Utnyttjandet av orofaryngeal Intratracheal PAMP Administration och lungsköljning för att utvärdera värdimmunsvar hos möss

Summary

Värden immunsvar mot patogenen infektion är en hårt reglerad process. Med hjälp av en lungmodell exponering lipopolysackarid i möss, är det möjligt att utföra högupplösta utvärderingar av de komplexa mekanismer som är förknippade med sjukdomen patogenes.

Abstract

Värden immunsvaret mot patogener är en komplex biologisk process. Majoriteten av in vivo-studier klassiskt används för att karakterisera värd-patogen interaktioner utnyttja intraperitoneala injektioner av utvalda bakterier eller patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) i möss. Dessa tekniker har gett enorma uppgifter i samband med infektionssjukdomar pathobiology Medan, intraperitoneal injektion modeller är inte alltid lämpliga värd-patogen interaktionsstudier på lungan. Med hjälp av en akut lunginflammationsmodell i möss, är det möjligt att genomföra en hög upplösning analys av värdens naturliga immunsvar med användning av lipopolysackarid (LPS). Här beskriver vi de metoder för att administrera LPS med användning av icke-kirurgisk orofaryngeal intratrakeal administrering övervaka kliniska parametrar som förknippas med sjukdom patogenes, och använda bronkoalveolär sköljvätska för att utvärdera värdimmunsvar. De tekniker som finns beskrivnaär allmänt tillämpas för att studera värd medfödda immunsvar på ett varierat utbud av PAMPs och patogener. På samma sätt, med smärre modifikationer, av dessa tekniker kan också användas i studier som utvärderar allergisk luftvägsinflammation och i farmakologiska tillämpningar.

Introduction

Lunginfektioner i samband med patogena bakterier arter är en vanlig orsak till global sjuklighet och dödlighet. Fastställande av mekanismer som driver värd immunsvar mot dessa patogener kommer att främja utvecklingen av nya strategier för förebyggande och terapeutiska medel som dämpar effekterna av dessa infektioner. Det övergripande målet för det protokoll som beskrivs här är att ge användaren en flexibel metod för att utvärdera värd medfödda immunsvar mot patogen infektion med hjälp av en patogen samband molekylära mönster (PAMP) som ett surrogat för levande bakterier. Majoriteten av tidigare studier som utvärderar värd medfödda immunsvar mot bakterier har fokuserat på peritoneal modeller på grund av den relativa lätthet i utförandet. Även om dessa modeller är mycket användbara och har lett till betydande framsteg när det gäller värd-patogen interaktioner och systemisk inflammation, de data som genereras från dessa modeller är inte alltid lämpliga för studier involving andningsorganen. Här används en lungmodell av akut lunginflammation som föreslås som ett praktiskt och kliniskt relevant expansion av de klassiska intraperitoneala (ip) injektion modeller. Den föreslagna tekniken tillåter för den lokala utvärderingen av det medfödda immunsvaret hos en organspecifik modellsystem.

De metoder som beskrivs här är utformade för att ge en enkel och robust teknik för att tillåta användare att utvärdera värd immunsvar mot LPS, vilket är en vanlig PAMP. Metoderna är baserade på intratrakeal (det) instillation av LPS, som inducerar en robust medfödda immunsvaret i lungorna hos möss och härmar många av de patofysiologiska egenskaper som observerats hos människor som lider av luftvägsinfektioner och akut lungskada ^1. En primär fördel med denna teknik är att den tillåter användaren att utvärdera värdimmunsvar utan de störfaktorer och säkerhetsbekymmer som är förknippade med att utföra in vivo-studiermed hjälp av levande bakterier. Likaså den orofaryngeal det administrations exponeringsväg som beskrivs i detta protokoll har betydande fördelar jämfört med andra allmänt utnyttjade tekniker, inklusive intranasal (i) administration och kirurgisk den administration. Till exempel tillåter orofaryngeal den administration relativt exakt dosaging och lungdeposition jämfört med i administrationen, som vanligtvis lider av ökad variabilitet lungdeposition på grund av förlusten av agenter i näshålan och bihålor ^2-4. I det administreringssätt kringgår dessa håligheter och ger direkt tillgång till luftstrupen och luftvägarna. Likaså är den kirurgiska det synsätt en betydligt mer morbid administreringsmetod och kräver omfattande utbildning till mästare. De protokoll som beskrivs här finns också en beskrivning av de gemensamma tekniker och surrogatmarkörer som används för att bedöma inflammation progression och avslutas med ett protokoll som beskriver rätt teknik för att förbereda lungar för bedömningar histopatologi. Dessa protokoll är inriktade på att minimera antalet möss som krävs för varje studie genom att maximera de data som genereras från varje enskilt djur.

De protokoll som beskrivs är mycket flexibla och kan lätt modifieras för att utvärdera en mängd olika PAMPs och skador i samband molekylära mönster (dämpas). Dessutom med några ytterligare ändringar, dessa protokoll kan också tillämpas på studier som utvärderar allergisk luftvägssjukdomsprogression eller värd-patogen interaktioner med levande bakterier, virus eller svamp ^5-10.

Protocol

Samtliga studier genomfördes inom ramen för godkännande av institutionsstyrelse och användning kommittén (IACUC) för Virginia Tech och enligt National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur.

1. Intratrakeal (det) Ympning av LPS Använda Orofaryngeal Administration

1. Se till att varje djur identifieras unikt med hjälp av antingen ett öra punch, öronmärke, eller annat institutionellt godkänd metod.
2. Anteckna kroppsvikten och kroppstemperatur för varje djur.
3. Förbered arbets lager av LPS. Varje mus erhåller en 50 ul dos av 1 mg / kg LPS i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mock behandlade djur kommer att få en 50 ^ dos 1x PBS.
4. Bered en lämplig kammare för administrering av isofluran med användning av följande droppmetoden. Institutionens riktlinjer varierar beträffande användning av isofluran och andra anestesimedel och innan initieratsning några studier, bör personer kontakta sin institutions avdelning för Animal Care / Welfare att försäkra alla riktlinjer tillgodoses. Om droppmetoden isofluran är inte ett alternativ, andra anestesimedel är acceptabla alternativ.
   1. I en lämplig säkerhetsbänk, gäller cirka 3 ml isofluran till en hopvikt absorberande pappersduk och placeras i botten av en 500 ml bägare.
   2. Placera en liten bit av aluminiumfolie på toppen av pappershandduk och täck över bägaren med ett transparent lock.
5. Förbered verktyg och reagenser som kommer att användas under den ympning. Placera gummibandet som kommer att säkra djuren huvudet på intubering monter. Detta förfarande kommer att kräva ett par raka pincett, ett par vinklade eller böjda pincett, och en p200 pipett med tips.
6. Belastning 50 pl LPS i pipettspetsen och plats på ett lättillgängligt läge vid intubering monter.
7. Bedöva musengenom att placera djuret i isofluran kammaren och som täcker kammaren med transparent lock. Följ djurets andningsmönster, som kommer att vara snabb och ytlig när de läggs in i kammaren. Djuret ska vara tillräckligt sövd när andnings priser närmar 1 andetag / 2 sek, vilket vanligtvis uppnås inom 30 sekunder att placera i kammaren. Musen ska bedövas som anges i den godkända djur protokollet använder droppmetoden isofluran.
8. Ta bort den sövda mus från kammaren och avbryta djuret på intubation stå fast vid sina framtänder. Försäkra att djuret är säkert fastspända och munnen och tungan är åtkomliga.
9. Försiktigt fast tungan med de raka pincett. Ta tag i tungan med de vinklade pincett och dra försiktigt ut den ur munnen tills svagt motstånd känns. Denna åtgärd är tillräcklig för att blockera struplocket och få åtkomst till luftstrupen.
10. Samtidigt fortsätter att hålla tungan iutsträckta position, administrera 50 pl dos av LPS i den bakre delen av halsen och omedelbart täcker djurets näsborrar med en gloved finger. LPS kommer att vara synlig i den bakre delen av halsen tills musen inhalerar.
11. Fortsätt att täcka näsborrarna och håll tungan förlängas med 5-10 extra andetag.
12. Ta bort musen från intubation stå och placera djuret tillbaka i en ny bur tills den återhämtar sig från narkosen.
13. Övervaka surrogatmarkörer i samband med sjukdomsprogression. Kroppsvikt och kroppstemperaturen bör övervakas varje 4-8 h för varaktigheten av studien. Likaså utvärdera beteendemässiga egenskaper och kliniska symtom förknippade med ökad morbiditet.
14. För att utvärdera sjukdomsutveckling, skörd möss vid specifika tidpunkter efter LPS-exponeringen. Typiska tidpunkter för skörd efter LPS exponering inkluderar 0, 6, 12, 18, 24 och 48 tim. För att utvärdera återhämtning och överlevnad, utvärdera mössen för 7 days efter inokulering.

2. Serum och lungsköljning Fluid (BALF) Insamling

1. Offra musen med ett institutionellt godkänd metod.
2. Placera djuret på rygg och fäst den till en obduktion styrelse, helst 0,5 i (1,27 cm) i höjd.
3. Blöt hela musen med 70% etanol.
4. Med hjälp av en 1 ml spruta med en 27 G nål, genomföra en hjärtpunktion innan du köper några snitt. Det bör vara möjligt att ta ut 500-800 | il helblod från en enda mus.
5. Ta bort nålen från sprutan och för över hela blod till en prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugrör. För samling serum, tillåta helblod att koagulera under åtminstone 30 minuter vid rumstemperatur. Förutom insamlingen av serum, kan förfarandet också modifieras genom att inkorporera en antikoagulant i röret och sprutan före uppsamling av helblod, för att studera cirkulerande immunceller.
6. Gör ett horisontellt snitt enöver längden på den peritoneala kaviteten och ett vertikalt snitt från peritonealhålan till den nedre käften på musen.
7. Använd pincett, ta tag båda sidor av snittet och dra försiktigt ut huden bort från de underliggande peritoneal och bröstkorg håligheter.
8. Gör ett stort snitt utmed längden av peritonealhålan från användarens genitalier till bröstbenet, noga med att undvika att skära membranet. Skifta försiktigt tarmarna i bukhålan för att medge tillträde till ett av njurarna.
9. Skär njurvenen leder till njure för att fungera som en dräneringspunkt för perfusion.
10. Nick diafragman med sax, var noga med att undvika lungor och hjärta, för att exponera den vänstra sidan av hjärtat.
11. Manuellt BEGJUTA hjärtat med hjälp av en 10 ml spruta med en 27 G nål och 1x PBS-lösning. Undvik att använda onödigt våld under perfusion för att säkerställa att saltlösning inte tvingas in i lungorna. Resterande blod ska rinna från portalen ven snittet.
12. Skär försiktigt bröstkorgen längs bröstbenet med hjälp av trubbiga / trubbig sax, var noga med att undvika att skära hjärtat och lungorna. Oavsiktligt skära lungorna under denna procedur kommer att avsevärt minska mängden BALF samlas in och kommer att resultera i en oförmåga att korrekt blåsa lungorna med fixativ.
13. Isolera försiktigt hjärtat och lungorna bort från bröstkorgen med hjälp av pincett. Skär försiktigt varje avsnitt av bröstkorgen med hjälp av trubbiga / trubbig sax så nära ryggraden som möjligt och helt ta bort båda avsnitten.
14. Separera spottkörtlarna med hjälp av pincett eller ta bort dem med hjälp av en sax, för att exponera luftstrupen.
15. Skär försiktigt musklerna som överdrar luftstrupen med hjälp av en sax. Det är väsentligt att trakea inte skäras under denna process.
16. Med sax, separera nyckelbenet som ligger över luftstrupen.
17. Ta försiktigt tag bräss med pincett och lyft vävnaden bort från hjärtat. Ta bräss med sax och samtidigt se tillundvika att skära hjärta eller lungor.
18. Gör ett litet horisontellt snitt i luftstrupen 1-2 ringar nedanför struphuvudet med hjälp av vinklade sax (45-90 º vinkel, skarpa / vassa). Snittet bör vara tillräckligt stor för att stadigt fästa kanylen.
19. För in kanylen så att den avsmalnande änden sträcker sig 2-3 trakealringar under snittet och fäst kanylen på plats med hjälp av en silkessutur. Säkerställ att suturen passerar mellan trakea och matstrupen och dras tätt på kanylen.
20. Fyll en 1 ml spruta med 1 ml av Hanks buffrad saltlösning (HBSS) och försiktigt in dess Luer in i kanylen.
21. Med hjälp av en långsam, men ständig rörelse, injicera ~ 900 pl i luftstrupen, blåsa lungorna, och omedelbart återkalla HBSS. Placera återvunna BALF i en 15 ml koniska rör.
22. Upprepa denna sköljning två ytterligare gånger för att samla in ca 3 ml BALF för framtida analys. Förvara BALF på is eller vid 4 ° C tills redo för användning.

1. Sätt i en 10 ml sprutan i lunginflations monter. Montera slangen till luer, luer till kranen, och avstängningskranen till sprutan. Säkerställ att kranen är i det stängda läget. 10 ml spruta Den kommer att fungera som en reservoar gravitationsflöde. Behållaren ska fästas på inflationen stå 4.75 i över djuret och den övre delen av reservoaren bör sträcka 10,5 i över djuret.
2. Fyll sprutan med neutral buffrad formalinlösning. Se till att sprutan är helt fylld med fixativ.
3. Placera en absorberande handduk under den öppna änden av slangen och öppna kranen för att medge fixativ för att fylla röret. När fixerings börjar flöda från slangen, stäng omedelbart avstängningskranen och fyll sprutan till toppen med fixativ. Det är viktigt att sprutan fyllas helt för att tillhandahålla den lämpliga mängden av tryck för lunginflation.
4. Knyt en lös knut i suturen; dock inte dra knuten tight.
5. För in slangen från musen inflationen står i kanylen.
6. Öppna kranen och tillåta lungorna att fyllas genom gravitations inflation.
7. När lungorna når sin högsta inflationsnivån, dra suturen tight och knyt en andra knut.
8. Stäng kranen och ta bort röret från kanylen.
9. Ta försiktigt bort kanylen från luftstrupen genom att ta tag suturen med en pincett och hålla kanylen med fingrarna. Dra in sutur ner mot brösthålan och kanylen tillbaka mot musens nos.
10. Ta försiktigt tag i luftstrupen eller suturerna med pincett och lyft luftstrupen från nackhålan.
11. Sever luftstrupen kaudalt till den bundna suturen med trubbiga saxen.
12. När Tracheen är fri från den underliggande vävnader, börjar att dra luftstrupen från mus. Lyft försiktigt lungorna ur brösthålan.
13. Skär försiktigt den bindväv som håller lungorna i brösthålan. Fortsätt att dra luftstrupen från musens kropp och tillämpa stadig uppåtriktad kraft samtidigt minska de bakomliggande anslutningar. Var försiktig för att undvika att skära i lungorna. Observera att hjärtat bör lämnas fäst till lungorna med hjälp av denna metod.
14. När lungorna har tagits bort, placera dem i 10 ml buffrat formalin.
15. Ta bort en del av mus svans för genotypning.
16. Släng musen kadaver efter lämpliga institutionella riktlinjer.

4. Cytokine Utvärdering

1. Centrifugera helblod uppsamlades under steg 2,5, vid 12000 x g under 5 min för att isolera serumet. Överför serumet till ett prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
2. Utvärdera Serum cytokinnivåer med ELISA eller annan liknande analys. Späd serum från 1:05 till 01:20 i en lämplig utspädningsbuffert, beroende på analysen, efter tillverkarens instruktioner. Dessa spädningar bör bestämmas empiriskt före körning av huvuddelen av proverna.
3. På grund av den låga volymen av serum uppsamlades, minska provvolymen laddades på ELISA-plattan med hälften. Till exempel, de flesta kommersiella ELISA använda 100 | il volymer av standarder och prover. För att spara prover, belastning 50 l av standarder och utspätt serum per brunn.
4. Centrifugera BALF i en kyld bordscentrifug vid 200 x g under 5 min. Överför den cellfria supernatanten i två prelabeled 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
5. Utvärdera BALF cytokiner med ELISA eller annan liknande analys utan att späda.
6. Förvara oanvänt serum och BALF vid -80 ° C.

5. Differential Färgning och BAL cellulariteten utvärdering

1. Efter BALF centrifugering och komplett HBSS borttagning, lysera pellet röda blodkroppar med hjälp av hypoton saltlösning. Resuspendera cellerna i 900 | il destillerat vatten. Tillsätt omedelbart 100 ul av 10x PBS.
2. Individuellt lysera varje prov. Om proverna innehåller överdrivna mängder av röda blodceller, kan cellerna pelleterades i bordscentrifug vid 400 x g under 5 min och den röda blod cellys protokoll kan upprepas.
3. Bestäm den totala BALF cellularitet i 1 ml suspension med hjälp av en hemacytometer i 10X eller 20 gångers förstoring med trypanblått färgning. Utvärdera och presentera dessa uppgifter som celler / ml.
4. Förbered material för cytospin och differentialfärgning. Märk standardobjektglas med hjälp av en penna eller lösningsmedelsbeständig penna. Fäst bilderna i en cytospin fäste och tratt. Fäst skensatsen i cytospin rotorn.
5. Cytospin 150 pl av BALF vid 100 xg under 5 min. Om celltätheten är alltför stor för att effektivtutvärdera cellmorfologin, minska volymen snurrade ner på bilderna. Låt objektglasen lufttorka över natten.
6. Differential färga bilderna efter de tillverkar protokollen. Låt objektglasen lufttorka över natten. Täckglas bilderna med hjälp Permount och utvärdera bilderna med hjälp av ett mikroskop utrustat med en 20X och 40X objektiv.
7. Skörda de återstående cellerna för efterföljande analys, såsom FACS, elektronmikroskopi, konfokalmikroskopi, RNA-extraktion för genuttryck utvärdering och / eller proteinutvinning för western blöt.

6. Histopatologi Utvärdering

1. Förbered lungorna för histopatologisk utvärdering. Efter 24-48 timmar formalinfixering, ventralt orientera hela uppblåsta lungor och bäddas in i paraffin. Skär de resulterande blocken för att exponera huvud ledande luftvägarna.
2. För att förbättra scoring noggrannhet, placera lungorna i samma position och trimma varje block för att ge den maximala longitudinella visualisering av than intrapulmonär huvud axiella luftvägarna. Från denna punkt, skär 5 mikron seriella sektioner och färgning med hematoxylin och eosin (H & E). Ytterligare sektioner kan skäras och bereddes för hybridisering in situ med användning av standardprotokoll.
3. Utvärdera histopatologi med hjälp av en semi-kvantitativ poängsystem baserat på följande inflammatoriska parametrar, som görs mellan 0 (frånvarande) och 3 (svår): mononukleära och polymorfonukleära celler infiltration; luftvägs epitelceller hyperplasi och skada; extravasation; perivaskulär och peribroncheolar ansamling av inflammatoriska celler; och procenten av lungan inblandade med inflammation. Lung histopatologi bör utvärderas av en erfaren patolog.
4. Genomsnittlig alla parameter poäng för att generera en total histopatologi poäng eller använda individuella poängen för att kvantifiera specifika aspekter av sjukdomsprogression. Genomför alla poäng i en dubbelblind mode, med granskare förblindade både genotyp och behandling. Detta poängsystem har previously beskrivits ^6,7,10.

Representative Results

Cellväggarna hos gramnegativa bakterier är sammansatta av LPS, som är mycket rikligt förekommande i miljön. Inandning av LPS i känsliga befolkningsgrupper förvärrar luftvägs reaktivitet och kan utlösa en robust immun response11. LPS är också en vanlig PAMP används i musmodeller för att framkalla ett robust medfödda immunsvaret. I beskrev protokollet här, fick mössen en den dos av LPS isolerad från E. coli (serotyp 0111: B4) med hjälp av orofaryngeal den administration. I modeller av LPS exponering, både kroppstemperatur och vikt är typiska surrogatmarkörer av animaliskt sjuklighet och sjukdomsutveckling. LPS utmaningen kommer att orsaka en signifikant minskning i kroppstemperatur inom de första 6 h, vilket gradvis kommer att öka tillbaka till baslinjen under loppet av 24 tim (Figur 1A). Dock kommer kroppsvikten stadigt minska under loppet av 24 timmar (Figur 1B), där den kommer topp och gradvis återhämta sig under de next 48-72 tim. Således är kroppstemperaturen mer lämplig markör för att utvärdera de tidiga stadierna av inflammation initiering; För är kroppsvikt mer pålitlig under senare stadier av patogenes och återhämtning.

Airway LPS exponering resulterar i en betydande inflöde av leukocyter till lungorna. Inom den första 6 h, kan observeras celler associerade med värd medfödda immunsvaret i BALF (Figur 1C). Den BALF cellularitet fortsätter att öka under de kommande 24-48 timmar (Figur 1C), där immunresponstopparna och därefter går in i en period av inflammation upplösning. Genom 24 tim, ett betydande antal neutrofiler är närvarande i lungorna och kan observeras i BALF följande differentialfärgning (fig. 1D och 1E). BALF cellularitet bedömningar ger en robust och kvantifierbar teknik för att karakterisera de celler som är förknippade med värdens immunsvar i lungorna. Den incrlätthet i BALF cellularitet är förenlig med ett betydande inflöde av neutrofiler i luftvägarna, blodkärlen och i lungparenkym (figur 1F och 1G). Lung histopatologi effektivt kan utvärderas med hjälp av en semikvantitativ poängsystem (figur 1F). Det är möjligt att exakt poäng histopatologin vid speciella landmärken i lungorna hos olika djur när lungorna är korrekt pumpade till samma storlek med fixativ och avsnitt bearbetas för att avslöja den maximala longitudinella visualisering av intrapulmonär huvud axiella luftvägarna. Allvaret baserad inflation protokoll, som beskrivs här, är utformad för att underlätta detta poängsystem. LPS inducerar en betydande ökning av perivaskulära, peribroncheolar och parenkymal inflammation (figur 1G).

LPS administration inducerar höga nivåer av lokala och systemiska pro-inflammatoriska mediatorer, däribland flera cytokiner i samband meddet medfödda immunförsvaret. Lokala cytokinnivåer kan bedömas mot BALF med konventionella tekniker, såsom ELISA. Vanliga cytokiner som är uppreglerade i lungorna efter LPS-administrering innefattar TNF-α, IL-1β, och IL-6 (figur 2A). Systemiska cytokinnivåer kan utvärderas i serum med hjälp av samma teknik som beskrivits för Balf bedömningar (Figur 2B). Det är inte ovanligt för en del mediatorer att vara närvarande i den lokala mikromiljön, men frånvarande i serum. Till exempel är TNF-α rutinmässigt finns i höga halter i lungorna efter LPS, men är inte normalt återfinns systemiskt under de förhållanden som beskrivs i detta protokoll (Figur 2A och 2B, under nivån för detektering).

Figur 1. Orofaryngeal Intratrakeal LPS Administration ökad sjuklighet och luftvägsinflammation hos möss. Man möss fick 1 mg / kg av E. coli LPS (serotyp 0111: B4) den och sjukdompathogenesis utvärderades under loppet av 24 timmar AB) LPS inducerar en betydande minskning av kroppstemperaturen inom 6 timmar av administration;. medan kroppen viktminskning är mer uppenbar vid de senare tidpunkter. C)   LPS inducerar en signifikant ökning i total BALF cellularitet. DE) Neutrofiler är den dominerande celltypen som finns i lungorna 24 h efter LPS-administrering, vilket framkom genom differentiell färgning av celler som isolerats från BALF. Dessa data är typiskt visas som procent av varje celltyp som finns i BALF. Kan F) Lung histopatologi utvärderas med hjälp av en semi-kvantitativ poängsystem baserat på två oberoende utvärderings av inflammationen kring intrapulmonär huvud axiella luftvägarna. G) ​​En betydande del av perivaskulär och peribroncheolar ansamling av inflammatoriska celler, mild parenkymal inflammation och vissa smärre alveolär ocklusion typiskt observeras 24 timmar efter lung LPS exponering. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Luftvägs Exponering för LPS leder till ökade nivåer av lokala och system cytokiner. A)   Efter LPS-exponering, kan observeras lokala nivåer av ett brett spektrum av proinflammatoriska cytokiner i BALF inom den första 24 timmar, inklusive TNF-α, IL-1β, och IL-6. Dessa cytokiner kan utvärderas med hjälp avELISA, som visas här 24 h efter LPS-exponering. B) Flera cytokiner kan också detekteras systemiskt i serumet. Det finns dock vissa undantag, bland annat TNF-α, som finns i höga halter i BALF men inte i serum. Cytokiner av intresse i serum bör utvärderas empiriskt innan storskalig utvärdering. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Lung Inflationen Använda Självtryck Resultat i Minskad Histopatologi Variability och förbättrad visualisering. Allvaret förskjutningsmetod för fixering beskrivs i detta protokoll möjliggör optimal histopatologisk utvärdering jämförbar ed till ouppblåsta lungor eller manuell inflationen. AB) Lungor fastställs genom gravitation inflationen visar enhetliga funktioner som möjliggör noggrann poäng, minskad alveolär skada, förbättrad visualisering och högre utvärderingar av inflammation. CD) Manuell uppblåsning av lungorna upplösning oftast resulterar i icke enhetliga områden av inflationen. C) Dessa olikformiga områden är ofta delvis uppblåst, vilket resulterar i kollapsade områden som ofta misstas som patologiska drag av nybörjare granskare. D) Manuell inflation leder också i områden av lungorna som är svulstiga, vilket resulterar i omfattande skador alveolär utrymmen. E) ouppblåst lungor visar kollapsade alveolarutrymmena och områden som är svåra att lösa och värdera utan omfattande utbildning. Likaså på grund av att organet som kollapsade denna teknik inte medger visualisering av lungorna som de visas i situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

De mest kritiska stegen för framgångsrikt utvärdera värdens immunsvar i mus lungorna är följande: 1) välja lämplig musstam och kön för modellen som utvärderas; 2) optimera PAMP leverans till lungorna; 3) rätt att samla in och bearbeta BALF; och 4) väl fixa och förbereda i lungorna för histopatologiska bedömningar.

Valet av musstam är en viktig faktor vid utvärdering av värdimmunsvar. C57BL / 6 möss är vanligtvis anses vara den optimala musen bakgrund för att studera medfödd immunitet på grund av deras Th1 skevning och robust svar på de flesta PAMPs. Likaså är BALB / c-möss som vanligtvis används för att studera allergiska sjukdomsmodeller på grund av deras Th2 skevning. En tredje vanligaste stam i lung modeller är möss på 129SvEv bakgrunden, på grund av deras gemensamma användning för att generera genetiskt modifierade djur. I alla fall, bör försiktighet iakttas vid försöksplanering och när det är möjligt, ålder och kön matched liters-mate kontrolldjur ska användas för studier som jämför genetiskt modifierade möss med vildtyp djur. Typiskt för LPS protokoll som beskrivs här, bör 6-12 veckor gamla köns matchade C57BL / 6 möss användas och ska väga minst 20 g.. Det är möjligt att LPS-exponeringen kommer att resultera i höga nivåer av morbiditet och mortalitet hos känsliga musstammar eller genotyper. Om detta inträffar kan det bli nödvändigt att justera flera aspekter av detta protokoll, inklusive minskning av LPS-dosen, med hjälp av större djur, och att byta kön på de djur som används i försöket. Småskaliga experiment bör inledningsvis utföras för att fastställa djurens känslighet och villkoren för varje experiment bör baseras på de mest mottagliga genotyp eller experimentell skick.

Orofaryngeal det administrationen har visat sig vara mer exakt än andra former av ombud leverans till lungorna ^2. Detta är till stor del beroende på den direkt tillgång till AIrway och kringgå frågor i samband med nasal och sinus hålrum nedfall. Men som med alla djurförsök, det kräver administration omfattande manuell skicklighet och praxis för att uppnå färdighet. Felaktig teknik kan resultera i ineffektiv lungdepositionen och i vissa fall resultera i djurskada. Normalt kan Evans Blue Dye (EBD) utnyttjas effektivt som en utbildning verktyg för detta förfarande, eller för att felsöka eventuella problem i samband med nedfall ^4. EBD kan administreras den och därefter extraheras från vävnaden med hjälp av formamid. Mängden EBD kan beräknas med användning absorptionsnivåer jämförs mot en standardkurva. I våra händer, varierar typiskt EBD återhämtning mellan 90-98%. Huvuddelen av den icke återvunna färgämne förväntas vara associerad med läckage i matstrupen. På grund av sin noggrannhet, är det administreringsteknik perfekt för att leverera ett brett urval av dos känsliga medel till lungorna, såsom farmaceutiska medeleller smittsamma organismer.

Analys av BALF och BALF cellularitet kan ge en betydande mängd insikt i den övergripande utvecklingen av värdens immunsvar. Inflammatoriska mediatorer som frigörs lokalt i lungorna efter stimulering effektivt kan kvantifieras i BALF användning av vanliga immunologiska tekniker, såsom ELISA och Western Blöt. På samma sätt kan utvärderas den cellulära sammansättningen av BALF användning av antingen differentiell cellfärgning eller flödescytometri. Att utveckla rätt teknik och fingerfärdighet är den mest kritiska delen av att utföra den lungsköljning (BAL). En av de vanligaste problemen som uppstår under BAL är underlåtenhet att fullt ut dra maximal vätskevolym som ursprungligen placerats i lungorna. Detta är ofta förknippat med ett felaktigt säkrade kanyl eller när nålar används i stället för verkliga kanyler. Specialized trakeala kanyler är kommersiellt tillgängliga. Det är också viktigt att den rörelse och kraftanvänds för att föra in och dra koksalt är slät och jämn under hela förfarandet. Protokollet som beskrivs här har optimerats för differentiell färgning av celler som samlats i BALF. Differential-färgning är en modifierad Wrights Giemsa-färg och är en mycket effektiv teknik för att genomföra morfologi baserad cell identifiering. Denna målningsteknik möjliggör differentiering av neutrofiler och eosinofiler som baseras på deras unika granulat färgningsegenskaperna. Monocyt härledda celler är också lätt att identifiera och är vanliga i BALF. Dessa inkluderar makrofager och dendritiska celler. På samma sätt är T-celler och B-celler också vanligt förekommande. Dessa monocytiska celler och lymfocyter är ofta svårt för de flesta forskare att exakt skilja baserat på enbart morfologi. Utnyttjandet av flödescytometri kan lägga mycket högre upplösning för dessa utvärderingar. Dock är låga cellantal som återvunnits från kontrolldjur ofta en begränsande faktor. Således Om flödes cytomEtry skall användas, experimentell design bör inbegripa ytterligare negativ kontroll för att öka cellåtervinning.

Lung histopatologi bedömningar är en annan viktig komponent i detta protokoll och göra det möjligt att direkt visualisering av sjukdomsprogression (fig. 3A och 3B). När lungorna är ordentligt förberedda, kan histopatologi kunna utvärderas, kvantifieras, och karakteriseras. Det mest kritiska steget i förberedelserna lungorna för histopatologi är korrekt blåsa dem med fixativ. Manuella metoder för inflation typiskt resultera i lungorna som är överfyllt, för lågt eller delvis uppblåsta, vilket resulterar i suboptimal visualisering och bedömningar morfologi (fig. 3C och 3D, respektive). Likaså lungor som inte är uppblåsta före fixering är mycket svårt att noggrant utvärdera och ofta resulterar i mycket variabla histopatologiska resultaten (figur 3 E). Allvaret metoden inflationen diskuteras här ger en mycket reproducerbar metod för inflationen med minimal variabilitet. Med denna teknik är det möjligt att utvärdera specifika landmärken i lungorna som är konsekventa mellan försöksdjur. Dessutom har gravitation inflationen med hjälp av en inflations monter visat att blåsa lungorna vid en fixeringstryck på 20 mm ^12. Denna teknik medger visualisering av lungorna i deras mest fysiologiskt relevant storlek och form och har visat sig vara mycket effektiv för utvärdering av känsliga patofysiologiska processer ^12. Det är viktigt att inflations montern ställas in på rätt höjd från musen för att skapa den rätta trycket. Om suboptimal inflationen observeras, bör höjden på inflations montern bestämmas empiriskt. Användningen av en kommersiellt tillgänglig liten gnagare lung inflation monter, vilket kommer att säkerställa en korrekt höjd, rekommenderas.

t "> Detta förfarande har optimerats för leverans av LPS och andra PAMPs till lungorna hos möss. När dessa tekniker behärskar, kan ytterligare studier också initieras med hjälp av modifierade protokoll för att effektivt utvärdera värd-patogen interaktioner använder levande patogener. Likaså den teknik som beskrivs här är mycket mångsidiga och kan tillämpas på alla studie är intresserade av att bedöma den kliniska och fysiologiska betydelsen av ett experimentellt eller farmaceutiskt medel. På grund av noggrannheten i doseringen, är denna teknik också perfekt för in vivo-studier som kräver en hög precision i agent leverans.

Detta förfarande har optimerats för leverans av LPS och andra PAMPs till lungorna hos möss. När dessa tekniker behärskar, kan ytterligare studier också initieras med hjälp av modifierade protokoll för att effektivt utvärdera värd-patogen interaktioner med hjälp av levande patogener. På samma sätt, de metoder som beskrivs här är mycket mångsidiga och kan be tillämpas på alla studie intresserade av att bedöma den kliniska och fysiologiska betydelsen av ett experimentellt eller farmaceutiskt medel. På grund av noggrannheten i doseringen, är denna teknik också perfekt för in vivo-studier som kräver en hög grad av precision i agent leverans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500