الشكل 1A). ومع ذلك، فإن وزن الجسم ينخفض بشكل مطرد على مدار 24 ساعة (الشكل 1B)، حيث سوف يصل إلى ذروته تدريجيا واستعادة أكثر من نتحويلة 48-72 ساعة. وبالتالي، ودرجة حرارة الجسم هو علامة أكثر ملاءمة لتقييم المراحل المبكرة من التهاب بدء؛ في حين، ووزن الجسم هو أكثر موثوقية خلال مراحل لاحقة من المرضية والانتعاش.
النتائج التعرض الهوائية LPS في تدفق كبير من الكريات البيض إلى الرئتين. ضمن أول 6 ساعة، والخلايا المرتبطة المضيف الاستجابة المناعية الفطرية يمكن ملاحظتها في BALF (الشكل 1C). تواصل الخلوية BALF لزيادة مدى 24-48 ساعة القادمة (الشكل 1C)، حيث قمم استجابة مناعية، وبعد ذلك يدخل في فترة من القرار الالتهاب. قبل 24 ساعة، وعدد كبير من العدلات موجودة في الرئتين ويمكن ملاحظتها في BALF التالية تلطيخ التفاضلية (أرقام 1D و1E). توفير تقييمات الخلوية BALF تقنية قوية وقابلة للقياس الكمي لتوصيف الخلايا المرتبطة استجابة المضيف المناعية في الرئة. وincrسهولة في BALF الخلوية يتسق مع تدفق كبير من العدلات في الشعب الهوائية والأوعية الدموية والرئة في لحمة (أرقام 1F و1G). التشريح المرضي الرئة يمكن تقييمها على نحو فعال باستخدام نظام التهديف نصف الكمية (الشكل 1F). فمن الممكن أن يسجل بدقة التشريح المرضي في معالم محددة في الرئتين من الحيوانات المختلفة عندما يتم تضخيم بدقة الرئتين إلى نفس الحجم مع تثبيتي، وأقسام معالجة لتكشف عن أقصى التصور الطولي للمجرى الهواء داخل الرئة المحوري الرئيسي. بروتوكول التضخم على أساس الجاذبية، وصفها هنا، يهدف إلى تسهيل هذا النظام التهديف. LPS يؤدي الى زيادة كبيرة في حول الوعاء، peribroncheolar والتهاب متني (الشكل 1G).
إدارة LPS يحرض على مستويات عالية من الوسطاء الموالية للالتهابات المحلية والنظامية، بما في ذلك العديد من السيتوكينات المرتبطةالاستجابة المناعية الفطرية. يمكن تقييم مستويات خلوى المحلية في BALF باستخدام التقنيات التقليدية، مثل ELISA. تشمل السيتوكينات الشائعة التي تصل ينظم في الرئتين التالية الإدارة LPS TNF-α، IL-1β، وIL-6 (الشكل 2A). يمكن تقييم مستويات خلوى النظامية في المصل باستخدام نفس الأساليب كما هو موضح في تقييم BALF (الشكل 2B). ليس من غير المألوف بالنسبة لبعض الوسطاء أن يكون حاضرا في المكروية المحلية، ولكن تغيب في المصل. على سبيل المثال، تم العثور TNF-α بشكل روتيني عند مستويات مرتفعة في الرئتين التالية LPS، ولكن لم يتم العثور عليها عادة بشكل منتظم وفقا للشروط الموضحة في هذا البروتوكول (أرقام 2A و 2B؛ دون مستوى الكشف).
الشكل 1. البلعوم الإدارة LPS داخل الرغامى زيادة المراضة والتهاب مجرى الهواء في الفئران. تلقت ذكر الفئران 1 ملغ / كغ من E. تم تقييمها والأمراض المرضية على مدار 24 ساعة AB) LPS يؤدي الى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم في غضون 6 ساعة من الإدارة؛: القولونية LPS (B4 المصلي 0111). في حين أن فقدان وزن الجسم هو أكثر وضوحا في نقاط وقت لاحق. C) LPS يؤدي الى زيادة كبيرة في مجموع الخلوية BALF. DE) العدلات هي نوع من الخلايا تهيمن الموجودة في الرئتين 24 ساعة التالية الإدارة LPS، كما يتضح من تلطيخ التفاضلية من خلايا معزولة عن BALF. وعادة ما يتم توضيح هذه البيانات كما في المئة من كل نوع من الخلايا الموجودة في BALF. يمكن تقييم التشريح المرضي F) الرئة باستخدام نظام التهديف نصف الكمية استنادا الى اثنين من التقييم المستقلق من التهاب مجرى الهواء داخل الرئة المحيطة المحوري الرئيسي. G) وهناك كمية كبيرة من حول الوعاء وperibroncheolar استكفاف، خفيفة التهاب متني وبعض انسداد السنخية طفيفة عادة لوحظ 24 ساعة بعد التعرض LPS الرئة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. التعرض لLPS نتائج الهوائية في زيادة مستويات السيتوكينات المحلية والجهازية. A) بعد التعرض LPS، المستويات المحلية من طيف واسع من السيتوكينات الموالية للالتهابات يمكن ملاحظتها في BALF ضمن أول 24 ساعة، بما في ذلك TNF-α، IL-1β، وIL-6. يمكن تقييم هذه السيتوكينات باستخدامELISA، كما هو موضح هنا 24 ساعة بعد التعرض LPS. B) ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن العديد من السيتوكينات النظامية في المصل. ومع ذلك، هناك بعض الاستثناءات البارزة، بما في ذلك TNF-α، والتي توجد في مستويات عالية في BALF ولكن ليس في المصل. وينبغي تقييم السيتوكينات من الاهتمام في المصل تجريبيا قبل التقييم على نطاق واسع. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. التضخم الرئة عن طريق الجاذبية النزوح النتائج في انخفاض التقلب التشريح المرضي وتحسين التصور. يسمح أسلوب التهجير خطورة تثبيت الموصوفة في هذا البروتوكول لأفضل المقارن تقييم التشريح المرضي تثبت إد إلى الرئتين uninflated أو التضخم اليدوي. AB) الرئتين إصلاحها من خلال التضخم الجاذبية ميزات موحدة تسمح التهديف دقيقة، وخفض الضرر السنخية، وتعزيز التصور، وتقييم دقة أعلى من الالتهاب. CD) التضخم دليل الرئتين النتائج عادة في المناطق غير منتظم من التضخم. C) وغالبا ما تضخم هذه المناطق غير منتظم جزئيا، مما أدى في المناطق التي انهارت مخطئون باسم الميزات المرضية من قبل المراجعين المبتدئين. D) النتائج دليل التضخم أيضا في مناطق من الرئتين التي هي الإفراط في تضخم، مما يؤدي إلى أضرار جسيمة السنخية مسافات. E) الرئتين Uninflated إظهار المساحات والمناطق التي يصعب حلها وتقييم التدريب المكثف دون السنخية المنهار. وبالمثل، ويرجع ذلك إلى الهيئة التي انهارت هذه التقنية لا يسمح التصور من الرئتين كما تظهر في الموقع.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية لتقييم بنجاح استجابة المضيف المناعية في الماوس الرئتين هي كما يلي: 1) اختيار سلالة الفأر المناسبة والجنس لنموذج يجري تقييمها؛ 2) تحسين تسليم PAMP إلى الرئتين؛ 3) جمع بشكل صحيح ومعالجة BALF؛ و4) إصلاح بشكل صحيح وإعداد الرئتين لتقييم التشريحية المرضية.
اختيار سلالة الفأر هو عامل مهم في تقييم الاستجابة المناعية المضيف. تعتبر C57BL / 6 الفئران عادة الخلفية الماوس الأمثل لدراسة المناعة الفطرية بسبب الاستجابة Th1 استجابتها انحراف وقوية لمعظم PAMPs. وبالمثل، عادة ما تستخدم الفئران BALB / ج لدراسة نماذج أمراض الحساسية بسبب انحراف الاستجابة Th2 بهم. ثلث السلالة التي يشيع استخدامها في نماذج الفئران الرئة هي على خلفية 129SvEv، وذلك بسبب الاستعمال الشائع في توليد الحيوانات المعدلة وراثيا. في جميع الحالات، ينبغي اتخاذ الحذر خلال التصميم التجريبي وكلما كان ذلك ممكنا، والعمر والجنس أماهوينبغي أن تستخدم الحيوانات السيطرة لتر زميله tched للدراسات مقارنة الفئران المعدلة وراثيا مع نوع الحيوانات البرية. عادة، لبروتوكول LPS وصفها هنا، الجنس 6-12 أسبوع من العمر المتطابقة C57BL / 6 الفئران ينبغي أن تستخدم وينبغي أن تزن ما لا يقل عن 20 غراما. فمن الممكن أن التعرض LPS سوف يؤدي إلى ارتفاع مستويات المراضة والوفيات بين سلالات الفئران حساسة أو المورثات. إذا حدث هذا، قد يكون من الضروري لضبط جوانب عديدة من هذا البروتوكول، بما في ذلك خفض الجرعة LPS، وذلك باستخدام الحيوانات الكبيرة، والتبديل بين الجنسين من الحيوانات المستخدمة في التجربة. وينبغي إجراء تجارب على نطاق صغير في البداية لتحديد حساسية الحيوان وينبغي أن تستند شروط كل تجربة على النمط الوراثي الأكثر عرضة أو حالة تجريبية.
تم العثور على الادارة انها الفم والبلعوم إلى أن تكون أكثر دقة من غيرها من أشكال تسليم كيل إلى الرئتين 2. هذا هو في جزء كبير منه بسبب الوصول المباشر إلى منظمة العفو الدوليةrway والتحايل على القضايا المرتبطة الأنف وتجويف ترسب الجيوب الأنفية. ومع ذلك، كما هو الحال مع جميع الإجراءات الحيوان، فإنه يتطلب إدارة مكثفة البراعة والممارسة اليدوية لتحقيق الكفاءة. تقنية غير لائق يمكن أن يؤدي إلى ترسب الرئة غير فعالة وفي بعض الحالات يؤدي إلى إصابة الحيوان. عادة، ايفانز الأزرق صبغ (EBD) يمكن استخدامها بشكل فعال إما أداة تدريبية لهذا الإجراء أو استكشاف المشكلات المحتملة المرتبطة ترسب 4. EBD يمكن أن تدار بها وبعد ذلك المستخرجة من الأنسجة باستخدام الفورماميد. ويمكن حساب كمية EBD باستخدام مستويات الاستيعاب مقارنة ضد منحنى القياسية. في أيدينا، يتراوح الانتعاش EBD نموذجية بين 90-98٪. ومن المتوقع أن تترافق مع تسرب إلى المريء الجزء الأكبر من الصبغة التي لم يتم انتشالها. نظرا لدقتها، وتقنية الإدارة أنها مثالية لتقديم مجموعة متنوعة من وكلاء الحساسة الجرعة إلى الرئتين، مثل وكلاء الأدويةأو الكائنات المعدية.
تحليل BALF وBALF الخلوية يمكن أن توفر قدرا كبيرا من التبصر في التقدم الشامل للاستجابة المناعية. وسطاء التهابات صدر محليا في الرئتين بعد التحفيز يمكن قياسها كميا بشكل فعال في BALF باستخدام تقنيات علم المناعة المشتركة، مثل ELISA والغربية وصمة عار. وبالمثل، وتكوين الخلوية من BALF يمكن تقييمها باستخدام إما الفرق تلوين الخلية أو التدفق الخلوي. تطوير هذه التقنية والبراعة اليدوية السليم هو الجزء الأكثر أهمية من أداء غسيل القصبات (BAL). واحدة من القضايا الأكثر شيوعا التي تحدث أثناء BAL هو عدم الانسحاب الكامل أقصى حجم السائل ضعت أصلا في الرئتين. ويرتبط هذا عادة مع قنية تأمينها بطريقة غير سليمة أو عندما تستخدم الإبر في مكان قنية الفعلية. تتوفر تجاريا قنية القصبة الهوائية المتخصصة. من المهم أيضا أن الحركة والقوةيستخدم لادخال وسحب المياه المالحة على نحو سلس وثابت في جميع أنحاء الداخلي. وقد تم تحسين البروتوكول الموصوفة هنا لتلطيخ التفاضلية من الخلايا التي تم جمعها في BALF. تلطيخ الفرق هو تعديل رايت بالغيمزا صمة عار وتقنية فعالة للغاية لإجراء التشكل على أساس تحديد الخلية. هذه التقنية تلطيخ يسمح لتمايز العدلات والحمضات على أساس خصائص فريدة من نوعها الحبيبية تلطيخ بهم. الوحيدات الخلايا المشتقة هي أيضا من السهل تحديد ويلاحظ عادة في BALF. وتشمل هذه الضامة والخلايا الجذعية. وبالمثل، وكما لاحظ الخلايا التائية والخلايا البائية عادة. ومع ذلك، وهذه الخلايا الوحيدات والخلايا الليمفاوية غالبا ما تكون صعبة بالنسبة لمعظم الباحثين في التفريق بدقة على أساس التشكل وحدها. الاستفادة من التدفق الخلوي يمكن أن تضيف قرار أعلى من ذلك بكثير لهذه التقييمات. ومع ذلك، أرقام الخلية منخفضة تعافى من الحيوانات السيطرة وغالبا ما يكون العامل المحدد. وبالتالي، إذا cytom تدفقetry لاستخدامه، والتصميم التجريبي وينبغي أن تشمل الحيوانات سيطرة سلبية إضافية لزيادة الانتعاش الخلية.
تقييم التشريح المرضي الرئة هي عنصر حاسم آخر من هذا البروتوكول والسماح للرؤية مباشرة من تطور المرض (أرقام 3A 3B و). عندما يتم إعداد الرئتين بشكل صحيح، التشريح المرضي يمكن تقييمها بدقة، كميا، وتتميز. الخطوة الأكثر أهمية في إعداد الرئتين ليتم تضخيم التشريح المرضي بشكل صحيح لهم تثبيتي. الطرق اليدوية التضخم يؤدي عادة في الرئتين التي هي الإفراط في تضخم، في إطار تضخم أو تضخم جزئيا، مما يؤدي إلى التصور الأمثل وتقييم التشكل (أرقام 3C و 3D، على التوالي). وبالمثل، الرئتين التي لا تضخم قبل التثبيت من الصعب جدا تقييم دقيق وغالبا ما يؤدي إلى عشرات التشريح المرضي متغير بدرجة كبيرة (الشكل 3 E). طريقة خطورة التضخم مناقشتها هنا يوفر طريقة استنساخه للغاية من التضخم مع الحد الأدنى من التقلبات. باستخدام هذه التقنية، فمن الممكن لتقييم معالم محددة في الرئتين التي تنسجم بين حيوانات التجارب. وعلاوة على ذلك، فقد تبين التضخم الجاذبية باستخدام موقفا التضخم لتضخيم الرئتين عند ضغط تثبيتي من 20 ملم 12. هذا الأسلوب يسمح التصور من الرئتين في هم الأكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية حجم وشكل ولقد ثبت أن تكون فعالة للغاية لتقييم العمليات الفيزيولوجية المرضية الحساسة 12. فمن الأهمية بمكان أن يتم تعيين موقف التضخم في الارتفاع المناسب من الماوس لتوليد الضغط المناسب. إذا لوحظ التضخم دون المستوى الأمثل، ينبغي أن تحدد ارتفاع التضخم موقف تجريبيا. استخدام صغيرة موقفا التضخم القوارض الرئة المتاحة تجاريا، والتي سوف تضمن الارتفاع المناسب، فمن المستحسن.
ر "> وقد تم تحسين هذا الإجراء لتسليم LPS وPAMPs أخرى إلى الرئتين من الفئران. بمجرد يتقن هذه التقنيات، ويمكن أيضا أن تبدأ دراسات إضافية باستخدام بروتوكولات تعديل لتقييم فعالية التفاعلات المضيف الممرض باستخدام مسببات الأمراض الحية وبالمثل، الأساليب المذكورة هنا هي متعددة للغاية ويمكن تطبيقها على أي دراسة المهتمة في تقدير أهمية السريرية والفيزيولوجية وكيل التجريبية أو الصيدلانية. نظرا للدقة في الجرعات، وهذا الأسلوب هو أيضا مثالية للفي الدراسات المجراة التي تتطلب عالية مستوى الدقة في التسليم وكيل.وقد تم تحسين هذا الإجراء لتسليم LPS وPAMPs أخرى إلى الرئتين من الفئران. بمجرد يتقن هذه التقنيات، ويمكن أيضا أن تبدأ دراسات إضافية باستخدام بروتوكولات تعديل لتقييم فعالية التفاعلات المضيف الممرض باستخدام مسببات الأمراض حية. وبالمثل، فإن الأساليب المذكورة هنا هي متعددة للغاية ويمكن به تطبق على أي دراسة المهتمة في تقدير أهمية السريرية والفيزيولوجية وكيل التجريبية أو الصيدلانية. بسبب دقة في الجرعات، وهذا الأسلوب هو أيضا مثالية للفي الدراسات المجراة التي تتطلب مستوى عال من الدقة في التسليم وكيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر كلية VA-MD الإقليمي للطب البيطري لتوفير الأساسية والدعم التقني لهذا المشروع. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح التطوير المهني (K01DK092355).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
