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Immunology and Infection

चूहे में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए Oropharyngeal intratracheal PAMP प्रशासन और ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage की उपयोगिता

Published: April 2, 2014 doi: 10.3791/51391
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

रोगज़नक़ संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है. चूहों में एक lipopolysaccharide फेफड़ों जोखिम मॉडल का उपयोग, यह रोग रोगजनन के साथ जुड़े जटिल तंत्र के उच्च संकल्प मूल्यांकन का संचालन करने के लिए संभव है.

Abstract

रोगजनकों के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक जटिल जैविक प्रक्रिया है. vivo अध्ययन के बहुमत प्रतिष्ठित मेजबान रोगज़नक़ बातचीत चूहों में चुनिंदा बैक्टीरिया या रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) की intraperitoneal इंजेक्शन का लाभ लेने के लिए चिह्नित करने के लिए कार्यरत हैं. इन तकनीकों संक्रामक रोग pathobiology के साथ जुड़े जबरदस्त डेटा प्राप्त हुए है, वहीं intraperitoneal इंजेक्शन मॉडल हमेशा फेफड़ों में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं. चूहों में एक गंभीर फेफड़ों की सूजन मॉडल का उपयोग, यह सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (LPS) lipopolysaccharide उपयोग मेजबान के एक उच्च संकल्प विश्लेषण का संचालन करने के लिए संभव है. यहाँ, हम, nonsurgical oropharyngeal intratracheal प्रशासन का उपयोग LPS प्रशासन रोग रोगजनन के साथ जुड़े नैदानिक ​​मानकों की निगरानी, ​​और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना तरल पदार्थ का उपयोग करने की विधियों का वर्णन. वर्णित तकनीकोंPAMPs और रोगजनकों की एक विविध रेंज के लिए मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. इसी तरह, मामूली संशोधनों के साथ, इन तकनीकों का भी एलर्जी airway सूजन के मूल्यांकन के अध्ययन में और औषधीय अनुप्रयोगों में लागू किया जा सकता है.

Introduction

रोगजनक बैक्टीरिया की प्रजातियों के साथ जुड़े फेफड़े के संक्रमण वैश्विक रुग्णता और मृत्यु दर का एक आम कारण हैं. इन रोगजनकों के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि ड्राइव तंत्र का निर्धारण इन संक्रमणों के प्रभाव को कम करना होगा कि उपन्यास रोकथाम रणनीति और चिकित्सीय एजेंट के विकास को बढ़ावा देंगे. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य जीवित बैक्टीरिया के लिए एक किराए के रूप में एक रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) का उपयोग रोगज़नक़ संक्रमण के लिए मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक लचीला तरीका के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करना है. बैक्टीरिया को मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के पिछले अध्ययनों के बहुमत के कारण निष्पादन के सापेक्ष कम करने के लिए पेरिटोनियल मॉडल पर ध्यान केंद्रित किया है. इन मॉडलों को अत्यधिक उपयोगी होते हैं और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और प्रणालीगत सूजन के क्षेत्र में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, वहीं इन मॉडलों से उत्पन्न डेटा हमेशा पढ़ाई के लिए उपयुक्त नहीं हैं involviश्वसन प्रणाली एनजी. इधर, गंभीर फेफड़ों की सूजन का एक फेफड़े के मॉडल शास्त्रीय intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) मॉडल का एक व्यावहारिक और नैदानिक ​​प्रासंगिक विस्तार के रूप में प्रस्तावित किया गया है. प्रस्तावित तकनीक एक अंग विशिष्ट मॉडल प्रणाली में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के स्थानीय आकलन के लिए अनुमति देता है.

यहाँ वर्णित विधियों उपयोगकर्ताओं को एक आम PAMP है जो LPS, के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देने के लिए एक सरल और मजबूत तकनीक उपलब्ध कराने के लिए तैयार कर रहे हैं. तरीकों intratracheal चूहों और श्वसन संक्रमण और गंभीर फेफड़ों की चोट 1 से पीड़ित मानव रोगियों में मनाया pathophysiological सुविधाओं के कई mimics के फेफड़ों में एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है जो LPS, के (यह) टपकाना पर आधारित हैं. इस तकनीक का एक प्राथमिक लाभ यह उपयोगकर्ता vivo अध्ययन में आयोजित करने के साथ जुड़े कारकों और सुरक्षा चिंताओं के बिना मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता हैजीवित बैक्टीरिया का उपयोग कर. इसी तरह, इस प्रोटोकॉल में वर्णित जोखिम के oropharyngeal यह प्रशासन मार्ग एडमिनिस्ट्रेशन (में) intranasal और शल्य यह प्रशासन सहित अन्य सामान्य रूप से उपयोग की तकनीक, अधिक महत्वपूर्ण लाभ है. उदाहरण के लिए, oropharyngeal यह प्रशासन आम तौर पर होने के कारण नाक गुहा में एजेंटों के नुकसान के लिए फेफड़ों के बयान की वृद्धि की परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है और 2-4 sinuses जो प्रशासन, में की तुलना में अपेक्षाकृत सटीक dosaging और फेफड़ों के बयान की अनुमति देता है. यह प्रशासन मार्ग इन cavities में गतिरोध उत्पन्न और ट्रेकिआ और airway तक सीधी पहुंच की अनुमति देता है. इसी तरह, शल्य यह दृष्टिकोण एक काफी अधिक रुग्ण प्रशासन विधि है और गुरु के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी आम तकनीकों और सूजन प्रगति का मूल्यांकन और लू की तैयारी के लिए उचित तकनीकों का वर्णन एक प्रोटोकॉल के साथ समाप्त करने के लिए इस्तेमाल किया किराए मार्कर एक विवरण शामिलऊतकविकृतिविज्ञानी आकलन के लिए NGS. इन प्रोटोकॉल प्रत्येक व्यक्ति पशु से उत्पन्न डेटा को अधिकतम द्वारा प्रत्येक अध्ययन के लिए आवश्यक चूहों की संख्या कम करने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.

वर्णित प्रोटोकॉल अत्यधिक लचीला कर रहे हैं और आसानी से एक विविध रेंज PAMPs और क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (damps) का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, कुछ अतिरिक्त संशोधनों के साथ, इन प्रोटोकॉल भी एलर्जी airway रोग प्रगति या जीवित बैक्टीरिया, वायरस या कवक 5-10 के साथ मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के मूल्यांकन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

सभी पढ़ाई वर्जीनिया टेक के लिए संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के तहत और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार आयोजित किया गया.

1. Oropharyngeal प्रशासन का प्रयोग LPS की intratracheal (यह) टीका

  1. प्रत्येक जानवर अनोखे एक कान पंच, कान टैग, या अन्य संस्थागत अनुमोदित विधि का उपयोग पहचान की है कि सुनिश्चित करें.
  2. आधारभूत शरीर के वजन और प्रत्येक जानवर के लिए शरीर का तापमान रिकार्ड.
  3. LPS का काम कर स्टॉक तैयार करें. प्रत्येक माउस 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 1 मिलीग्राम / किग्रा LPS की एक 50 μl खुराक प्राप्त होगा. नकली इलाज जानवरों 1x पीबीएस के एक 50 μl खुराक प्राप्त होगा.
  4. निम्नलिखित ड्रॉप विधि का उपयोग isoflurane के प्रशासन के लिए एक उपयुक्त कक्ष तैयार. संस्थागत दिशा निर्देशों initiat को isoflurane और अन्य संवेदनाहारी एजेंटों और पूर्व के प्रयोग के बारे में अलग अलग हैकिसी भी अध्ययन आईएनजी, व्यक्तियों सभी दिशा निर्देशों को पर्याप्त रूप से मुलाकात कर रहे हैं बीमा करने के लिए पशु की देखभाल / कल्याण की उनकी संस्था के विभाग से संपर्क करना चाहिए. ड्रॉप विधि isoflurane एक विकल्प नहीं है, तो अन्य संवेदनाहारी एजेंटों स्वीकार्य विकल्प हैं.
    1. एक उपयुक्त सुरक्षा कैबिनेट में, एक 500 मिलीलीटर बीकर के तल में एक मुड़ा हुआ शोषक कागज तौलिया और जगह पर isoflurane के लगभग 3 मिलीलीटर लागू होते हैं.
    2. कागज तौलिया के शीर्ष पर एल्यूमीनियम पन्नी का एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस और एक पारदर्शी ढक्कन के साथ बीकर को कवर किया.
  5. यह टीका के दौरान उपयोग किया जाएगा कि उपकरण और अभिकर्मकों तैयार करें. जानवरों इंटुबैषेण स्टैंड पर सिर सुरक्षित होगा कि रबर बैंड स्थिति. यह प्रक्रिया सीधे संदंश की एक जोड़ी, angled या घुमावदार संदंश की एक जोड़ी, और सुझावों के साथ एक P200 विंदुक की आवश्यकता होगी.
  6. इंटुबैषेण स्टैंड के पास एक आसानी से सुलभ स्थान में पिपेट टिप और जगह में लोड LPS के 50 μl.
  7. माउस anesthetizeisoflurane चेंबर में पशु रखने और पारदर्शी ढक्कन के साथ चैम्बर कवर द्वारा. पहला कक्ष में रखा गया जब तेजी और उथले हो जाएगा, जो जानवर की सांस लेने पैटर्न का पालन. सांस लेने की दरों में आम तौर पर सदन में रखने के 30 सेकंड के भीतर पहुँच जाता है जो 1 सांस / 2 सेकंड, दृष्टिकोण जब जानवर पर्याप्त anesthetized जाएगा. ड्रॉप विधि isoflurane का उपयोग अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल में कहा गया है माउस anesthetized होना चाहिए.
  8. चैम्बर से anesthetized माउस निकालें और उसके सामने कृन्तक द्वारा खड़े इंटुबैषेण पर पशु रोक देते हैं. पशु सुरक्षित रूप से रोका और मुंह और जीभ पहुंच रहे हैं बीमा है कि.
  9. धीरे सीधे संदंश के साथ जीभ सुरक्षित. Angled संदंश के साथ जीभ समझ और मामूली प्रतिरोध महसूस किया है जब तक धीरे मुँह से बाहर निकलने के. इस कार्रवाई कंठच्छद ब्लॉक और श्वासनली के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है.
  10. में जीभ पकड़ जारी रखते हुएविस्तारित स्थिति, गले के पीछे में LPS के 50 μl खुराक प्रशासन और तुरंत एक दस्ताने उंगली के साथ जानवर की नाक को कवर किया. माउस कश तक LPS गले के पीछे में दिखाई जाएगी.
  11. नाक को कवर किया और 5-10 अतिरिक्त साँस के लिए बढ़ाया जीभ पकड़ जारी है.
  12. इंटुबैषेण स्टैंड से माउस निकालें और यह संज्ञाहरण से ठीक है जब तक वापस एक नए पिंजरे में जानवरों की जगह.
  13. रोग प्रगति के साथ जुड़े किराए मार्करों मॉनिटर. शरीर के वजन और शरीर का तापमान अध्ययन की अवधि के लिए हर 4-8 घंटे निगरानी की जानी चाहिए. इसी तरह, व्यवहार विशेषताओं और वृद्धि की रुग्णता के साथ जुड़े नैदानिक ​​लक्षणों का मूल्यांकन.
  14. LPS प्रदर्शन के बाद विशिष्ट समय बिंदुओं पर रोग प्रगति, फसल चूहों का मूल्यांकन करने के लिए. LPS प्रदर्शन के बाद फसल के लिए विशिष्ट समय अंक 0, 6, 12, 18, 24, और 48 घंटे में शामिल हैं. वसूली और अस्तित्व का मूल्यांकन करने के लिए, 7 दा के लिए चूहों का मूल्यांकनवाईएस बाद टीका.

2. सीरम और ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage द्रव (BALF) संग्रह

  1. एक संस्थागत अनुमोदित विधि का उपयोग माउस बलिदान.
  2. अपनी पीठ पर पशु रखें और ऊंचाई में (1.27 सेमी) में आदर्श 0.5, एक शव - परीक्षा बोर्ड के लिए यह सुरक्षित.
  3. 70% इथेनॉल के साथ पूरे माउस गीले.
  4. एक 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, पहले किसी भी चीरों बनाने के लिए एक हृदय गति समस्या का संचालन. यह एक माउस से पूरे रक्त का 500-800 μl वापस लेने के लिए संभव हो जाना चाहिए.
  5. सिरिंज से सुई निकालें और एक prelabeled 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पूरे रक्त हस्तांतरण. सीरम संग्रह के लिए, पूरे रक्त कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति. सीरम संग्रह के अलावा, इस प्रक्रिया भी पूर्व प्रतिरक्षा कोशिकाओं परिसंचारी अध्ययन करने के लिए, पूरे रक्त एकत्रित करने के लिए ट्यूब और सिरिंज, में एक विरोधी कौयगुलांट शामिल द्वारा संशोधित किया जा सकता है.
  6. एक क्षैतिज चीरा एक बनाओमाउस के निचले जबड़े को peritoneal गुहा की लंबाई और peritoneal गुहा से एक ऊर्ध्वाधर चीरा पार.
  7. संदंश का प्रयोग, चीरा के दोनों पक्षों समझ और धीरे दूर अंतर्निहित पेरिटोनियल और वक्ष cavities से त्वचा खींच.
  8. डायाफ्राम काटने से बचने के लिए, देखभाल करने के गुप्तांग से उरोस्थि को peritoneal गुहा की लंबाई के साथ एक बड़ा चीरा. धीरे गुर्दे में से एक के लिए उपयोग की अनुमति के लिए peritoneal गुहा में आंतों पाली.
  9. छिड़काव के लिए एक जल निकासी बिंदु के रूप में सेवा करने के लिए गुर्दे के लिए अग्रणी गुर्दे की नस काट दिया.
  10. निक डायाफ्राम, कैंची का उपयोग दिल के बाईं ओर का पर्दाफाश करने के लिए, फेफड़ों और हृदय से बचने के ख्याल रख रही है.
  11. मैन्युअल एक 27 जी सुई और 1x पीबीएस समाधान के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग दिल छिड़कना. खारा फेफड़ों के लिए मजबूर नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के छिड़काव के दौरान अत्यधिक बल लगाने से बचें. शेष रक्त पोर्टल नस चीरा से पलायन करना चाहिए.
  12. ध्यान से हृदय और फेफड़ों को काटने से बचने के ख्याल रख रही है, कुंद / कुंद कैंची का उपयोग उरोस्थि साथ ribcage काटा. गलती से इस प्रक्रिया के दौरान फेफड़ों में कटौती काफी एकत्र BALF की मात्रा कम हो जाएगा और ठीक से लगानेवाला साथ फेफड़ों में हवा में असमर्थता में परिणाम होगा.
  13. धीरे दिल और दूर संदंश का उपयोग ribcage से फेफड़ों को अलग. ध्यान से संभव के रूप में रीढ़ की हड्डी के करीब कुंद / कुंद कैंची का उपयोग ribcage के प्रत्येक अनुभाग में कटौती और पूरी तरह से दोनों वर्गों को हटा दें.
  14. संदंश का उपयोग लार ग्रंथियों अलग या कैंची का उपयोग कर उन्हें हटाने, श्वासनली का पर्दाफाश करने के लिए.
  15. ध्यान से कैंची का उपयोग श्वासनली उपरिशायी कि मांसपेशियों में कटौती. यह ट्रेकिआ इस प्रक्रिया के दौरान कटौती नहीं की है कि आवश्यक है.
  16. कैंची का प्रयोग, ट्रेकिआ overlying हंसली अलग.
  17. धीरे संदंश का उपयोग थाइमस समझ और दूर दिल से ऊतक उठा. देखभाल करने के लिए है, जबकि कैंची का उपयोग थाइमस निकालेंदिल या फेफड़े काटने से बचने.
  18. 1-2 छल्ले angled कैंची (45-90 डिग्री के कोण, तेज / तेज) का उपयोग कर गला नीचे श्वासनली में एक छोटे क्षैतिज चीरा. चीरा मजबूती प्रवेशनी सुरक्षित करने के लिए इतना बड़ा होना चाहिए.
  19. पतला अंत चीरा नीचे 2-3 सांस की नली के छल्ले फैली कि इतनी प्रवेशनी डालें और एक रेशम सीवन का उपयोग जगह में प्रवेशनी सुरक्षित. सिवनी ट्रेकिआ और घुटकी के बीच से गुजरता है और प्रवेशनी पर तंग खींच लिया है कि सुनिश्चित करें.
  20. हैंक्स buffered खारा समाधान (HBSS) के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और धीरे प्रवेशनी में अपनी luer डालें.
  21. एक धीमी, लेकिन स्थिर गति का प्रयोग, फेफड़ों inflating, श्वासनली में ~ 900 μl इंजेक्षन, और तुरंत HBSS वापस ले लें. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बरामद BALF रखें.
  22. भविष्य के विश्लेषण के लिए BALF के लगभग 3 मिलीलीटर एकत्र करने के लिए इस पानी से धोना 2 अतिरिक्त बार दोहराएँ. उपयोग के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर BALF स्टोर.

  1. फेफड़ों मुद्रास्फीति स्टैंड में एक 10 मिलीलीटर सिरिंज डालें. Luer, पानी निकलने की टोंटी को luer, और सिरिंज से पानी निकलने की टोंटी को ट्यूबिंग इकट्ठे. पानी निकलने की टोंटी बंद की स्थिति में है सुनिश्चित करें. 10 मिलीलीटर सिरिंज एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह जलाशय के रूप में काम करेगा. जलाशय पशु ऊपर में 4.75 खड़े और जलाशय के ऊपर पशु ऊपर में 10.5 का विस्तार करना चाहिए मुद्रास्फीति से जुड़ी होनी चाहिए.
  2. तटस्थ बफर formalin समाधान के साथ सिरिंज भरें. सिरिंज पूरी तरह लगानेवाला से भर जाता है कि सुनिश्चित करें.
  3. ट्यूबिंग के खुले अंत के तहत एक शोषक तौलिया रखें और लगानेवाला टयूबिंग को भरने के लिए अनुमति देने के लिए पानी निकलने की टोंटी खोलते हैं. लगानेवाला ट्यूबिंग से बह शुरू होता है, तुरंत पानी निकलने की टोंटी बंद और लगानेवाला के साथ शीर्ष पर सिरिंज फिर से भरना. यह सिरिंज पूरी तरह से फेफड़ों मुद्रास्फीति के दबाव का उचित मात्रा में उपलब्ध कराने के लिए भरा होना जरूरी है.
  4. सिवनी में एक भी ढीली गाँठ बाँध; हालांकि, गाँठ तंग खींच नहीं है.
  5. प्रवेशनी में खड़े माउस मुद्रास्फीति से ट्यूबिंग डालें.
  6. पानी निकलने की टोंटी खोलें और फेफड़ों गुरुत्वाकर्षण मुद्रास्फीति से भरने के लिए अनुमति देते हैं.
  7. फेफड़ों उनके अधिकतम मुद्रास्फीति स्तर तक पहुँचने, सिवनी तंग पुल और एक दूसरे गाँठ बाँध.
  8. पानी निकलने की टोंटी बंद करें और प्रवेशनी से ट्यूबिंग हटा दें.
  9. धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ सीवन लोभी और उंगलियों के साथ प्रवेशनी धारण करके श्वासनली से प्रवेशनी हटा दें. मजबूती वक्ष गुहा और वापस माउस नाक की ओर प्रवेशनी की ओर नीचे सिवनी खींच.
  10. धीरे संदंश के साथ ट्रेकिआ या टांके समझ और दूर गर्दन गुहा से श्वासनली उठा.
  11. कुंद कैंची का उपयोग बंधे सिवनी श्वासनली दुम तोड़.
  12. एक बार tracheएक अंतर्निहित ऊतकों से मुक्त है, दूर माउस से श्वासनली खींचने लगते हैं. धीरे वक्ष गुहा के बाहर फेफड़ों उठा.
  13. ध्यान वक्ष गुहा में फेफड़ों पकड़े संयोजी ऊतक में कटौती. दूर माउस के शरीर से श्वासनली खींच जारी है और अंतर्निहित कनेक्शन काटने, जबकि स्थिर उर्ध्व बल लागू होते हैं. फेफड़ों काटने से बचने के लिए ध्यान रखना. दिल छोड़ दिया है इस पद्धति का उपयोग फेफड़ों के लिए संलग्न किया जाना चाहिए ध्यान दें.
  14. फेफड़ों हटा दिया गया है एक बार, बफर formalin के 10 मिलीलीटर में उन्हें जगह है.
  15. जीनोटाइपिंग के लिए माउस पूंछ के एक वर्ग निकालें.
  16. उपयुक्त संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन माउस शव को फेंक.

4. साइटोकाइन मूल्यांकन

  1. सीरम अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर 2.5 कदम के तहत एकत्र पूरे रक्त,, अपकेंद्रित्र. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक prelabeled 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए सीरम स्थानांतरण
  2. SERU मूल्यांकनएलिसा या अन्य इसी तरह परख द्वारा एम साइटोकाइन स्तरों. सीरम 1:5 पतला - निम्न, परख के आधार पर, एक उपयुक्त कमजोर पड़ने बफर में 1:20 निर्देश बनाती है. ये dilutions के अनुभव से पहले नमूने के थोक चलाने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.
  3. कारण एकत्र सीरम की मात्रा कम करने के लिए, आधे से एलिसा थाली पर लादा नमूना मात्रा कम हो. उदाहरण के लिए, सबसे वाणिज्यिक ELISAs मानकों और नमूने के 100 μl संस्करणों का उपयोग. नमूनों, मानकों का भार 50 μl और पतला सीरम के संरक्षण के प्रति अच्छी तरह से करने के लिए.
  4. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक प्रशीतित tabletop अपकेंद्रित्र में BALF. दो में सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और दुकान prelabeled
  5. गिराए बिना एलिसा या अन्य इसी तरह परख द्वारा BALF साइटोकिन्स का मूल्यांकन.
  6. सेल्सियस -80 पर स्टोर अप्रयुक्त सीरम और BALF

5. अंतर धुंधला और बाल कोषमयता मूल्यांकन

  1. BALF centrifugation और पूरा HBSS हटाने के बाद, hypotonic खारा का उपयोग pelleted लाल रक्त कोशिकाओं lyse. आसुत जल के 900 μl में कोशिकाओं Resuspend. तुरंत 10x पीबीएस के 100 μl जोड़ें.
  2. व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूना lyse. नमूने लाल रक्त कोशिकाओं की अत्यधिक मात्रा में होते हैं, कोशिकाओं 5 मिनट और लाल रक्त सेल प्रोटोकॉल दोहराया जा सकता है के लिए 400 XG पर तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में pelleted किया जा सकता है.
  3. Trypan ब्लू धुंधला के साथ 10x या 20 एक्स वृद्धि के तहत एक hemacytometer का उपयोग 1 मिलीलीटर निलंबन में कुल BALF कोषमयता निर्धारित करते हैं. मूल्यांकन और कोशिकाओं / एमएल के रूप में इन आंकड़ों को पेश.
  4. Cytospin और अंतर धुंधला के लिए सामग्री तैयार करते हैं. एक पेंसिल या विलायक प्रतिरोधी कलम का उपयोग कर मानक खुर्दबीन स्लाइड लेबल. एक Cytospin ब्रैकेट और कीप में स्लाइड सुरक्षित. Cytospin रोटर में स्लाइड विधानसभा सुरक्षित.
  5. 5 मिनट के लिए 100 XG पर BALF की Cytospin 150 μl. सेल घनत्व को प्रभावी ढंग से करने के लिए बहुत बड़ी समस्या है, तो, सेल आकारिकी मूल्यांकन स्लाइड्स पर नीचे काता मात्रा कम हो. स्लाइड सूखी रातोंरात हवा करने की अनुमति दें.
  6. अंतर बनाती प्रोटोकॉल का पालन स्लाइड दाग. स्लाइड सूखी रातोंरात हवा करने की अनुमति दें. Permount का उपयोग कर स्लाइड coverslip और एक 20x और 40x उद्देश्य से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड का मूल्यांकन.
  7. ऐसे FACS, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, confocal माइक्रोस्कोपी, जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए शाही सेना निकासी, और / या पश्चिमी धब्बा के लिए प्रोटीन निष्कर्षण के रूप में बाद के विश्लेषण के लिए शेष कोशिकाओं, फसल.

6. हिस्तोपैथोलोजी मूल्यांकन

  1. ऊतकविकृतिविज्ञानी मूल्यांकन के लिए फेफड़ों तैयार करें. Formalin निर्धारण के 24-48 घंटे के बाद, पेट के बल पूरे फुलाया फेफड़ों पूरबी और आयल में एम्बेडेड. मुख्य आयोजन airway बेनकाब करने के लिए परिणामी ब्लॉक काटें.
  2. स्कोरिंग सटीकता में सुधार करने के लिए, एक ही स्थिति में फेफड़ों की स्थिति और टी के अधिकतम अनुदैर्ध्य दृश्य उपज के लिए प्रत्येक ब्लॉक ट्रिमवह मुख्य अक्षीय airway intrapulmonary. इस बिंदु से, 5 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग काटा. अतिरिक्त वर्गों में कटौती और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग स्वस्थानी संकरण में के लिए तैयार किया जा सकता है.
  3. 0 (अनुपस्थित) और 3 (गंभीर) के बीच रन बनाए हैं जो निम्नलिखित भड़काऊ मापदंडों के आधार पर एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर ऊतकविकृतिविज्ञानी मूल्यांकन: मोनोन्यूक्लियर और polymorphonuclear सेल घुसपैठ; उपकला सेल hyperplasia और चोट airway; परिस्त्राव; परिवाहकीय और peribroncheolar cuffing; और सूजन के साथ शामिल फेफड़ों का प्रतिशत. फेफड़े ऊतकविकृतिविज्ञानी एक अनुभवी रोगविज्ञानी द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  4. एक कुल ऊतकविकृतिविज्ञानी स्कोर उत्पन्न या रोग प्रगति के विशिष्ट पहलुओं यों को व्यक्तिगत स्कोर का उपयोग करने के लिए पैरामीटर स्कोर के सभी जवाब. जीनोटाइप और उपचार दोनों को अंधा समीक्षकों के साथ, एक डबल अंधा फैशन में सभी स्कोरिंग आचरण. इस स्कोरिंग प्रणाली previousl कर दिया गया हैY 6,7,10 का वर्णन किया.

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Representative Results

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका दीवारों वातावरण में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है जो LPS, से बना रहे हैं. संवेदनशील मानव आबादी में LPS की साँस लेना airway जेट exacerbates और एक मजबूत प्रतिरक्षा response11 ट्रिगर करने में सक्षम है. LPS भी एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के लिए माउस मॉडल में इस्तेमाल एक आम PAMP है. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित में, चूहों ई. से अलग LPS का यह खुराक प्राप्त कोली: oropharyngeal यह प्रशासन का उपयोग (सीरोटाइप 0111 बी 4). LPS जोखिम के मॉडल में, शरीर का तापमान और वजन दोनों पशु रुग्णता और रोग प्रगति के विशिष्ट किराए मार्करों हैं. LPS चुनौती धीरे - धीरे 24 घंटा (चित्रा 1 ए) के पाठ्यक्रम पर वापस आधारभूत की वृद्धि होगी, जो पहले 6 घंटा के भीतर शरीर के तापमान में एक महत्वपूर्ण कमी का कारण होगा. यह शिखर और धीरे - धीरे n पर ठीक हो जाएगी, जहां हालांकि, शरीर के वजन तेजी, 24 घंटा का कोर्स (चित्रा 1 बी) से अधिक कम हो जाएगा48-72 घंटा एक्सटेंशन. इस प्रकार, शरीर के तापमान सूजन दीक्षा के प्रारंभिक दौर का मूल्यांकन करने के लिए एक अधिक उपयुक्त मार्कर है; जबकि, शरीर के वजन रोगजनन और वसूली के बाद के चरणों के दौरान और अधिक विश्वसनीय है.

श्वासनली LPS जोखिम फेफड़ों के लिए leukocytes के एक महत्वपूर्ण बाढ़ में यह परिणाम है. पहले 6 घंटा के भीतर, मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ जुड़े कोशिकाओं BALF (चित्रा 1C) में देखा जा सकता है. BALF कोषमयता बाद में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया चोटियों और सूजन संकल्प की अवधि में प्रवेश करती है जहां अगले 24-48 घंटे (चित्रा 1C) में वृद्धि जारी है. 24 घंटा करके, neutrophils की एक महत्वपूर्ण संख्या फेफड़ों में मौजूद हैं और अंतर धुंधला (आंकड़े -1 डी और 1E) निम्नलिखित BALF में मनाया जा सकता है. BALF कोषमयता आकलन फेफड़ों में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ जुड़े कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एक मजबूत और quantifiable तकनीक प्रदान करते हैं. incrBALF कोषमयता में आसानी एयरवेज, रक्त वाहिकाओं और फेफड़ों पैरेन्काइमा (आंकड़े 1F और 1G) में में neutrophils की एक महत्वपूर्ण आमद के साथ संगत है. फेफड़े ऊतकविकृतिविज्ञानी प्रभावी रूप से एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली (चित्रा 1F) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता. फेफड़ों सही लगानेवाला और intrapulmonary मुख्य अक्षीय airway के अधिकतम अनुदैर्ध्य दृश्य प्रकट करने के लिए प्रसंस्कृत वर्गों के साथ एक ही आकार के लिए फुलाया जाता है जब यह सही विभिन्न जानवरों के फेफड़ों में विशिष्ट स्थलों पर ऊतकविकृतिविज्ञानी स्कोर करने के लिए संभव है. यहाँ वर्णित गुरुत्वाकर्षण आधारित मुद्रास्फीति प्रोटोकॉल, इस स्कोरिंग प्रणाली की सुविधा के लिए बनाया गया है. LPS एक महत्वपूर्ण परिवाहकीय में वृद्धि, peribroncheolar और parenchymal सूजन (चित्रा 1G) लाती है.

LPS प्रशासन से जुड़े कई साइटोकिन्स सहित स्थानीय और प्रणालीगत समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों के उच्च स्तर, लातीसहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया. स्थानीय साइटोकाइन स्तरों ऐसे एलिसा के रूप में पारंपरिक तकनीकों का प्रयोग किया BALF में मूल्यांकन किया जा सकता. LPS प्रशासन के बाद फेफड़ों में विनियमित अप कर रहे हैं कि आम साइटोकिन्स TNF-α, आईएल 1β, और आईएल -6 (2A चित्रा) शामिल हैं. प्रणालीगत cytokine स्तर BALF आकलन (चित्रा 2 बी) के लिए वर्णित के रूप में एक ही तकनीक का उपयोग कर सीरम में मूल्यांकन किया जा सकता है. कुछ मध्यस्थों स्थानीय microenvironment में मौजूद है, लेकिन सीरम में अनुपस्थित होने के लिए यह असामान्य नहीं है. उदाहरण के लिए, TNF-α नियमित LPS निम्नलिखित फेफड़ों में उच्च स्तर पर पाया जाता है, लेकिन आम तौर पर इस प्रोटोकॉल में वर्णित परिस्थितियों में प्रणालीबद्ध नहीं मिला है (आंकड़े 2A और 2 बी, पता लगाने के स्तर से नीचे).

चित्रा 1 चित्रा 1. Oropharyngeal intratracheal LPS प्रशासन चूहे में रुग्णता और airway सूजन बढ़ जाती है. नर चूहों ई. के 1 मिलीग्राम / किग्रा प्राप्त . कोलाई LPS (सीरोटाइप 0111: बी 4) यह और रोग रोगजनन एबी) LPS प्रशासन के 6 घंटा के भीतर शरीर के तापमान में एक महत्वपूर्ण कमी लाती है 24 घंटे के कोर्स पर मूल्यांकन किया गया था; शरीर के वजन घटाने बाद में समय बिंदुओं पर अधिक स्पष्ट है, जबकि. सी)   LPS BALF से अलग कक्षों से अंतर धुंधला द्वारा पता चला. डे) neutrophils, LPS प्रशासन के बाद 24 घंटे के फेफड़ों में मौजूद हावी सेल प्रकार हैं कुल BALF कोषमयता में उल्लेखनीय वृद्धि लाती है. ये आंकड़े आम तौर पर BALF में उपस्थित प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिशत के रूप में सचित्र हैं. एफ) फेफड़े ऊतकविकृतिविज्ञानी दो स्वतंत्र मूल्यांकन के आधार पर एक अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकतापरिवाहकीय और peribroncheolar cuffing, हल्के parenchymal सूजन और कुछ मामूली वायुकोशीय रोड़ा का एक महत्वपूर्ण राशि आम तौर पर फेफड़ों LPS प्रदर्शन के बाद 24 घंटे में मनाया जाता है intrapulmonary मुख्य अक्षीय airway. जी) आसपास सूजन की है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. स्थानीय और प्रणालीगत साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि में LPS परिणाम के संपर्क में श्वासनली. ए)   LPS जोखिम के बाद, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के एक व्यापक स्पेक्ट्रम की स्थानीय स्तर TNF-α, आईएल 1β, और आईएल -6 सहित, पहले 24 घंटे के भीतर BALF में मनाया जा सकता है. इन साइटोकिन्स का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता हैजैसा कि यहाँ दिखाया एलिसा, 24 घंटा LPS प्रदर्शन के बाद. बी) कई साइटोकिन्स भी सीरम में प्रणालीबद्ध पता लगाया जा सकता है. हालांकि, सीरम में BALF में उच्च स्तरों में पाया, लेकिन नहीं कर रहे हैं, जो TNF-α सहित कुछ उल्लेखनीय अपवाद है, वहाँ रहे हैं. सीरम में ब्याज की साइटोकिन्स अनुभव से पूर्व बड़े पैमाने पर मूल्यांकन करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. कम हिस्तोपैथोलोजी परिवर्तनशीलता और बेहतर दृश्य में गुरुत्वाकर्षण विस्थापन परिणामों का उपयोग फेफड़े मुद्रास्फीति. इस प्रोटोकॉल में वर्णित निर्धारण के गुरुत्वाकर्षण विस्थापन विधि इष्टतम ऊतकविकृतिविज्ञानी मूल्यांकन compar के लिए अनुमति देता है गुरुत्वाकर्षण मुद्रास्फीति द्वारा तय uninflated फेफड़ों या मैनुअल मुद्रास्फीति को एड. एबी) फेफड़े आम तौर पर असमान क्षेत्रों में परिणाम सही स्कोरिंग के लिए अनुमति वर्दी सुविधाओं, वायुकोशीय क्षति, बढ़ाया दृश्य, और फेफड़ों की सूजन. सीडी) मैनुअल मुद्रास्फीति के उच्च संकल्प मूल्यांकन कम प्रदर्शित मुद्रास्फीति. ग) इन असमान क्षेत्रों में अक्सर आंशिक रूप से मैनुअल मुद्रास्फीति भी बड़े पैमाने पर क्षतिग्रस्त वायुकोशीय में जो परिणाम पर-फुलाया जाता है कि फेफड़ों के क्षेत्रों में परिणाम नौसिखिए समीक्षकों. डी) द्वारा रोग सुविधाओं के रूप में आमतौर पर गलत कर रहे हैं कि ढह क्षेत्रों में जिसके परिणामस्वरूप, फुलाया जाता है रिक्त स्थान. ई) Uninflated फेफड़ों ढह वायुकोशीय रिक्त स्थान है और व्यापक प्रशिक्षण के बिना हल करने और मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि क्षेत्रों का प्रदर्शन. वे बगल में दिखाई देते हैं के रूप में इसी तरह, इस वजह से यह तकनीक ढह जा रहा अंग को फेफड़ों के दृश्य की अनुमति नहीं है.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रकार के रूप में सफलतापूर्वक माउस फेफड़ों में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है: 1) मूल्यांकन किया जा रहा मॉडल के लिए उपयुक्त माउस तनाव और लिंग चयन; 2) फेफड़ों के लिए PAMP वितरण का अनुकूलन; 3) सही ढंग से इकट्ठा करने और BALF प्रक्रिया; और 4) ठीक से तय करने और histopathological आकलन के लिए फेफड़ों के तैयार करते हैं.

माउस तनाव का चुनाव मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने में एक महत्वपूर्ण कारक है. C57BL 6 / चूहों में आम तौर पर होने के कारण सबसे PAMPs को उनके Th1 skewing और मजबूत प्रतिक्रिया को सहज उन्मुक्ति के अध्ययन के लिए इष्टतम माउस पृष्ठभूमि पर विचार कर रहे हैं. इसी तरह, BALB / ग चूहों आमतौर पर होने के कारण उनके Th2 skewing से एलर्जी रोग मॉडल के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. फेफड़ों के मॉडल में एक तिहाई आमतौर पर इस्तेमाल तनाव आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों को पैदा करने में उनकी आम उपयोग के कारण 129SvEv पृष्ठभूमि पर चूहों, कर रहे हैं. सभी मामलों में, सावधानी प्रयोगात्मक डिजाइन और जब भी संभव हो, उम्र और लिंग मा के दौरान लिया जाना चाहिएtched लीटर के साथी नियंत्रण जानवरों जंगली जानवरों के साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की तुलना अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. आमतौर पर, LPS प्रोटोकॉल के लिए यहाँ वर्णित, 6-12 सप्ताह पुराने सेक्स मिलान किया C57BL 6 / चूहों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए और 20 ग्राम की एक न्यूनतम तौलना चाहिए. यह LPS जोखिम संवेदनशील माउस उपभेदों या जीनोटाइप में रुग्णता और मृत्यु दर के उच्च स्तर में परिणाम होगा कि संभव है. यदि ऐसा होता है, यह, LPS खुराक को कम करने के लिए बड़े जानवरों का उपयोग, और प्रयोग में प्रयुक्त जानवर का लिंग स्विचन सहित इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. छोटे पैमाने पर प्रयोग पशु संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए शुरू में आयोजित किया जाना चाहिए और प्रत्येक प्रयोग के लिए शर्तों सबसे अतिसंवेदनशील जीनोटाइप या प्रयोगात्मक हालत के आधार पर किया जाना चाहिए.

Oropharyngeal यह प्रशासन फेफड़ों से 2 एजेंट वितरण के अन्य रूपों की तुलना में अधिक सटीक होना पाया गया है. इस वजह से एअर इंडिया के लिए सीधी पहुँच के लिए बड़े हिस्से में हैRWAY और नाक और साइनस गुहा बयान से जुड़े मुद्दों को धोखा. हालांकि, सभी जानवर प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, यह प्रशासन प्रवीणता हासिल करने के लिए व्यापक मैनुअल कौशल और अभ्यास की आवश्यकता है. अनुचित तकनीक पशु चोट में परिणाम अक्षम फेफड़ों बयान में और कुछ मामलों में परिणाम कर सकते हैं. आमतौर पर, इवांस नीले डाई (EBD) को प्रभावी ढंग से इस प्रक्रिया के लिए या बयान 4 के साथ जुड़े संभावित समस्याओं का निवारण करने के लिए एक प्रशिक्षण उपकरण के रूप में या तो उपयोग किया जा सकता है. EBD यह दिलाई और बाद में formamide का उपयोग ऊतक से निकाला जा सकता है. EBD की मात्रा एक मानक वक्र के खिलाफ मुकाबले अवशोषण के स्तर का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. हमारे हाथ में, ठेठ EBD वसूली 90-98% के बीच है. unrecovered डाई के थोक घेघा में रिसाव के साथ जुड़े होने की उम्मीद है. कारण इसकी शुद्धता के लिए, यह प्रशासन तकनीक ऐसी दवा एजेंटों के रूप में फेफड़े, खुराक संवेदनशील एजेंटों की एक विविध रेंज पहुंचाने के लिए आदर्श हैया संक्रामक जीवों.

BALF और BALF कोषमयता का विश्लेषण मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समग्र प्रगति में अंतर्दृष्टि का एक महत्वपूर्ण राशि प्रदान कर सकते हैं. उत्तेजना के बाद फेफड़ों में स्थानीय स्तर पर जारी की सूजन मध्यस्थों को प्रभावी ढंग से ऐसे एलिसा और वेस्टर्न ब्लाट के रूप में आम इम्यूनोलॉजी तकनीकों का प्रयोग किया BALF में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इसी तरह, BALF के सेलुलर संरचना अंतर सेल धुंधला या प्रवाह cytometry का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता. उचित तकनीक और मैनुअल निपुणता का विकास ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) के प्रदर्शन का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है. बाल के दौरान होने वाले सबसे आम मुद्दों में से एक पूरी तरह से मूल रूप से फेफड़ों में रखा तरल पदार्थ की अधिकतम मात्रा को वापस लेने की विफलता है. सुइयों वास्तविक cannulas के स्थान पर प्रयोग कर रहे हैं जब यह आमतौर पर एक अनुचित सुरक्षित प्रवेशनी के साथ जुड़े या है. विशिष्ट सांस की नली cannulas व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि गति और बलडालने और खारा प्रक्रिया के दौरान चिकनी और सुसंगत है वापस लेने के लिए इस्तेमाल किया. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल BALF में एकत्र कोशिकाओं का अंतर धुंधला के लिए अनुकूलित किया गया है. अंतर धुंधला हो जाना एक संशोधित राइट Giemsa दाग है और आकृति विज्ञान आधारित सेल पहचान का संचालन करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी तकनीक है. यह धुंधला तकनीक उनके अद्वितीय दाना धुंधला गुणों के आधार पर neutrophils और इयोस्नोफिल्स के भेदभाव के लिए अनुमति देता है. Monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं को भी पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं और आमतौर पर BALF में मनाया जाता है. ये मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं में शामिल हैं. इसी तरह, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं को भी आमतौर पर मनाया जाता है. सबसे शोधकर्ताओं सही लड़का आकृति विज्ञान पर आधारित अंतर करने के लिए हालांकि, इन monocytic कोशिकाओं और लिम्फोसाइटों अक्सर मुश्किल कर रहे हैं. फ्लो का उपयोग इन मूल्यांकन करने के लिए बहुत उच्च संकल्प जोड़ सकते हैं. हालांकि, नियंत्रण जानवरों से बरामद कम सेल नंबर अक्सर एक सीमित कारक है. इस प्रकार, अगर प्रवाह cytometry प्रयोगात्मक डिजाइन सेल वसूली बढ़ाने के लिए अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण जानवरों को शामिल करना चाहिए, इस्तेमाल किया जा रहा है.

फेफड़े ऊतकविकृतिविज्ञानी आकलन इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण घटक हैं और रोग प्रगति के प्रत्यक्ष दृश्य (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के लिए अनुमति देते हैं. फेफड़े ठीक से तैयार कर रहे हैं, ऊतकविकृतिविज्ञानी सही मूल्यांकन मात्रा निर्धारित है, और लक्षण वर्णन किया जा सकता है. ऊतकविकृतिविज्ञानी के लिए फेफड़ों की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम ठीक से लगानेवाला साथ उन्हें inflating है. मुद्रास्फीति के मैनुअल तरीके आमतौर पर अधिक फुलाया हैं कि फेफड़ों में परिणाम, के तहत फुलाया suboptimal दृश्य और आकारिकी आकलन (क्रमशः आंकड़े -3 सी और 3 डी,) में यह परिणाम है, जो या आंशिक रूप से फुलाया. इसी तरह, पिछले निर्धारण करने के लिए फुलाया नहीं कर रहे हैं कि फेफड़ों सही मूल्यांकन करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाता है और अक्सर (चित्रा 3 उच्च चर ऊतकविकृतिविज्ञानी स्कोर में परिणाम ई). यहाँ पर चर्चा की मुद्रास्फीति की गंभीरता विधि न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ मुद्रास्फीति की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक का उपयोग करना, यह प्रायोगिक पशुओं के बीच संगत कर रहे हैं कि फेफड़ों में विशिष्ट स्थलों का मूल्यांकन करने के लिए संभव है. इसके अलावा, एक मुद्रास्फीति स्टैंड का उपयोग गुरुत्वाकर्षण मुद्रास्फीति 20 मिमी 12 की एक लगानेवाला दबाव में फेफड़ों में हवा के लिए दिखाया गया है. इस तकनीक को अपने सबसे physiologically प्रासंगिक आकार और आकार में फेफड़ों के दृश्य की अनुमति देता है और संवेदनशील pathophysiological प्रक्रियाओं 12 के मूल्यांकन के लिए अत्यधिक प्रभावी होना दिखाया गया है. यह मुद्रास्फीति स्टैंड उचित दबाव उत्पन्न करने के लिए माउस से उचित ऊंचाई पर सेट किया जाना महत्वपूर्ण है. Suboptimal मुद्रास्फीति मनाया जाता है, मुद्रास्फीति स्टैंड की ऊंचाई अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. उचित ऊंचाई जो यह सुनिश्चित करेंगे कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे कृंतक फेफड़ों मुद्रास्फीति स्टैंड, के उपयोग की सिफारिश की है.

टी "> इस प्रक्रिया चूहों के फेफड़ों के लिए LPS और अन्य PAMPs के वितरण के लिए अनुकूलित किया गया है. इन तकनीकों में महारत हासिल कर रहे हैं एक बार, अतिरिक्त पढ़ाई भी प्रभावी ढंग से जीना रोगजनकों का उपयोग मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग शुरू किया जा सकता है. इसी तरह, यहाँ वर्णित तकनीक बहुत बहुमुखी हैं और एक प्रयोगात्मक या दवा एजेंट के नैदानिक ​​और शारीरिक प्रासंगिकता का आकलन करने में दिलचस्पी किसी भी अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. क्योंकि खुराक में सटीकता की, इस तकनीक को भी एक उच्च आवश्यकता है कि vivo अध्ययन के लिए आदर्श है एजेंट वितरण में परिशुद्धता का स्तर.

यह प्रक्रिया चूहों के फेफड़ों के लिए LPS और अन्य PAMPs के वितरण के लिए अनुकूलित किया गया है. इन तकनीकों में महारत हासिल कर रहे हैं एक बार, अतिरिक्त पढ़ाई भी प्रभावी ढंग से जीना रोगजनकों का उपयोग मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग शुरू किया जा सकता है. इसी तरह, यहाँ वर्णित तकनीक बहुत बहुमुखी हैं और कर सकते हैं खई एक प्रयोगात्मक या दवा एजेंट के नैदानिक ​​और शारीरिक प्रासंगिकता का आकलन करने में दिलचस्पी किसी भी अध्ययन के लिए आवेदन किया. क्योंकि खुराक में सटीकता की, इस तकनीक को भी एजेंट वितरण में परिशुद्धता के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है कि vivo अध्ययन के लिए आदर्श है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों के लिए इस परियोजना के लिए कोर और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए पशु चिकित्सा VA-एमडी रीजनल कॉलेज धन्यवाद. यह काम एक NIH कैरियर विकास पुरस्कार (K01DK092355) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in Needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing Sigma R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemocytometer Hausser Scientific 3520
Hemocytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funnels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

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References

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संक्रमण अंक 86 LPS lipopolysaccharide माउस निमोनिया नकारात्मक बैक्टीरिया सूजन गंभीर फेफड़ों की सूजन सहज प्रतिरक्षा मेजबान रोगज़नक़ बातचीत फेफड़ों सांस की बीमारी ग्राम
चूहे में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए Oropharyngeal intratracheal PAMP प्रशासन और ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage की उपयोगिता
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Allen, I. C. The Utilization of… More

Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

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