成绩单及代谢物谱烟草树和杨树的评价作为原料的生物基工业

Summary

植物生物质，提供对多个产品，包括燃料，饲料，食品和各种材料的可再生资源。在本文中，我们探讨烟草树（ 粉蓝烟草 ）和杨树为适合来源的生物炼制管线的属性。

Abstract

用于食品，饲料，能源和水资源的全球需求带来的后代寻常的挑战。显而易见的是，健壮平台为可再生资源的勘探是必要的，以克服这些挑战。在多国框架MultiBioPro我们正在开发的生物精炼厂的管道，以最大限度地利用植物生物量。具体而言，我们使用杨树和烟草树（ 粉蓝烟草 ）作为目标作物品种改善糖化，异戊二烯，长链烃含量，纤维品质和木栓质和木质素含量。用于获得这些输出的方法包括GC-MS，LC-MS和RNA测序平台。代谢物管线完善的工具来生成这些类型的数据，但也有只有充分表征代谢物的限制都可以使用。深测序将使我们能够包括所有笔录在烟草树的叶子发育阶段存在，但ħ以被映射回烟草的序列。有了这些设置窗口，我们的目标是一个基本的了解的基本流程，并在建立工业框架，利用这个结果。在一个更长远的角度来看，我们认为，这里所产生的数据提供装置，用于利用杨树和烟草树为原料可持续生物炼制过程。迄今为止代谢物的基础水平的样本中进行了分析，并利用该协议本文中提供。

Introduction

人口和经济增长造成了对食物，水和燃料的需求不断增加。许多这些用品的生产，加工和利用有限的矿物化手段，如石油输送。它是，但是，显然，这种做法是不可持续的，因此可替代资源的发展将具有十分重要的意义^1。许多可再生资源，在不同程度上，当前正被利用，包括风，水运动，太阳能，地热能和波浪为主的能源来源。另一种可持续的，主要是未开发的资源是来自植物的生物量。这个资源还提供了一个非常符合成本效益的方法来转换太阳能所产生的能量转化成燃料^2。除了提供生物基燃料，植物生物量还提供了替代产品，包括塑料，洗涤剂和有价值化学品的独特机会。

植物细胞壁，这在很大程度上是由基于糖的聚合物，麦的es了植物的生物量的主要大宗，目前正在投入了大量精力在其高效转化为生物乙醇。余下的生物质可随后被加工成沼气和石油相关的产品^3。大部分的多年生植物，包括各种草和树木，产生大量的纤维素生物质的一般生长最好在温带地区。然而，土地面积约20％，属半干旱，因此也容易发生旱灾^4。显然，这将是感兴趣的也培养这些干旱地区的植物，可以有效地促进可持续能源生产和材料。这些植物需要有一个最佳的水分利用效率和抗旱性，并会包括烟草树（ 粉蓝烟草 ），从龙舌兰属的物种。

该MultiBioPro财团的目标是实现一个集成的生物精炼厂的管道，使用两个重要的CR运种，杨树和烟草树。杨树已成为一个有前途的生物燃料作物，因为它是生长速度快，容易无性繁殖和高度适应广泛的气候和土壤条件。它还提供了一个广泛的木材，纤维，燃料木材和其他林产品^5。烟草树也成为一个合适的植物的生物燃料和生物炼制的目的。它通常会产生相当大量的生物质，含有大量的非结构性碳水化合物⁶的，也有积累大量的易于提取的非食用油脂（包括长链C _{29-C 31}饱和烃和三萜类），适合在生物柴油罕见的能力生产。烟草树，而且，服从遗传改良，具有较高的发芽能力，并愉快地在不用于食品生产半干旱地区土壤中生长。因此，似乎这两个杨树和烟草树具有内在潜力MULTIPurpose作物， 即作为新的高价值原料为一体的生物基工业。在本文中，我们着重于方法多样化辨别烟草树存款有多长链烃。

在试图确定负责对烟叶的饱和长链烃的生产和分泌潜在的分子机制，我们应用基础的技术现代的“组学”。这包括发育叶系列（10级）的RNA序列，以及多平台代谢物谱方法，使用LC-和GC-MS（用于极性和非极性代谢物和脂质组学）。这些数据将用于挖掘的基因表达，与相关联，或者先于，上文所述的分子的生物合成的起始。出现这些努力有希望的基因和途径，将用于在模式植物拟南芥功能测试，并可能最终将服从于TOB生物技术工程ACCO树。

Protocol

1，植物材料

成长粉蓝烟草植物中含30 M2的专业成长中公分直径的花盆。 生长的植物在温室中，用20-25℃的日间温度和15℃。夜间温度使用16小时光照和8小时黑暗周期为补充光照制度。

2，样品制备

1. 对于初级代谢产物：
   1. 收获的植物材料（叶和茎北路栎 ），并立即冷冻材料。
   2. 通过冷冻干燥冻干冷冻的植物材料为三天。
   3. 通过搅拌机磨与金属球研磨冻干样品。
   4. 等分细地干物料到2ml离心管或玻璃小瓶中。
2. 对于次级代谢产物：
   1. 收获植物组织，并立即冷冻材料。
   2. 用m冷冻研磨植物组织ixer磨不锈钢球或研钵和杵。
   3. 分装精细地组织分为2 ml离心管（约20毫克湿重）。

3，萃取气相色谱 - 质谱协议的代谢物谱的初级代谢产物

1. 等分部分地干燥的植物材料（10毫克叶和20mg的干物料）在2毫升，螺旋盖圆底试管中。
2. 新增1,400微升100％甲醇和漩涡，持续10秒。
3. 加入60微升核糖醇（0.2 mg / ml的股票在H ₂ O）作为内部量化的标准，涡旋10秒。
4. 新增一个不锈钢（或氧化锆）球和均质材料用搅拌机磨在25赫兹2分钟。
5. 离心混合10分钟，11,000×g的。
6. 将上清液转移至玻璃小瓶中。
7. 加入750μL氯仿。
8. 新增1,500微升H ₂ O和旋涡振荡混合10秒。
9. 从转移150微升上层相（极性相）到一个新的1.5毫升离心管中。
10. 用快速真空干燥样品。至关重要的是，将样品浓缩至干24之间3和小时，直到没有残留液体存在。
11. 加入40微升甲氧胺盐酸盐（20毫克/毫升吡啶）的。
12. 在37°C摇混在2小时水平散热块振动筛
13. 加入70微升的N-甲基-N - （三甲基硅基）三氟乙酰胺三氟乙酰胺混合。
14. 摇动混合2小时，在37°C。
15. 通过短暂离心〜1分钟，11,000×g的降速封面上的下降。
16. 液转移到合适的用于GC-MS分析的玻璃小瓶中。

4，提取的代谢物谱的次生代谢产物的LC-MS

1. 加入500μl甲醇的冻土样品。
2. 具有恒温15分钟摇动，在70℃（1,000秒^-1）。
3. 离心样品（5英里N，20000×g离心），并转移到1.5ml的离心管中的液体相。
4. 冻干液相用离心蒸发器（Speed​​Vac中）。
5. 加入100μl环己烷和100μL超纯水的干颗粒。
6. 摇晃样品5分钟，在室温下（利用涡流）。
7. 离心样品（5分钟，20,000×g离心）。
8. 转移80μL水相（下层相），以LC-MS注射瓶带有锥形底部的LC-MS分析。

5。数据分析

1. 配置Xcalibur，MarkerLynx，Metalign ⁷或XCMS ⁸选择数据分析进行处理。
2. 准备你按照表1复方阶级利益的峰值检测表。
3. 通过标准的化合物共流出识别峰。
4. 使用MSN分析，结构表征算法^9,10，文学s随后注释检测到的峰urvey和代谢物数据库检索^11,12。

6，油气开采¹³

1. 浸入新鲜收获N.青冈叶（〜200mg）的溶剂（甲醇，乙醇，氯仿，己烷或石油醚（沸点40-60℃或60-80℃）（5毫升; HPLC级）为2至20分钟。
2. 除去叶子，彻底擦干溶剂用旋转蒸发器。
3. 在己烷中重悬的样品（1毫升; HPLC级）。
4. 用气相色谱法和连字符到一个5973MSD进行GC-MS分析。工作条件应如下;载气，氦气为0.9毫升·分^-1 / 11磅的流率。注入样品（1微升）用不分流进样器在280℃下升温，在4℃/分钟至320℃之前，容纳了气相色谱烘箱中在70℃下进行5分钟保持最后的温度下再10分钟后，使67.5分钟的总时间。与MS设置接口在280℃和perform MS在使用70伏特EI +全扫描模式和从10到800 D.扫描
5. 最初处理的色谱部件通过自动去卷积MS和识别系统，和那些正在使用NIST 98 MS谱库鉴定。
6. 通过比较保留时间和经典的碎片模式，以已知的真实标准确认饱和的长链烷烃（hexacosenol，二十九烷，三十烷，octacosenol，nonacosonal，hentriacontane，三十二烷和tritriacontane）的标识。
7. 通过比较剂量反应曲线（0.07至2.5毫克），从真实标准构建集成峰面积定量确定烃。
8. 计算方法和使用Excel软件的方法（SEM）的标准误差。

类异戊二烯¹⁴ 7。分析

1. 在第2节中所述进行均质。称取10毫克匀浆冻干粉到离心管中。
2. 依次加入250ml甲醇上粉，拌匀，然后加入500氯仿溶液（实验室试剂级），并通过涡旋混合。
3. 留在冰上的样品在黑暗中20分钟。
4. 添加250毫升的Tris-HCl缓冲液（100毫米，pH值7.5）或水（HPLC级）悬浮液中并涡旋混合。
5. 以12,000 rpm（13,523×g离心）离心混合物5分钟，以非极性从水相分离。含有异戊二烯的萃取非极性氯仿相是在底部。
6. 相转移至新的离心管中。
7. 增加一个额外的500毫升氯仿至水相，并进行第二次提取由涡流并如上所述离心。
8. 合并氯仿萃取液，并把样品用蒸发器，并储存于-20℃直至分析至干。
9. 加入50毫升的乙酸乙​​酯（HPLC级），以干燥后的类异戊二烯萃取再溶解的物质。
10. 注入3毫升到C18使用的Acquity UPLC分离模块列。用于分离色素的梯度应包括;答：甲醇/ H _{2 O（50:50）}和B：乙腈/乙酸乙酯（75:25），和初始条件应该是A的30％（体积/体积）和B 70％（V / V）将100 ％B，历经6分钟。用0.6毫升/分钟的流速。
11. 与光电二极管阵列（PDA）检测器在250〜600 nm的连续监测洗脱液。
12. 通过共同色谱和正宗的标准，β-胡萝卜素（维生素原A），八氢番茄红素，番茄红素，叶黄素和玉米黄质的光谱进行比较识别组件。
13. 从剂量反应曲线进行定量。
14. 用LC-MS确认的化合物;使用类似的色谱条件。应使用APCI电离正离子模式与Q-TOF仪器上完成检测。
15. 做的修改对于生育酚判定与已提取和皂化在6％的KOH在50℃下1.5小时25毫克冻干材料。

该协议结合了Trizol法提取RNA用RNeasy试剂​​盒获得高质量的RNA。

1. 通过混合器研磨机研磨100毫克冷冻植物材料在2毫升的离心管中与金属球。
2. 加入1 ml Trizol法。
3. 离心10分钟，该材料在12,000×g离心在4℃下
4. 将上清液转移到一个新的反应管中。
5. 添加200μl的氯仿，颠倒试管几次，孵育3分钟，在室温下进行。
6. 离心反应混合物15分钟，以12,000×g离心在4℃下
7. 转移上层水相（约700微升）到一个新的反应管中。
8. 加约2.5倍体积的乙醇​​（100％），颠倒试管几次，并孵育30分钟，于-80℃。
9. 移动样品包括任何沉淀物，以从试剂盒中的旋转柱。
10. 离心柱为15秒，8,000×g离心，弃了F低通。
11. 加入700μl缓冲液RW1到离心柱，离心15秒，8,000×g的。通过丢弃的流量。
12. 加入500μl缓冲液RPE到离心柱，离心15秒列在8000×g的。通过丢弃的流量。
13. 加入500μl缓冲液RPE到离心柱和离心2分钟，8,000×g的。
14. 将离心柱到一个新的1.5 ml反应管中，加入50μl的不含RNA酶的水。
15. 离心1分钟的列在8000×g离心来洗脱RNA。
16. 使用Ambion公司的DNA-free试剂盒根据制造商的说明去除残留的DNA。
17. 确定RNA的质量。 RNA的应该有超过8 RNA的完整性号码（RIN）。
18. 送行的RNA为下一代测序。

Representative Results

图1中的HPLC图谱显示了N的类异戊二烯分析的代表性结果青冈叶提取物。采用光电二极管阵列（PDA）检测器进行检测C40的不同的类异戊二烯及以上。基于共同色谱和正宗的标准，β-胡萝卜素（维生素原A），八氢番茄红素，番茄红素，叶黄素和玉米黄质的光谱比较峰注释。 图2中的2的MS色谱图显示从N.初级代谢产物的分析结果青冈叶和茎的材料，分别。对应于丝氨酸（由箭头指示）的峰的质谱图，也给出一个例子。 图3显示了生物分析仪用于测定RNA的质量和从设备输出一个代表。在色谱图中的两个主峰对应于18 S和25秒的核糖体RNA，表明完整的RNA样品中。零散的肋骨附加峰osomal RNA会出现的情况下部分或严重降解的RNA。

图1显示存在于全叶提取物类异戊二烯HPLC图谱青冈。C40及以上的线路异戊二烯不适合于GC-MS分析。因此，我们用HPLC分离光电二极管阵列检测。显示记录在450 nm的典型色谱图。类胡萝卜素颜料是典型的叶黄素光合一边倒组织。同时出席的玉米黄质，这是很少的叶组织中发现，除非放置在高光的压力。玉米黄质的含量使其成为这个高价值的化合物的良好来源。 请点击这里查看更高的V版为这个数字的。

图2：MS色谱和N的频谱叶木莲组织提取物，总离子质谱色谱图（TIC）和茎用GC-MS测定提取物呈现（70-600 M / Z）。如在¹⁵前面的描述进行GC-MS分析。检测到的峰均采用质谱标记库的注解。丝氨酸（2TMS）的MS光谱示作为一个例子。 MS色谱：X轴和Y轴表示保留时间（分钟），并将该信号的强度（丰度），质谱：X轴和Y轴表示的M / Z比率和该信号的强度（丰度），分别为。 点击这里查看大图像。

图3为N的序列的RNA制备的RNA的生物分析仪测量青冈叶的材料。为了获得所需要的，我们提取的RNA用Trizol试剂，其后使用的列从RNeasy Mini试剂盒（Qiagen公司，希尔登，德国）纯化的RNA的RNA起高纯度的RNA。我们决定使用生物分析仪（安捷伦，德国Waldbronn）显示在左侧的RNA的质量。一个生物分析仪的输出的一个例子给出在右侧。样品中的两个主要的峰代表18 S和25秒的核糖体RNA。我们的样品显示出RNA的完整性数9.2（RIN），这是远高于8所需的值。 点击她E要查看大图。

Discussion

这里介绍的协议提供了一个全面的框架来分析烟草树叶的代谢物和成绩单。根据设想，这些联合的努力应该为我们提供了新的见解的碳氢化合物和目前在这个组织中的高价值化合物的合成和挤出相关的进程。因此，这些方法应该给我们怎样的化合物被合成一个更好的理解。除了烟草树方面的工作，目的也是为了提高杨树生物量，特别是针对次生壁结构的木质化，更要研究我们是否可以使用树皮提取有价值的化合物。

在本文提出的方法是标准化的方法代谢物谱稍作修改。这些方法当然不限于已知的代谢概况，并且有可能是几个新的代谢峰可能为瓦特以下方式获得HICH无化合物是已知的。我们希望通过合并代谢产物和成绩单在发育的时间序列行为把这些化合物在上下文中的其他代谢产物。

没有这里介绍的方法，从方法通常用于植物材料的显著改变。有趣的方面在于相结合的方法来理解主要是长链烃的生产和改装烟草树叶的底层框架。一种用于获得该信息的关键步骤是在不同的数据类型的随后的结合。我们设想，将数据作为第一评价的基础上，代谢/转录在发展，而这些数据将被用于推断的转录与代谢物的行为，并且还可能分配某些代谢产物途径的行为将被划分为不同的簇。另外，更复杂的基于网络的分析，然后设想吨Ø利用因果关系。

这里提出的分析方案也将提供现场试验和工业开发的生物质的基础。要做到这一点，MultiBioPro财团包含几个工业合作伙伴有能力进一步开拓生物质，目的是提供生物柴油，生物乙醇和其他高价值的化合物。这些类型的生物质利用，将根据评估; （1）测试生产生物产品的稳定性和质量（典型的工业标准测试将进行，以确保产生的产品具有良好的市场价值），（2），这些技术的经济，社会和环境评估将被执行采用文献资料，访谈，并且是在现场试验和试点生物精炼厂产​​生的评估材料。这些活动将包括成本效益和生命周期分析，环境卷宗和市场以及商务的产生SS策略。我们认为，这条管道将成为学​​术界的一个有用的融合，应用科学和工业开发，进一步杨树和烟草树生物质能消费的终端产品。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424