マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

Summary

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。

Abstract

病原体に対する宿主免疫応答は、複雑な生物学的プロセスである。 インビボ研究の大部分は、古典的宿主-病原体相互作用は、マウスにおけるセレクト細菌または病原体関連分子パターン（PAMP）の腹腔内注射を活用特徴付けるために用いられる。これらの技術は、感染症の病理生物学に関連した膨大なデータが得られているが、腹腔内注射モデルは常に、肺における宿主 - 病原体相互作用の研究には適していません。マウスにおける急性肺炎症モデルを利用し、それは先天性免疫応答は、リポ多糖（LPS）を利用してホストの高分解能解析を行うことができる。ここでは、非外科的口腔咽頭気管内投与を使用して、LPSを投与し、疾患の病因に関連する臨床パラメータをモニタし、宿主の免疫応答を評価するために気管支肺胞洗浄液を利用する方法を記載している。記載されている技術のPAMPおよび病原体の多様な範囲に対する宿主自然免疫応答を研究するために広く適用可能である。同様に、若干の変更を加え、これらの技術はまた、アレルギー性​​気道炎症を評価する研究および薬理学的用途に適用することができる。

Introduction

病原性細菌種に関連する肺感染は、世界的な罹患率および死亡率の一般的な原因である。これらの病原体に対する宿主の免疫応答をドライブするメカニズムを決定することは、これらの感染症の影響を減衰させる新たな予防戦略と治療薬の開発を推進していきます。ここに記載されたプロトコルの全体的な目標は、生きた細菌の代用物としての病原体関連分子パターン（PAMP）を用いて病原体感染に対する宿主の先天性免疫応答を評価するために柔軟な方法をユーザに提供することである。細菌に対する宿主自然免疫応答を評価する以前の研究の大部分は、実行が比較的容易に腹膜モデルに焦点を当てている。これらのモデルは非常に有用であり、宿主 - 病原相互作用および全身性炎症分野で大きな進歩をもたらしましたが、これらのモデルから生成されたデータには、常に問題研究のための適切ではありませんinvolvi呼吸器系ngの。ここでは、急性肺炎症の肺モデルは、古典的な腹腔内（ip）注射モデルの実用的かつ臨床的に関連する拡張として提案されている。提案された技術は、器官特異的モデル系における先天性免疫応答の局所的評価を可能にする。

ここで説明する方法は、ユーザが共通のPAMPであるLPSに対する宿主の免疫応答を評価することを可能にするための簡単​​かつ堅牢な技術を提供するように設計されている。方法は、マウスおよび呼吸器感染症及び急性肺障害に罹患している¹ヒト患者において観察される病態生理学的特徴の多くを模倣するの肺におけるロバストな先天性免疫応答を誘導するLPSの気管内（it）点滴に基づいている。この技術の主な利点は、ユーザがインビボ研究導通に関連付けられた交絡因子および安全性の懸念なしに宿主免疫応答を評価することを可能にすることである生菌を使用した。同様に、このプロトコルで説明した露光の口腔咽頭のIT投与経路は、行政（中）、鼻腔内、外科、IT管理など、他の一般的に利用された技術、上の重要な利点を持っています。例えば、口腔咽頭IT管理は、典型的に、鼻腔内のエージェントの損失に肺沈着の増加変動を患っており^、2〜4洞管理、中に比べて比較的正確な投薬および肺沈着を可能にします。それの投与経路は、これらの空洞を回避し、気管や気道に直接アクセスすることができます。同様に、外科的なITアプローチは、かなり多くの病的な投与方法で、マスターに広範囲の訓練を必要とします。ここで説明するプロトコルも記述一般的な技術と炎症の進行を評価し、LUを調製するための適切な技術を記載したプロトコルで終了するために使用する代理マーカーが含まれる組織病理学的評価のためのNGS。これらのプロトコルは、各々の動物から生成されたデータを最大にすることによって、各試験に必要なマウスの数を最小化に焦点を当てている。

記載されたプロトコルは、非常に柔軟であり、容易に多様な範囲のPAMPのダメージ関連分子パターン（減衰）を評価するために修飾することができる。さらに、いくつかの追加の修飾と、これらのプロトコルはまた、アレルギー性気道疾患の進行または生細菌、ウイルスまたは真菌^5-10有する宿主-病原体相互作用を評価する研究に適用することができる。

Protocol

すべての研究は、バージニア工科大学のための制度的管理使用委員会（IACUC）の承認の下や実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った。

1。口腔咽頭の管理ページを使用してLPSの気管内（IT）の接種

1. 各動物を一意に耳パンチ、耳標、またはその他の制度的に承認する方法のいずれかを使用して識別されていることを確認します。
2. 各動物についてベースライン体重および体温を記録する。
3. LPSの作業用ストックを準備します。各マウスは、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / kgのLPSを50μl量を受けるであろう。モック処置した動物は、1×PBSを50μlの線量を受け取ります。
4. 次のドロップ法を用いたイソフルランの投与のために適切な容器を準備します。施設のガイドラインには、イソフルラン及びその他の麻酔薬と前initiatへの使用に関して異なる場合どんな研究をING、人が十分に満たされているすべてのガイドラインを確実にするために動物実験/福祉の彼らの機関の部門に連絡してください。ドロップ法イソフルランを選択できない場合、他の麻酔剤は、許容される代替物である。
   1. 適切な安全キャビネット内で、500ミリリットルのビーカーの底に折り畳まれた吸収性の紙タオルと場所にイソフルランの約3ミリリットルを適用します。
   2. ペーパータオルの上にアルミニウム箔の小片を配置し、透明な蓋付きビーカーを覆う。
5. その接種の際に利用されるツールおよび試薬を準備します。挿管スタンドに頭の動物を確保するゴムバンドを配置します。この手順では、ストレートピンセット、角度のついた又は湾曲したピンセット、とヒントとP200のピペットが必要になります。
6. 挿管スタンドの横に容易にアクセス可能な場所にピペットチップ、所定の位置に負荷のLPSを50μl。
7. マウスを麻酔イソフルラン室に動物を配置し、透明な蓋で容器を覆うことにより。第一室に置かれたとき、迅速かつ浅くされる、動物の呼吸パターンを観察します。呼吸率は通常、チャンバー内に配置する30秒以内に達成されている1息/ 2秒、近づくと動物が十分に麻酔をします。滴下法イソフルランを使用して承認された動物プロトコルに記載されているように、マウスを麻酔しなければならない。
8. 室から麻酔をかけたマウスを取り外し、フロント切歯によって挿管スタンドに動物を一時停止する。動物が確実に抑制し、口や舌がアクセス可能であることを確認してください。
9. 優しくストレートピンセットで舌を固定します。角度のついた鉗子で舌をつかみ、若干の抵抗が感じられるまでゆっくりと口から引き出します。このアクションは、喉頭蓋をブロックし、気管へのアクセスを得るために十分である。
10. に舌を押したまま延長された位置は、喉の奥にLPSを50μlの用量を投与し、すぐに手袋をはめた指で、動物の鼻の穴をカバーしています。マウスが吸入されるまでLPSは、喉の奥に表示されます。
11. 鼻の穴をカバーし、5月10日追加の呼吸のために拡張舌を押し続けます。
12. 挿管スタンドからマウスを取り外して、麻酔から回復するまで戻って新しいケージに動物を配置します。
13. 疾患の進行に関連する代理マーカーを監視します。体重および体温研究の期間毎に4-8時間を監視すべきである。同様に、行動特性の増加罹患率と関連する臨床症状を評価する。
14. LPS暴露後の特定の時点で疾患の進行、収穫マウスを評価した。 LPS曝露後の収穫のための典型的な時点は0、6、12、18、24、および48時間が含まれています。回復および生存率を評価するために、7 DA用のマウスを評価YS接種後。

2。血清および気管支肺胞洗浄液（BALF）コレクション

1. 制度的に承認された方法を使用して、マウスを生け贄に捧げる。
2. その裏に動物を置き、高さ（1.27cm）の中で、理想的に0.5、剖検ボードに固定します。
3. 70％エタノールでマウス全体を濡らす。
4. 27 Gの針を有する1ミリリットルの注射器を使用して、前に任意の切開を行うに心臓穿刺を行っています。これは、単一のマウスから全血の500〜800μLを撤回することが可能なはずである。
5. 注射器から針を外し、前標識1.5ミリリットルの微量遠心管に全血を転送します。血清収集のために、全血を室温で少なくとも30分間凝固させることを可能にする。血清コレクションに加えて、この手順は、免疫細胞を研究するために、循環、全血を収集する前に、チューブ及びシリンジ内の抗凝固剤を組み込むことによって修飾することができる。
6. 横切開aを作るマウスの下顎に腹腔と腹膜腔からの垂直切開の長さを渡ります。
7. 鉗子を使用して、切開の両側をつかみ、静かに、基礎となる腹膜や胸腔から肌を引き出します。
8. ダイアフラムを切らないように注意しながら、性器から胸骨に腹腔の長さに沿って大きな切開を加えます。穏やかに腎臓の一つへのアクセスを可能にする腹腔内に腸をシフトする。
9. 灌流のための排水ポイントとして機能する腎臓につながる腎静脈を切った。
10. ニックは、振動板には、はさみを使って心臓の左側を露出させ、肺と心臓を避けるように注意しながら。
11. 手動で27 G針および1×PBS溶液で10mlの注射器を用いて心臓を灌流。生理食塩水が肺に強制されていないことを確実にするために灌流中、無理な力を加えないようにしてください。残血門脈切開から排出should。
12. 慎重に心臓や肺を切らないように注意しながら、鈍/鈍ハサミを使用して胸骨に沿って胸郭を切った。誤ってこの手順の間に肺を切断して大幅に収集されたBALFの量を減らすことになり、適切に固定液で肺を膨らませることができないことになります。
13. 静かにピンセットを用いて胸郭から心臓や肺を分離します。慎重に、できるだけ背骨の近くに鈍/鈍ハサミを使用して胸郭の各セクションをカットし、完全に両方のセクションを削除します。
14. ピンセットを用いて唾液腺を分離またはハサミで除去してください、気管を露出させる。
15. 慎重にハサミを使って気管をオーバーレイ筋肉を切る。これは、気管このプロセス中に切断されないことが必須である。
16. はさみを使用して、気管の上にある鎖骨を分離。
17. 優しく鉗子を使用して、胸腺を把握し、心臓から組織を持ち上げます。に注意しながら、はさみを使用して、胸腺を削除心臓や肺を切断しないようにします。
18. 角度のついたはさみ（45〜90度の角度、シャープ/シャープ）を使用して、1〜2輪喉頭下の気管に小さな横切開する。切開はしっかりとカニューレを固定するのに十分な大きさでなければなりません。
19. テーパ端部を切開下に2〜3気管輪を拡張するようにカニューレを挿入し、絹縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。縫合糸が気管と食道の間を通過し、カニューレにきつく引っ張られていることを確認してください。
20. ハンクス溶液（HBSS）1mlで1ミリリットルの注射器を記入し、ゆっくりとカニューレにそのルアーを挿入します。
21. ゆっくりと、しかし一定の動きを使用して、肺を膨らませる、気管に〜900μLを注入し、すぐにHBSSを撤回。 15ミリリットルコニカルチューブに回収BALFを配置します。
22. 将来の分析のために、BALFの約3ミリリットルを収集するには、この洗浄を2回追加を繰り返します。使用するまで氷上で、または4℃でBALF保管してください。

1. 肺膨張スタンドに10ミリリットルの注射器を挿入します。シリンジにルアーにチューブ、ストップコックにルアー、およびストップコックを組み立てます。ストップコックが閉じた位置にあることを確認してください。 10mlシリンジは、重力流溜めとして機能する。リザーバは、動物の上に4.75スタンドとリザーバの上部が動物上で10.5を拡張する必要があり、インフレに添付する必要があります。
2. 中性緩衝ホルマリン溶液で注射器を埋める。注射器が完全に固定液で満たされていることを確認します。
3. チューブの開放端部の下に吸収性タオルを置き、固定液は、チューブを埋めることができるようにストップコックを開いてください。固定液は、チューブから流れる始まると、すぐにストップコックを閉じて、固定剤でトップに注射器を補充します。それは、注射器が完全に肺のインフレ圧力の適切な量を提供するために満たされることが重要である。
4. 縫合糸の単一緩い結び目を作る。しかし、結び目をしっかり引っ張らないでください。
5. カニューレにマウスインフレスタンドからチューブを挿入します。
6. ストップコックを開き、肺が重力インフレによって埋めることができます。
7. 肺は彼らの最大のインフレ水準に達すると、縫合糸がきつく引っ張り、二結び目を作る。
8. ストップコックを閉じて、カニューレからチューブを取り外します。
9. 静かにピンセットで縫合糸をつかみ、指でカニューレを保持することによって気管からカニューレを取り外します。しっかりと胸腔とバックマウスの鼻に向けてカニューレに向けて縫合糸を引っ張る。
10. 優しく鉗子で気管または縫合糸をつかみ、首キャビティから気管に持ち上げます。
11. 鈍いはさみを使用して結ば縫合糸に気管尾を切断。
12. 一度trache離れてマウスの気管を引っ張って始め、基盤となる組織がない。優しく胸腔から肺を持ち上げます。
13. 慎重に胸腔内の肺を保持する結合組織をカット。根本的な接続を切断しながら、離れてマウスの体から気管を引っ張って継続し、着実に上向きの力を適用します。肺を切らないように注意してください。心臓が左に、この方法を使用して肺に接続する必要があることに注意してください。
14. 肺が削除された後は、緩衝ホルマリン10mlに配置します。
15. ジェノタイピングのためのマウス尾の部分を削除します。
16. 適切な施設のガイドライン以下のマウス死体を処分。

4。サイトカイン評価

1. 血清を単離するために5分間12,000×gで、ステップ2.5の下で採取した全血を、遠心分離する。 -80℃での前標識1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアに血清を転送
2. 干せるを評価ELISAまたは他の同様のアッセイによるMのサイトカインレベル。製造指示に従って、アッセイに応じて、適切な希釈バッファーで1時20分 - 血清を1:5に希釈します。これらの希釈液は、経験的に前のサンプルの大部分を実行しているに判断すべきものである。
3. 採取した血清の低容量に起因して、半分にELISAプレート上にロードしたサンプルの体積を減少させる。たとえば、ほとんどの市販のELISAは、標準および試料100μlの容量を利用する。標本、負荷50規格のμLとウェルあたり希釈した血清を節約する。
4. 遠心分離機5分間200×gで冷蔵卓上遠心機でBALF。 2に、無細胞上清を移し-80℃で1.5 mlマイクロチューブや店舗を前標識
5. 希釈することなく、ELISAまたは他の類似のアッセイにより、BALFのサイトカインを評価します。
6. -80℃で保存し、未使用の血清およびBALF

5。染およびBAL細胞性評価

1. BALFを遠心分離し、完全HBSSを除去した後、低張性食塩水を用いてペレット化した赤血球を溶解。蒸留水900μLで細胞を懸濁します。すぐに10倍のPBS 100μLを加える。
2. 個別に各サンプルを溶解。サンプルは、赤血球の過剰な量が含まれている場合、細胞は、5分および赤血球溶解プロトコル400×gでテーブルトップ遠心機でペレット化することができる繰り返すことができる。
3. トリパンブルー染色で10倍または20倍の倍率の下で血球計を使用して、1ミリリットルの懸濁液中の総BALF細胞性を決定します。細胞/ mlとして、これらのデータを評価し、提示する。
4. サイトスピンや染のための材料を準備します。鉛筆や耐溶剤性のペンを使用して標準的な顕微鏡用スライドにラベルを付けます。サイトスピンブラケットと漏斗にスライドを固定します。サイトスピンローターでスライドアセンブリを固定します。
5. 5分間100×gでBALFのサイトスピン150μL。細胞密度を効果的に大きすぎると細胞形態を評価し、スライド上にスピンダウンし、ボリュームを下げる。スライドを一晩乾燥を放送することができます。
6. 差動製造プロトコル以下のスライドを染色する。スライドを一晩乾燥を放送することができます。パーマウントを使用してスライドをカバースリップし、20Xおよび40X目的を備えた顕微鏡を使用してスライドを評価します。
7. 例えば、FACS、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、遺伝子発現の評価のためのRNAの抽出、および/またはウェスタンブロットのためのタンパク質抽出などのその後の分析のために残りの細胞を、収穫。

6。組織病理学的評価

1. 組織病理学的評価のための肺を準備します。ホルマリン固定の24〜48時間後に、腹全体の膨張した肺を配向し、パラフィンに包埋した。メイン誘導気道を露出させられたブロックをカット。
2. 採点の精度を向上させるために、同じ位置に肺を位置決めし、tの最大前後視覚化を得るために各ブロックをトリム彼はメインの軸方向の気道を肺内。この点から、5ミクロンの連続切片ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色を切った。追加の切片を切り出し、標準的なプロトコルを用いてin situハイブリダイゼーションのために調製することができる。
3. 0（不在）及び3（重度）の間で採点され、以下の炎症性パラメータに基づいて半定量的スコアリングシステムを用いて組織病理を評価する：核及び多核細胞浸潤;上皮細胞過形成や傷害気道;溢出;血管周囲とperibroncheolarカフィング;および炎症に関与肺のパーセント。肺の組織病理は、経験豊富な病理学者で評価してください。
4. 総組織病理学スコアを生成したり、病気の進行の特定の側面を定量化するために個々のスコアを使用して、パラメータのスコアがすべて平均。遺伝子型と治療の両方を知らされていない査読者との、二重盲検法ですべてのスコアリングを行っています。このスコアリングシステムは、previouslされているYは^、6,7,10を記述した。

Representative Results

グラム陰性菌の細胞壁は、環境において非常に豊富であるLPS、から構成されている。敏感なヒト集団におけるLPSの吸入は気道反応性を悪化させると、強い免疫response11をトリガすることができます。 LPSはまた、堅牢な先天性免疫応答を誘発するためにマウスモデルで使用される一般的なPAMPである。ここに記載されたプロトコルでは、マウスは、E.から単離されたLPSのそれの投与を受けた大腸菌 ：口腔咽頭のIT管理を使用して（血清型0111 B4）。 LPS曝露のモデルでは、体温及び体重の両方が、動物の病的状態および疾患進行の典型的な代理マーカーである。 LPS攻撃は徐々に24時間（ 図1A）の過程でベースラインに戻って増加している、最初の6時間以内に体温の有意な減少の原因となります。しかし、体重は順調にそれがピークに徐々 Nの上に回復する場合には、24時間（ 図1B）の経過とともに減少しますEXT 48〜72時間。このように、体温は、炎症開始の初期段階を評価するためのより適切なマーカーである。一方、体重が病因および回復の後の段階の間に、より信頼性が高い。

気道のLPS曝露は、肺への白血球の大幅な流入をもたらし。最初の6時間以内、宿主自然免疫応答に関連する細胞は、BALF（ 図1C）で観察することができる。 BALF細胞充実はその後、免疫応答のピークとは、炎症の解像度の期間に入り、次の24〜48時間（ 図1C）、上で増加し続けている。 24時間では、好中球のかなりの数は、肺に存在し、差動染色（ 図1Dおよび1E）は、以下のBALFにおいて観察することができる。 BALF細胞充実評価は肺で宿主の免疫応答に関連する細胞を特徴づける堅牢かつ定量化可能な技術を提供する。 INCRBALF細胞充実の容易さは、気道、血管や肺実質（ 図1F及び1G）内への好中球のかなりの流入と一致している。肺の組織病 ​​理を効果的に半定量的スコアリングシステム（ 図1F）を用いて評価することができる。肺を正確に固定液と肺内の​​メイン軸気道の最大長さ方向の可視化を明らかにするために、処理のセクションと同じ大きさに膨張しているとき、それは正確に異なる動物の肺内の特定の目印で組織病理を獲得することが可能です。ここで説明重力ベースの膨張プロトコルは、このスコアリングシステムを容易にするように設計されている。 LPSは、血管周囲の大幅な増加、peribroncheolarおよび実質の炎症（ 図1G）を誘導する。

LPS投与は、関連するいくつかのサイトカインを含む局所及び全身の炎症誘発性メディエーターの高いレベルを誘導し、先天性免疫応答。局所サイトカインレベルは、ELISAなどの従来の技術を用いて、BALFで評価することができる。 LPS投与後の肺においてアップレギュレートされている一般的なサイトカインは、TNF-α、IL-1β、およびIL-6（ 図2A）を含む。全身性サイトカインレベルは、BALFの評価（ 図2B）について記載したのと同じ技術を用いて血清中で評価することができる。いくつかのメディエーターは、局所微小環境に存在するが、血清中に存在しないとすることは珍しいことではありません。例えば、TNF-αは、日常的にLPSを以下の肺において高レベルで見出されるが、典型的には、このプロトコルに記載の条件下で、全身に見出されない（ 図2Aおよび2B;検出レベル以下）。

図1。口腔咽頭気管内LPS投与マウスにおける罹患率および気道炎症を増加させます。雄マウスEの1 mg / kgのを受け大腸菌 LPS（血清型0111：B4）をitおよび疾患病因で24時間かけて評価したAB）は、LPS投与の6時間以内に体温の有意な減少を誘導する;体重減少は後の時点でより明白である一方。C）   LPSは、総BALF細胞性の有意な増加を誘導する。DE）BALF好中球から単離された細胞からの差動染色によって明らかにされるように、LPS投与後24時間の肺中に存在する支配的な細胞型である。これらのデータは、典型的には、BALF中に存在する各細胞型の割合として示されている。F）肺の組織病 ​​理学は、2つの独立した評価に基づいて半定量的スコアリングシステムを用いて評価することができる肺内のメイン軸方向の気道を取り巻く炎症のS、G）血管周囲とperibroncheolarカフィング、かなりの量の、軽度の実質の炎症および若干の歯槽閉塞は通常、肺のLPS暴露後の24時間後に観察される。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。局所および全身サイトカインレベルの増加におけるLPS結果に暴露気道。 A）   LPS曝露後、前炎症性サイトカインの広域スペクトルの局所的なレベルは、TNF-α、IL-1β、およびIL-6を含む、最初の24時間以内にBALFにおいて観察することができる。これらのサイトカインを用いて評価することができるここに示されているようにELISAは、24時間、LPS暴露後。B）は、いくつかのサイトカインはまた、血清中に全身に検出することが可能となる。しかし、BALFではなく、血清中に高いレベルで発見されたTNF-αを含むいくつかの注目すべき例外があります。血清中の興味のあるサイトカインは、経験的に前に大規模な評価のために評価する必要があります。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。肺膨張削減組織病 ​​理変動と改善された可視化における重力変位結果を用いて 、 このプロトコルに記載された固定の重力置換方式は、最適な組織病 ​​理学的評価comparはを可能にし肺の膨張していない肺やマニュアルインフレ編重力インフレで固定AB）、肺が正確な採点を可能に均一な機能を紹介する、肺胞の損傷、強化された視覚化、および炎症の高解像度の評価を低下させた。CD）のマニュアルインフレ率は、通常の不均一なエリアになりインフレ。C）これらの不均一なエリアは初心者査読による病理学的特徴として、一般的に誤解され崩壊した領域で、その結果、多くの場合、部分的に膨張する。D）手動インフレも広範囲に損傷した肺胞、その結果、過膨張される肺の分野になるスペース。E）膨張していない肺はつぶれた肺胞腔と豊富な訓練なしに解決して評価することが困難な地域を示しています。同様に、原因臓器であることに、彼らはその場で表示されるこの技術は、肺の可視化を可能にしない崩壊した。e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

Discussion

成功したマウスの肺における宿主免疫応答を評価するための最も重要なステップは次のとおりです。1）評価対象モデルに適したマウス系統、性別を選択する。 2）肺へのPAMPの配信を最適化する。 3）正しくBALFを収集し、処理する。そして4）適切に修正し、組織病理学的評価のための肺の準備。

マウス株の選択は、宿主の免疫応答を評価する上で重要な要因である。 C57BL / 6マウスは、典型的ほとんどのPAMPへのTh1のスキューで堅牢なレスポンスに対する自然免疫を研究するための最適なマウスの背景と考えられている。同様に、BALB / cマウスは、典型的には、それらのTh2スキューアレルギー疾患モデルを研究するために使用される。肺モデルでの第三一般的に使用される株は、遺伝子改変動物を生成する際に、その一般的な使用のために129SvEvの背景にマウス、である。すべての場合において、注意が実験計画と可能な限り、年齢、性別ミリアンペア時に注意が必要ですリットルメイトコントロール動物は野生型動物に遺伝的に改変されたマウスを比較する研究のために使用されるべきであるtched。 LPSプロトコルは、ここで説明のために、典型的には、6〜12週齢の性別が一致したC57BL / 6マウスを使用すべきであるおよび20gの最小値を比較検討する必要があります。これは、LPS曝露は感受性マウス系統又は遺伝子型における罹患率および死亡率の高レベルをもたらすことが可能である。これが発生する場合、それは、LPS投与量を減少させるより大きな動物を用いて、実験に用いた動物の性別を切り替えるなど、このプロトコルのいくつかの側面を調整する必要があるかもしれない。小規模実験は、動物感度を決定するために最初に行われるべきであり、各実験の条件は、最も感受性遺伝子型又は実験条件に基づくべきである。

口腔咽頭it投与は、肺²への薬剤送達の他の形態よりも正確であることが見出されている。これは大部分のAIへの直接アクセスに起因しているrwayと鼻と鼻腔沈着に関連する問題を回避する。ただし、すべての動物の手続きと同様に、政権は能力を達成するために大規模な手先の器用さと練習が必要です。不適切なテクニックは、動物を負う非効率的な肺沈着で、いくつかのケースで発生する可能性があります。一般的に、エバンスブルー色素（EBD）を効果的に、この手順のためのトレーニング·ツールとして利用することができるか、沈着⁴に関連した潜在的な問題のトラブルシューティングを行う。 EBDは、それを投与し、続いてホルムアミドを用いて組織から抽出することができる。 EBDの量は、標準曲線に対して比較吸収レベルを用いて計算することができる。我々の手では、典型的なEBD回収90〜98％の間の範囲である。未回収染料の大部分は、食道への​​漏れに関連することが予想される。 、その正確さのために、IT管理技術は、医薬品などの肺への線量に敏感な薬剤の多様な範囲を提供するための理想的ですまたは感染性生物。

BALFおよびBALF細胞性の分析は、宿主の免疫応答の全体的な進行への洞察を大量に提供することができる。刺激後の肺において局所的に放出炎症性メディエーターは、効果的ELISAおよびウエスタンブロットなどの免疫学の一般的な技術を用いてBALF中で定量することができる。同様に、BALFの細胞組成物は、差動細胞染色又はフローサイトメトリーのいずれかを用いて評価することができる。適切な技術と手先の器用さを開発するには、気管支肺胞洗浄（BAL）を実施する最も重要な部分です。 BAL中に発生する最も一般的な問題の一つは、完全に元々、肺に配置された流体の最大量を撤回する障害です。これは一般に不適切に保護されたときに、カニューレ又は針は、実際のカニューレの代わりに使用される関連付けられている。特殊な気管カニューレは、市販されている。それはまた、重要である動作と力生理食塩水を挿入し、撤回するために使用することは作業中はスムーズで一貫性があります。ここで説明するプロトコルは、BALFで採取された細胞の示差染色に最適化されています。差動染色が変更されたライトギムザ染色し、形態学に基づくセル識別を行うための非常に有効な手法である。この染色技術は、独自の顆粒染色特性に基づいて、好中球および好酸球の分化を可能にする。単球由来の細胞はまた、識別が容易であり、一般BALFにおいて観察される。これらは、マクロファージおよび樹状細胞が挙げられる。同様に、T-細胞およびB-細胞は、一般的に観察される。ほとんどの研究者が正確に一人で形態学に基づいて差別化するためにしかし、これらの単球細胞やリンパ球はしばしば困難である。フローサイトメトリーの利用は、これらの評価に非常に高い解像度を追加することができます。しかし、対照動物から回収され、低細胞数は、しばしば制限因子である。したがって、もしフローcytom学的形状が使用される、実験的な設計は、細胞の回復を高めるために追加の陰性対照動物を含むべきである。

肺の組織病 ​​理学的評価は、このプロトコルの他の重要な構成要素であり、疾患の進行（ 図3Aおよび3B）の直接可視化を可能にする。肺が適切に準備されると、組織病理を正確に評価し定量し、特徴付けることができる。組織病理のために肺を調製する際に最も重要なステップは、適切に固定液でそれらを膨張さ。インフレの手動による方法は、（ 図3Cおよび3Dのそれぞれ ）次善の可視化および形態の評価、その結果、通常の下で膨張し、過膨張される肺につながる、または部分的に膨張した。同様に、固定前に膨張されていない肺を正確に評価することは非常に困難であり、多くの場合（ 図3高度に可変組織病 ​​理学スコアをもたらす E）。ここで説明するインフレの重心法は最小限の変動とインフレの再現性の高い方法を提供する。この技術を用いて、実験動物の間で一貫している肺において特定のランドマークを評価することができる。さらに、インフレのスタンドを使用して、重力のインフレ率は20ミリメートル¹²の固定液圧力で肺を膨らませることが示されている。この技術は、最も生理学的に関連するサイズおよび形状に肺の可視化を可能にし、敏感な病態生理学的プロセス¹²の評価に非常に有効であることが示されている。これは、インフレスタンドが適切な圧力を発生させるマウスから適切な高さに設定することが重要です。次善の膨張が観察される場合には、膨張スタンドの高さは、経験的に決定されるべきである。適切な高さを確保し、市販の小型のげっ歯類の肺膨張スタンドの使用を推奨します。

tは ">この手順では、マウスの肺へのLPSおよび他のPAMPの送達のために最適化されている。これらの技術が習得されると、追加の研究はまた、効果的に生きた病原体を用いた宿主 - 病原体相互作用を評価するために修飾されたプロトコルを使用して開始することができる。同様に、ここに記載された技術は、非常に汎用性があり、実験又は医薬品の臨床的および生理的関連性を評価することに興味任意の研究に適用することができる。ために投薬の精度のため、この技術は、高いが必要なin vivo試験のために理想的である薬剤デリバリーの精度のレベル。

この手順は、マウスの肺へのLPSおよび他のPAMPの送達のために最適化されている。これらの技術が習得されると、追加の研究はまた、効果的に生きた病原体を用いた宿主 - 病原体相互作用を評価するために修飾されたプロトコルを使用して開始することができる。同様に、ここに記載されている技術は、非常に汎用性があり、Bのことができますeは、実験又は医薬品の臨床的および生理的関連性を評価することに興味任意の研究に適用される。そのため、投薬の精度は、この技術はまた、薬剤送達における高い精度を必要とするin vivo試験に最適です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500