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जैव आधारित उद्योग के लिए फीडस्टॉक के रूप में तंबाकू ट्री और चिनार के मूल्यांकन के लिए ट्रांसक्रिप्ट और metabolite रूपरेखा

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51393
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3,4, 3,4, 3,4, 3,4, 5,6, 5,6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 1,14
1Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology, 2School of Biological Sciences, Plant Molecular Science, Centre for Systems and Synthetic Biology, Royal Holloway, University of London, 3Department of Plant Systems Biology, VIB, 4Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, UGhent, 5Institute for Building Materials, ETH Zurich, 6Applied Wood Materials, EMPA, 7Division of Glycoscience, School of Biotechnology, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH), 8European Research and Project Office GmbH, 9ABBA Gaia S.L., 10Pflanzenöltechnologie, 11Capax Environmental Services, 12Green Fuels, 13Neutral Consulting Ltd, 14Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne

ERRATUM NOTICE

Summary

संयंत्र बायोमास ईंधन, चारा, भोजन और सामग्री की एक किस्म सहित कई उत्पादों के लिए एक अक्षय स्रोत प्रदान करता है. इस पत्र में हम तंबाकू पेड़ (निकोटियाना ग्लॉका) और एक biorefinery पाइपलाइन के लिए चिनार के रूप में उपयुक्त सूत्रों के गुणों की जांच.

Abstract

भोजन, दूध, ऊर्जा और पानी के लिए वैश्विक मांग भविष्य की पीढ़ियों के लिए असाधारण चुनौतियों poses. यह नवीकरणीय संसाधनों के अन्वेषण के लिए मजबूत प्लेटफार्मों इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए आवश्यक हैं कि स्पष्ट है. बहुराष्ट्रीय ढांचे MultiBioPro के भीतर हम बायोमास संयंत्र के उपयोग को अधिकतम करने के लिए biorefinery पाइपलाइनों विकसित कर रहे हैं. अधिक विशेष रूप से, हम शर्करीकरण, isoprenoid, लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन सामग्री, फाइबर गुणवत्ता, और suberin और लिग्निन सामग्री में सुधार लाने के लिए लक्ष्य फसल प्रजातियों के रूप में चिनार और तंबाकू पेड़ (निकोटियाना ग्लॉका) का उपयोग करें. इन outputs प्राप्त करने के तरीकों का इस्तेमाल किया जीसी एमएस, नियंत्रण रेखा एमएस और शाही सेना अनुक्रमण प्लेटफार्मों शामिल हैं. metabolite पाइपलाइनों अच्छी तरह से डेटा के इन प्रकार उत्पन्न करने के लिए उपकरणों की स्थापना, लेकिन यह भी कहा कि केवल अच्छी तरह से होती मेटाबोलाइट्स में सीमाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है कर रहे हैं. गहरी अनुक्रमण हम सभी को तम्बाकू के पेड़ के पत्ते के विकास के चरणों के दौरान मौजूद टेप, लेकिन घंटे में शामिल करने की अनुमति देगातमाखू के अनुक्रम को वापस मैप किया जा सके. इन सेट अप के साथ, हम अंतर्निहित प्रक्रियाओं के लिए एक बुनियादी समझ पर और परिणामों का फायदा उठाने के लिए एक औद्योगिक ढांचे की स्थापना करना है. एक अधिक दीर्घकालिक परिप्रेक्ष्य में, हम यहाँ उत्पन्न डेटा कच्चे माल के रूप में चिनार और तंबाकू के पेड़ का उपयोग कर एक स्थायी biorefinery प्रक्रिया के लिए साधन प्रदान करेगा. नमूनों में मेटाबोलाइट्स के बेसल स्तर तारीख करने के लिए विश्लेषण किया गया है और उपयोग प्रोटोकॉल इस लेख में प्रदान की जाती हैं.

Introduction

जनसंख्या और आर्थिक विकास को भोजन, पानी और ईंधन के लिए एक बढ़ती हुई मांग के कारण होता है. इन आपूर्ति की ज्यादातर उत्पादित प्रसंस्कृत और पेट्रोलियम के रूप में परिमित जीवाश्म आधारित साधन का उपयोग कर ले जाया जाता है. यह इस अभ्यास स्थायी नहीं है, और वैकल्पिक संसाधनों का विकास इसलिए बहुत महत्व 1 का हो जाएगा, हालांकि, स्पष्ट है. कई संसाधनों अक्षय वर्तमान में हवा, पानी गति, सौर, geothermal सहित, शोषण किया जा रहा, डिग्री बदलती करने के लिए कर रहे हैं, और आधारित ऊर्जा स्रोतों लहर. एक और टिकाऊ और काफी हद तक अप्रयुक्त संसाधन पौधों से बायोमास है. इस संसाधन भी ईंधन 2 में सौर व्युत्पन्न ऊर्जा में परिवर्तित करने के लिए एक बहुत लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. इसके अलावा जैव आधारित ईंधन उपलब्ध कराने से, बायोमास संयंत्र भी प्लास्टिक, डिटर्जेंट, और मूल्यवान रसायन सहित वैकल्पिक उत्पादों, के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है.

बड़े पैमाने पर चीनी पॉलिमर आधारित होते हैं जो संयंत्र सेल दीवार, पहुंचपौधे की बायोमास के मुख्य थोक तों और अधिक प्रयास वर्तमान में bioethanol में अपनी कुशल रूपांतरण में निवेश किया जा रहा है. शेष बायोमास बाद में बायोगैस और तेल उत्पादों से संबंधित 3 में संसाधित किया जा सकता है. Cellulosic बायोमास की बड़ी मात्रा में उत्पादन कि घास और पेड़ों सहित बारहमासी पौधों की प्रजातियों,, की ज्यादातर आमतौर पर समशीतोष्ण क्षेत्रों में सबसे अच्छा हो जाना. हालांकि, भूमि क्षेत्र का लगभग 20% अर्द्ध शुष्क है, और इसलिए भी सूखा 4 होने का खतरा है. जाहिर है, यह भी प्रभावी रूप से ऊर्जा और सामग्री के सतत उत्पादन के लिए योगदान कर सकता है कि पौधों के साथ इन शुष्क भूमि पर खेती करने के लिए ब्याज की होगी. इन पौधों को एक इष्टतम पानी का उपयोग दक्षता और सूखा प्रतिरोध है और तंबाकू के पेड़ (निकोटियाना ग्लॉका) और Agave जीनस से प्रजातियों में शामिल होगा की जरूरत है.

MultiBioPro संघ के दो महत्वपूर्ण रुपए का उपयोग कर, एक एकीकृत biorefinery पाइपलाइन को लागू करने का उद्देश्यसेशन प्रजातियों, चिनार और तंबाकू पेड़. चिनार यह तेजी से बढ़ रहा है के रूप में, एक होनहार जैव ईंधन फसल के रूप में उभरा आसानी clonally प्रचारित और जलवायु और मिट्टी की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उच्च अनुकूलनीय गया है. यह भी लकड़ी, फाइबर, ईंधन की लकड़ी, और अन्य वन उत्पादों 5 की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है. तम्बाकू पेड़ भी जैव ईंधन और biorefinery प्रयोजनों के लिए एक उपयुक्त संयंत्र के रूप में उभरा है. यह आम तौर पर बायोमास की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन, nonstructural कार्बोहाइड्रेट 6 की उच्च मात्रा में होता है, और भी बायोडीजल के लिए उपयुक्त हैं (लंबी श्रृंखला सी 29 के सी 31 संतृप्त हाइड्रोकार्बन और triterpenoids सहित) आसानी से निष्कर्षण औद्योगिक तेलों की बड़ी मात्रा में जमा करने के लिए दुर्लभ क्षमता है उत्पादन. तम्बाकू पेड़ इसके अलावा, आनुवंशिक सुधार करने के लिए उत्तरदायी, उच्च अंकुरण क्षमता है, और खाद्य उत्पादन के लिए इस्तेमाल नहीं अर्द्ध शुष्क मिट्टी पर खुशी से बढ़ता है. इसलिए यह चिनार और तंबाकू पेड़ दोनों multip के लिए आंतरिक क्षमता है कि प्रतीत होता हैयानी एक एकीकृत जैव आधारित उद्योग के लिए नए उच्च मूल्य feedstocks के रूप में urpose फसलों,. इस पत्र में हम कैसे तंबाकू पेड़ जमा लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन विचार करने के लिए दृष्टिकोण के विविध सेट पर ध्यान केंद्रित.

तम्बाकू के पत्ते पर संतृप्त लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के उत्पादन और स्राव के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित आणविक मशीनरी की पहचान करने की कोशिश में, हम प्रौद्योगिकी आधारित आधुनिक "omics" लागू होते हैं. यह एक विकासात्मक पत्ती श्रृंखला (दस चरणों) की शाही सेना seq शामिल हैं, और multiplatform metabolite रूपरेखा का उपयोग कर नियंत्रण रेखा और जीसी एमएस (ध्रुवीय और nonpolar मेटाबोलाइट्स और lipidomics के लिए) दृष्टिकोण. इन आंकड़ों जीन के साथ संबद्ध है कि अभिव्यक्ति, या पछाड़, ऊपर संकेत अणुओं के biosynthesis की शुरुआत के लिए खान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इन प्रयासों से आशाजनक दिखाई देते हैं कि रास्ते जीन और मॉडल प्रजातियों Arabidopsis में कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और अंत में tob में जैव प्रौद्योगिकी इंजीनियरिंग के लिए उत्तरदायी हो सकता हैACCO पेड़.

Protocol

1. संयंत्र सामग्री

M2 पेशेवर बढ़ते मध्यम युक्त 30 सेमी व्यास बर्तन में निकोटियाना ग्लॉका पौधों को विकसित. एक दिन में 20-25 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 15 डिग्री सेल्सियस की रात में तापमान के साथ, Glasshouse में पौधों को विकसित अनुपूरक प्रकाश शासन के रूप में एक 16 घंटा प्रकाश और 8 घंटा अंधेरे चक्र का प्रयोग करें.

2. नमूना तैयार

  1. प्राथमिक मेटाबोलाइट्स के लिए:
    1. हार्वेस्ट संयंत्र सामग्री (पत्तियों और एन ग्लॉका की उपजा) और फ्रीज सामग्री तुरंत.
    2. तीन दिनों के लिए फ्रीज सुखाने से जमे हुए संयंत्र सामग्री Lyophilize.
    3. धातु गेंदों के साथ मिक्सर चक्की से lyophilized नमूने पीस.
    4. एक 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब या कांच की शीशी में विभाज्य ठीक जमीन सूखी सामग्री.
  2. माध्यमिक चयापचयों के लिए:
    1. हार्वेस्ट संयंत्र के ऊतकों और फ्रीज सामग्री तुरंत.
    2. मीटर से जमे हुए संयंत्र के ऊतकों पीसस्टेनलेस स्टील की गेंद के साथ या मोर्टार और मूसल से ixer मिल.
    3. 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (लगभग 20 मिलीग्राम गीला वजन) में विभाज्य ठीक जमीन ऊतकों.

जीसी एमएस द्वारा प्राथमिक चयापचयों के लिए metabolite रूपरेखा के लिए 3. निष्कर्षण प्रोटोकॉल

  1. विभाज्य जमीन सूखी संयंत्र सामग्री (पत्ती के 10 मिलीग्राम और स्टेम सामग्री के 20 मिलीग्राम) 2 मिलीलीटर में, दौर नीचे ट्यूब टोपी स्क्रू.
  2. 10 सेकंड के लिए 100% मेथनॉल और भंवर के 1400 μl जोड़ें.
  3. 10 सेकंड के लिए एक आंतरिक मात्रात्मक मानक और भंवर के रूप में Ribitol के 60 μl (एच 2 ओ में 0.2 मिलीग्राम / एमएल शेयर) जोड़ें.
  4. एक स्टेनलेस स्टील (या zirconia) गेंद जोड़ें और 25 हर्ट्ज पर 2 मिनट के लिए एक मिक्सर मिल के साथ सामग्री homogenize.
  5. एक्स छ 11,000 पर 10 मिनट के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र.
  6. एक कांच की शीशी स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  7. क्लोरोफॉर्म की 750 μl जोड़ें.
  8. एच 2 ओ के 1,500 μl जोड़ें और 10 सेकंड के लिए मिश्रण भंवर.
  9. से 150 μl स्थानांतरणएक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ऊपरी चरण (ध्रुवीय चरण).
  10. एक गति VAC का उपयोग कर शुष्क नमूनों. यह कोई अवशिष्ट तरल मौजूद है जब तक नमूने के बीच 3 और 24 घंटे के लिए सूखापन को कम कर रहे हैं कि जरूरी है.
  11. Methoxyamine हाइड्रोक्लोराइड (pyridine में 20 मिलीग्राम / एमएल) की 40 μl जोड़ें.
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक क्षैतिज गर्मी ब्लॉक प्रकार के बरतन में मिश्रण हिला
  13. 70 μl एन मिथाइल-N जोड़ें - (trimethylsilyl) trifluoroacetamide MSTFA मिश्रण.
  14. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिश्रण हिला
  15. 11,000 एक्स जी पर ~ 1 मिनट एक छोटी centrifugation द्वारा कवर पर बूँदें नीचे स्पिन.
  16. जीसी एमएस विश्लेषण के लिए उपयुक्त कांच की शीशियों में तरल स्थानांतरण.

नियंत्रण रेखा एमएस द्वारा माध्यमिक चयापचयों के लिए metabolite रूपरेखा के लिए 4. एक्सट्रैक्शन

  1. जमे हुए जमीन के नमूने के 500 μl मेथनॉल जोड़ें.
  2. 70 डिग्री सेल्सियस (1000 सेकंड -1) पर 15 मिनट के लिए एक thermomixer साथ हिला.
  3. नमूने (अपकेंद्रित्र 5 मीलएन, 20,000 XG) और एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरित तरल चरण.
  4. एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण (speedvac) के साथ तरल चरण Lyophilize.
  5. शुष्क गोली 100 μl cyclohexane और 100 μl milliQ पानी जोड़ें.
  6. कमरे के तापमान (प्रयोग भंवर) में 5 मिनट के लिए नमूने हिला.
  7. नमूने (5 मिनट, 20,000 XG) अपकेंद्रित्र.
  8. नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण के लिए शंक्वाकार नीचे के साथ नियंत्रण रेखा एमएस इंजेक्शन की शीशियों को पानी चरण (कम चरण) के 80 μl स्थानांतरण.

5. डेटा विश्लेषण

  1. Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 या XCMS 8 विन्यस्त करें और संसाधित करने के लिए डेटा विश्लेषण का चयन करें.
  2. तालिका 1 में मिश्रित वर्ग के अनुसार आपकी रुचि का पता लगाया चोटियों की एक तालिका तैयार करें.
  3. मानक यौगिकों के सह क्षालन द्वारा चोटियों को पहचानें.
  4. इसके बाद एमएसएन विश्लेषण, संरचनात्मक लक्षण वर्णन एल्गोरिदम 9,10, साहित्य एस का उपयोग कर पाया चोटियों पर टिप्पणीurvey और metabolite डेटाबेस खोज 11,12.

6. हाइड्रोकार्बन निकालना 13

  1. हौसले से काटा एन डूब 2-20 मिनट के लिए HPLC ग्रेड); ग्लॉका पत्तियों (मेथनॉल, इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म, हेक्सेन या पेट्रोलियम ईथर (उबलते बिंदु 40-60 डिग्री सेल्सियस या 60-80 डिग्री सेल्सियस) विलायक में (~ 200 मिलीग्राम) (5 एमएल.
  2. पत्तियों निकालें और रोटरी वाष्पीकरण द्वारा पूरी तरह से विलायकों बंद सूखी.
  3. हेक्सेन में Resuspend नमूने (1 मिलीलीटर, HPLC ग्रेड).
  4. गैस क्रोमैटोग्राफी और एक 5973MSD को बंटे का उपयोग जीसी एमएस विश्लेषण करते हैं. इस प्रकार के रूप में परिचालन की स्थिति में होना चाहिए; वाहक गैस, 0.9 मिलीलीटर मिनट -1/11 साई के प्रवाह की दर के साथ हीलियम. 280 डिग्री सेल्सियस पर एक splitless इंजेक्टर के साथ नमूने (1 μl) इंजेक्षन 4 डिग्री सेल्सियस / मिनट डिग्री सेल्सियस से 320 पर ramping से पहले 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गैस क्रोमैटोग्राफी ओवन पकड़ो 67.5 मिनट की कुल समय बना रही है, एक और 10 मिनट के लिए अंतिम तापमान पकड़ो. 280 डिग्री सेल्सियस और पी में एमएस के साथ इंटरफेसerform 70 eV ईआइ + का उपयोग पूर्ण स्कैन मोड में एमएस और 10 से 800 डी. से स्कैन
  5. प्रारंभ में वर्णलेख स्वचालित एमएस deconvolution और पहचान प्रणाली द्वारा घटकों, और NIST 98 एमएस पुस्तकालय का उपयोग पहचान कर रहे हैं कि उन पर कार्रवाई.
  6. जाना जाता प्रामाणिक मानकों को अवधारण समय और शास्त्रीय विखंडन पैटर्न की तुलना द्वारा संतृप्त लंबी श्रृंखला एल्केन हाइड्रोकार्बन (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane और tritriacontane) की पहचान की पुष्टि करें.
  7. प्रामाणिक मानकों से निर्मित खुराक प्रतिक्रिया घटता (0.07-2.5 मिलीग्राम), के साथ एकीकृत शिखर क्षेत्रों की तुलना द्वारा मात्रात्मक हाइड्रोकार्बन का निर्धारण करते हैं.
  8. साधन और एक्सेल सॉफ्टवेयर का प्रयोग होता है (SEM) के मानक त्रुटि की गणना.

आइसोप्रेनायड 14 से 7. विश्लेषण

  1. धारा 2 में वर्णित के रूप में homogenisation प्रदर्शन करना. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में homogenized फ्रीज सूखे पाउडर के 10 मिलीग्राम में तौलना.
  2. , पाउडर पर क्रमिक रूप से 250 मिलीलीटर मेथनॉल जोड़ें यह मिश्रण है, तो 500 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म (प्रयोगशाला अभिकर्मक ग्रेड) जोड़ने के लिए, और vortexing द्वारा मिश्रण.
  3. 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर नमूने छोड़ दें.
  4. निलंबन के लिए 250 एमएल Tris-एचसीएल बफर (100 मिमी, 7.5 पीएच) या पानी (HPLC ग्रेड) जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण.
  5. जलीय चरणों से nonpolar अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (13,523 XG) में मिश्रण अपकेंद्रित्र. isoprenoid अर्क युक्त nonpolar क्लोरोफॉर्म चरण तल पर है.
  6. एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब चरण हस्तांतरण.
  7. जलीय चरण के लिए एक अतिरिक्त 500 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें, और भंवर और ऊपर वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा एक दूसरे निकासी का संचालन.
  8. क्लोरोफॉर्म के अर्क का मिश्रण है और विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर बाष्पीकरण और दुकान का उपयोग सूखापन के नमूने लाने के लिए.
  9. सामग्री redissolve को सूखे isoprenoid निकालने के लिए 50 मिलीलीटर एथिल एसीटेट (HPLC ग्रेड) जोड़ें.
  10. एक C18 पर 3 एमएल इंजेक्षनएक UPLC Acquity जुदाई मॉड्यूल का उपयोग कर स्तंभ. पिगमेंट अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता ढाल शामिल होना चाहिए; एक: मेथनॉल / 2 एच 0 (50:50) और बी: acetonitrile / एथिल एसीटेट (75:25), और प्रारंभिक स्थिति एक 30% (v / v) और बी 70% (v / v) 100 करने जा होना चाहिए 6 मिनट से अधिक% बी. 0.6 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें.
  11. 250 से 600 एनएम से एक फोटो डायोड सरणी (पीडीए) डिटेक्टर के साथ लगातार eluate मॉनिटर.
  12. सह क्रोमैटोग्राफी और प्रामाणिक मानकों, बीटा कैरोटीन (provitamin ए), phytoene, लाइकोपीन, lutein और zeaxanthin के बीच वर्णक्रमीय तुलना द्वारा घटकों की पहचान.
  13. खुराक प्रतिक्रिया घटता से मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना.
  14. नियंत्रण रेखा एमएस का उपयोग यौगिकों की पुष्टि करें; इसी तरह chromatographic शर्तों का उपयोग करें. पता लगाने के एक क्यू-TOF उपकरण के साथ सकारात्मक मोड में APCI आयनीकरण का उपयोग किया जाना चाहिए.
  15. 1.5 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 6% KOH में निकाली गई और साबुन बनाने का काम किया गया है कि 25 मिलीग्राम फ्रीज सूखे सामग्री के साथ tocopherol निर्धारण के लिए संशोधन करना.

इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त करने के लिए एक RNeasy किट के साथ Trizol शाही सेना निकासी को जोड़ती है.

  1. एक मिक्सर चक्की से एक धातु गेंद के साथ 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में जमे हुए संयंत्र सामग्री के 100 मिलीग्राम पीस.
  2. 1 मिलीलीटर Trizol जोड़ें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए सामग्री अपकेंद्रित्र
  4. एक नए प्रतिक्रिया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
  5. , 200 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें ट्यूब कई बार पलटना, और कमरे के तापमान पर 3 मिनट सेते हैं.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 15 मिनट के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र
  7. एक नए प्रतिक्रिया ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण (लगभग 700 μl) स्थानांतरण.
  8. इथेनॉल के लगभग 2.5 संस्करण (100%) जोड़ें ट्यूब कई बार पलटना, और -80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते
  9. किट से स्पिन स्तंभ के लिए किसी भी वेग सहित नमूना ले जाएँ.
  10. 8000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र, और च त्यागनेके माध्यम से कम.
  11. 8000 x जी पर स्पिन स्तंभ और 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र 700 μl बफर RW1 जोड़ें. के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
  12. स्पिन स्तंभ के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ें और 8000 x जी पर 15 सेकंड के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र. के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
  13. 8000 x जी पर स्पिन स्तंभ और 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 500 μl बफर RPE जोड़ें.
  14. एक नया 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में स्पिन स्तंभ प्लेस और 50 μl RNase मुफ्त पानी जोड़ें.
  15. शाही सेना elute करने के लिए 8000 XG पर 1 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र.
  16. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Ambion डीएनए मुक्त किट का उपयोग अवशिष्ट डीएनए निकालें.
  17. शाही सेना की गुणवत्ता निर्धारित. आरएनए 8 ऊपर आरएनए अखंडता संख्या (Rin) होना चाहिए.
  18. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए शाही सेना विदा.

Representative Results

चित्रा 1 में HPLC प्रोफाइल एन के isoprenoid विश्लेषण का एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है ग्लॉका पत्ती निष्कर्षों. ऊपर विभिन्न C40 के आइसोप्रेनायड और एक फोटो डायोड सरणी (पीडीए) डिटेक्टर का उपयोग पाया गया. चोटियों सह क्रोमैटोग्राफी और प्रामाणिक मानकों, बीटा कैरोटीन (provitamin ए), phytoene, लाइकोपीन, lutein और zeaxanthin के बीच वर्णक्रमीय तुलना पर आधारित एनोटेट गया. चित्रा 2 में दो एमएस chromatograms एन से प्राथमिक metabolite विश्लेषण का परिणाम दिखाने ग्लॉका पत्ती और स्टेम सामग्री, क्रमशः. सेरीन (एक तीर द्वारा इंगित) को इसी एक चोटी के एमएस स्पेक्ट्रम भी एक उदाहरण के रूप में दिया जाता है. चित्रा 3 Bioanalyzer शाही सेना की गुणवत्ता और युक्ति से एक प्रतिनिधि के उत्पादन का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता से पता चलता है. वर्णलेख में दो मुख्य चोटियों नमूने में बरकरार शाही सेना का संकेत है, 18 एस और 25 एस ribosomal शाही सेना के लिए इसी. खंडित पसली की अतिरिक्त चोटियोंosomal आरएनए आंशिक रूप से या भारी अपमानित शाही सेना के मामले में प्रदर्शित होगी.

चित्रा 1
चित्रा 1. एन से पत्ती निष्कर्षों में मौजूद आइसोप्रेनायड दिखा HPLC प्रोफाइल ग्लॉका. ऊपर C40 और के अधिकांश आइसोप्रेनायड जीसी एमएस विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. इसलिए हम photodiode सरणी का पता लगाने के साथ HPLC विभाजन का इस्तेमाल किया. 450 एनएम पर दर्ज एक ठेठ वर्णलेख दिखाया गया है. कैरोटीनॉयड पिगमेंट lutein predominating साथ संश्लेषक ऊतकों के प्रतीक हैं. इसके अलावा वर्तमान उच्च प्रकाश तनाव में रखा, जब तक शायद ही कभी पत्ता ऊतक में पाया जाता है, जो zeaxanthin है. zeaxanthin के स्तर यह इस उच्च मूल्य परिसर का एक अच्छा स्रोत बना. एक बड़ा वी देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के ersion.

चित्रा 2
चित्रा 2. एमएस वर्णलेख और एन के स्पेक्ट्रम ग्लॉका ऊतक के अर्क. कुल आयन एमएस पत्ती की वर्णलेख (घरेलू) और जीसी एमएस द्वारा मापा अर्क स्टेम (70-600 मी / z) प्रस्तुत किया है. जीसी एमएस विश्लेषण 15 में पहले से वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था. पता लगाया चोटियों जन वर्णक्रम टैग पुस्तकालय का उपयोग कर एनोटेट गया. सेरीन (2TMS) के एमएस स्पेक्ट्रम एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है. एमएस वर्णलेख: एक्स अक्ष और y अक्ष अवधारण समय (मिनट) और संकेत की तीव्रता (बहुतायत) से संकेत मिलता है, एमएस स्पेक्ट्रम: एक्स अक्ष और y अक्ष मी / z अनुपात और संकेत की तीव्रता (बहुतायत) से संकेत मिलता है, क्रमशः. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंछवि.

चित्रा 3
चित्रा 3. एन के आरएनए seq के लिए तैयार शाही सेना के Bioanalyzer माप ग्लॉका पत्ती सामग्री. हम Trizol अभिकर्मक का उपयोग आरएनए निकाला और बाद में RNeasy मिनी किट (Qiagen, Hilden, जर्मनी) से स्तंभों का उपयोग आरएनए शुद्ध किया आरएनए seq के लिए आवश्यक अत्यधिक शुद्ध आरएनए प्राप्त करें. हम Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, जर्मनी) छोड़ दिया पर प्रदर्शित का उपयोग शाही सेना गुणवत्ता निर्धारित की. एक Bioanalyzer उत्पादन का एक उदाहरण सही पर दिया जाता है. नमूने में दो मुख्य चोटियों 18 एस और 25 एस ribosomal शाही सेना का प्रतिनिधित्व करते हैं. हमारे नमूना अच्छी तरह से 8 की अपेक्षित मूल्य से ऊपर है जो 9.2 के एक शाही सेना अखंडता संख्या (Rin) से पता चला है. उसे क्लिक करेंबड़ी छवि को देखने के लिए ई.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मेटाबोलाइट्स और टेप के लिए तम्बाकू पेड़ के पत्तों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूपरेखा प्रदान करते हैं. यह इन संयुक्त प्रयासों हाइड्रोकार्बन और इस ऊतक में मौजूद उच्च मूल्य यौगिकों के संश्लेषण और बाहर निकालना अंतर्निहित प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान करना चाहिए कि परिकल्पना की गई है. इन तरीकों इसलिए हमें यौगिकों संश्लेषित किया जा रहा है कि कैसे एक बेहतर समझ देना चाहिए. काम के तम्बाकू पेड़ पहलुओं के अलावा, यह भी विशेष रूप से माध्यमिक दीवार संरचना की lignification को लक्षित है, बल्कि हम बहुमूल्य यौगिकों की निकासी के लिए छाल का उपयोग कर सकते हैं कि क्या पता लगाने के लिए, चिनार बायोमास में सुधार करने के उद्देश्य से है.

इस पत्र में प्रस्तुत तरीकों metabolite रूपरेखा के लिए मानकीकृत तरीके से थोड़ा संशोधन कर रहे हैं. इन तरीकों के पाठ्यक्रम में जाना चयापचय प्रोफाइल तक ही सीमित हैं, और यह कई नए चयापचय चोटियों w के लिए प्राप्त किया जा सकता है कि संभव हैhich कोई परिसर में जाना जाता है. हम विकास के समय श्रृंखला पर मेटाबोलाइट्स और टेप के व्यवहार के संयोजन से अन्य मेटाबोलाइट्स के संदर्भ में इन यौगिकों डाल की उम्मीद है.

यहाँ प्रस्तुत तरीकों में से कोई भी काफी आम तौर पर संयंत्र सामग्री के लिए इस्तेमाल किया तरीकों से बदल रहे हैं. दिलचस्प पहलू तंबाकू पेड़ के पत्तों में मुख्य रूप से लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन उत्पादन और संशोधन के लिए अंतर्निहित ढांचे को समझने के लिए विधियों के संयोजन में निहित है. यह जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक विभिन्न प्रकार के डेटा के बाद के संयोजन है. हम पहली बार एक मूल्यांकन के रूप में डेटा के विकास पर और इन आंकड़ों metabolite व्यवहार बनाम प्रतिलेख अनुमान किया जाएगा, और भी संभावित रास्ते के लिए कुछ मेटाबोलाइट्स आवंटित करने के लिए कि मेटाबोलाइट्स / टेप के व्यवहार के आधार पर विभिन्न समूहों में विभाजित किया जाएगा कि कल्पना . इसके अलावा, अधिक व्यापक नेटवर्क आधारित विश्लेषण तो टी कल्पना कर रहे हैंओ कारण रिश्तों शोषण.

यहाँ प्रस्तुत विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल भी क्षेत्र के परीक्षणों और बायोमास के औद्योगिक शोषण के लिए एक आधार प्रदान करेगा. इसे पूरा करने के MultiBioPro संघ क्षमता है कि कई औद्योगिक भागीदारों आगे बायोडीजल bioethanol और अन्य उच्च मूल्य यौगिकों देने के उद्देश्य से, बायोमास का पता लगाने के लिए होता है. बायोमास शोषण के इन प्रकार के आधार पर मूल्यांकन किया जाएगा; (1) उत्पादित जैव उत्पादों की मजबूती और गुणवत्ता परीक्षण (विशिष्ट उद्योग मानक परीक्षण उत्पन्न उत्पादों अच्छा बाजार मूल्य सुनिश्चित करने के लिए ही किया जाएगा), (2), प्रौद्योगिकी के एक आर्थिक, सामाजिक और पर्यावरणीय मूल्यांकन किया जाएगा प्रदर्शन साहित्य स्रोतों, साक्षात्कार और क्षेत्र परीक्षण और प्रायोगिक संयंत्र biorefinery आकलन के दौरान उत्पन्न होता है कि सामग्री का उपयोग. इन गतिविधियों लागत लाभ और जीवन चक्र विश्लेषण, एक पर्यावरण फाइल और बाजार और कारोबार की पीढ़ी में शामिल होंगेएसएस रणनीतियों. हम इस पाइपलाइन शिक्षा के एक उपयोगी मिश्रण बन जाएगा, उपभोक्ता अंत उत्पादों के लिए आगे चिनार और तंबाकू पेड़ बायोमास को विज्ञान और औद्योगिक शोषण लागू किया.

Disclosures

इन परिणामों के लिए अग्रणी शोध अनुदान समझौते संख्या 311,804 के तहत यूरोपीय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम ([FP7/2007-2013]) से धन प्राप्त हुआ है.

Acknowledgments

डोमिनिक स्विंटन (हरी ईंधन), थॉमस Lowery (हरी ईंधन), सैम Buekenhout (Capax), और सिल्विया Drouven (Capax): MultiBioPro भी परियोजना के लिए योगदान जो निम्नलिखित लोगों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol reagent Invitrogen 15596-026
Chloroform Merck 102445
Ethanol Merck 101986
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
TURBO Dnase Invitrogen AM2238
RNA 6000 Nano Kit Agilent G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Agilent G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes Eppendorf 0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls Geyer Berlin GmbH VA2mm
Mixer mill MM 300 Retsch YO-04182-09
Microcentrifuge Eppendorf 5424

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References

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Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 87 वनस्पति विज्ञान पौधों Biorefining चिनार तंबाकू पेड़ Arabidopsis suberin लिग्निन सेल दीवारों बायोमास लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन आइसोप्रेनायड, जीव विज्ञान प्रणाली

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry
Posted by JoVE Editors on 06/30/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry.

There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:

Juan Pedro Navarro

to:

Juan Navarro-Aviñó

जैव आधारित उद्योग के लिए फीडस्टॉक के रूप में तंबाकू ट्री और चिनार के मूल्यांकन के लिए ट्रांसक्रिप्ट और metabolite रूपरेखा
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Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., … More

Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., Mortimer, C. L., Kozlo, A., Fraser, P. D., Funke, N., Cesarino, I., Vanholme, R., Boerjan, W., Morreel, K., Burgert, I., Gierlinger, N., Bulone, V., Schneider, V., Stockero, A., Navarro-Aviñó, J., Pudel, F., Tambuyser, B., Hygate, J., Bumstead, J., Notley, L., Persson, S. Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry. J. Vis. Exp. (87), e51393, doi:10.3791/51393 (2014).

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