Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l'industria con sede a Bio

Summary

Biomassa vegetale offre una risorsa rinnovabile per più prodotti, compreso il combustibile, mangimi, prodotti alimentari e una varietà di materiali. In questo articolo analizziamo le proprietà di albero di tabacco (Nicotiana glauca) e pioppo fonti adatti per una pipeline bioraffineria.

Abstract

La domanda globale di cibo, mangimi, energia e acqua pone sfide straordinarie per le generazioni future. E 'evidente che le piattaforme robuste per l'esplorazione delle risorse rinnovabili sono necessari per superare queste sfide. Nel quadro multinazionale MultiBioPro stiamo sviluppando condotte bioraffineria per massimizzare l'uso della biomassa vegetale. Più specificamente, usiamo pioppo e albero di tabacco (Nicotiana glauca) come specie coltivate obiettivo per migliorare saccarificazione, isoprenoidi, contenuti lunghe catene di idrocarburi, la qualità della fibra, e suberina e lignina contenuti. I metodi utilizzati per ottenere queste uscite includono GC-MS, LC-MS e piattaforme di sequenziamento di RNA. Le tubazioni metabolita sono ben strumenti istituito per generare questi tipi di dati, ma anche le limitazioni che i metaboliti solo ben caratterizzati possono essere utilizzati. Il sequenziamento profondo ci permetterà di includere tutte le trascrizioni presenti durante le fasi di sviluppo dell'albero di tabacco in foglia, ma hcome da mappare indietro alla sequenza di Nicotiana tabacum. Con questi set-up, puntiamo a una conoscenza di base dei processi sottostanti e ad istituire un quadro industriale a sfruttare i risultati. In una prospettiva di più lungo termine, riteniamo che i dati generati qui forniranno i mezzi per un processo di bioraffineria sostenibile utilizzando pioppo e tabacco come materia prima. Ad oggi il livello basale di metaboliti nei campioni sono stati analizzati ed i protocolli utilizzati sono fornite in questo articolo.

Introduction

Popolazione e la crescita economica hanno causato una crescente domanda di cibo, acqua e combustibili. Gran parte di queste forniture sono prodotti, lavorati e trasportati con mezzi fossili finite, come il petrolio. È tuttavia evidente che tale pratica non è sostenibile, e lo sviluppo di risorse alternative saranno quindi di grande importanza ^1. Molte risorse rinnovabili sono, in misura diversa, attualmente sfruttata, tra cui vento, moto d'acqua, solare, geotermica, e onda fonti di energia basate. Un'altra risorsa sostenibile e in gran parte non sfruttato è la biomassa dalle piante. Questa risorsa offre anche un modo molto economico per convertire l'energia solare in combustibili derivati ^​​2. Oltre a fornire carburante bio-based, la biomassa vegetale offre anche opportunità uniche per prodotti alternativi, tra cui plastica, detersivi e prodotti chimici di valore.

La parete delle cellule vegetali, che è costituito essenzialmente da polimeri a base di zucchero, makes la parte più consistente della biomassa della pianta e molto sforzo è attualmente investito nella sua conversione efficiente in bioetanolo. La biomassa residua può successivamente essere trasformati in biogas e prodotti petroliferi correlati ^3. Gran parte delle specie di piante perenni, comprese le erbe e alberi, che producono grandi quantità di biomassa cellulosica in genere crescono meglio nelle zone temperate. Tuttavia, circa il 20% del territorio è semi-arida, ed è quindi anche incline alla siccità ^4. Ovviamente, sarebbe di interesse a coltivare anche queste terre aride con piante che potrebbero contribuire efficacemente alla produzione sostenibile di energia e materiali. Queste piante necessitano di avere un ottimale efficienza dell'uso dell'acqua e la resistenza alla siccità e dovrebbe includere l'albero di tabacco (Nicotiana glauca) e specie del genere Agave.

Il consorzio MultiBioPro mira ad attuare una pipeline bioraffineria integrata, usando le due importanti crspecie op, pioppo e albero di tabacco. Pioppo è emerso come una coltura biocarburante promettente in quanto è in rapida crescita, facile clonale propagate e altamente adattabile ad una vasta gamma di condizioni climatiche e pedologiche. Fornisce inoltre una vasta gamma di legno, fibre, legno combustibile, e di altri prodotti forestali ^5. L'albero del tabacco è anche emerso come un impianto idoneo ai fini di biocarburanti e di bioraffineria. Produce tipicamente notevoli quantità di biomassa, contiene elevate quantità di carboidrati non strutturali ^6, e ha anche la rara capacità di accumulare grandi quantità di oli non alimentari facilmente estraibili (compresi lunga catena C _{29-C 31} idrocarburi saturi e triterpenoidi) che sono adatti per biodiesel produzione. L'albero del tabacco è, inoltre, suscettibili di miglioramento genetico, ha elevata capacità di germinazione, e cresce felicemente su terreni semi-aridi non utilizzati per la produzione alimentare. Sembra pertanto che sia pioppo e albero di tabacco hanno un potenziale intrinseco per multipcolture INALITÀ, cioè come nuove materie prime ad alto valore aggiunto per un settore bio-based integrativa. In questo articolo ci concentriamo su serie diversificata di approcci di discernere idrocarburi a catena lunga come depositi albero di tabacco.

Nel tentativo di identificare il meccanismo molecolare sottostante responsabile per la produzione e la secrezione degli idrocarburi saturi a catena lunga sulle foglie di tabacco, applichiamo moderni "omiche" tecnologie basate. Questo include RNA ss di una serie foglia sviluppo (dieci tappe), e multipiattaforma metabolita profiling si avvicina con LC e GC-MS (per i metaboliti e lipidomica polari e non polari). Tali dati saranno utilizzati per estrarre per l'espressione genica che correla con, o precede, l'insorgenza di biosintesi delle molecole sopra indicati. Geni e vie che appaiono promettenti da questi sforzi saranno utilizzati per i test funzionali in Arabidopsis modello di specie e potrebbe in definitiva essere suscettibili di ingegneria biotecnologica in tobAlbero di acco.

Protocol

1. Materiale Pianta

Crescere le piante Nicotiana glauca in 30 vasi cm di diametro contenenti M2 mezzo di crescita professionale. Crescere le piante in serra, con una temperatura diurna di 20-25 ° C e la temperatura notturna di 15 ° C. Utilizzare una luce 16 ore e 8 ore di ciclo buio come regime luce supplementare.

2. Preparazione del campione

1. Per metaboliti primari:
   1. Materiali vegetali Harvest (foglie e steli di N. glauca) e materiale di congelare immediatamente.
   2. Lyophilize materiali vegetali congelati liofilizzazione per tre giorni.
   3. Grind campioni liofilizzati da mulino mixer con sfere di metallo.
   4. Aliquota terra multa materiali secchi in una provetta da 2 ml o flaconcino di vetro.
2. Per metaboliti secondari:
   1. Tessuti vegetali Harvest e materiale congelare immediatamente.
   2. Grind tessuti vegetali congelati mmulino a ixer con sfera in acciaio inox o con mortaio e pestello.
   3. Aliquota pregiati tessuti di terra in 2 ml centrifuga tubo (circa 20 mg di peso umido).

3. Estrazione Protocollo per Metaboliti Profiling per metaboliti principali mediante GC-MS

1. Terra aliquota materiale vegetale secco (10 mg di foglia e 20 mg di materiali staminali) in 2 ml, tappo, tubi circolari.
2. Aggiungere 1,400 ml di metanolo 100% e vortex per 10 sec.
3. Aggiungere 60 ml di Ribitolo (0,2 mg / ml di archivi in H ₂ O) come standard quantitativo interno e vortex per 10 sec.
4. Aggiungere un acciaio inossidabile (o zirconia) in profondità e omogeneizzare materiale con un mulino miscelatore per 2 min a 25 Hz.
5. Centrifugare la miscela per 10 min a 11.000 x g.
6. Trasferire il surnatante in un flacone di vetro.
7. Aggiungere 750 ml di cloroformio.
8. Aggiungere 1,500 ml di H ₂ O e agitare la miscela per 10 sec.
9. Trasferire 150 microlitri dalfase superiore (fase polare) in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml.
10. Campioni a secco utilizzando una vac velocità. E 'indispensabile che i campioni sono ridotti a secco tra il 3 e 24 ore fino a quando non liquido residuo è presente.
11. Aggiungere 40 ml di Methoxyamine cloridrato (20 mg / ml in piridina).
12. Agitare la miscela in un blocco riscaldante agitatore orizzontale per 2 ore a 37 ° C.
13. Aggiungere 70 ml N-metil-N - (trimetilsilil)-trifluoroacetamide mix MSTFA.
14. Agitare la miscela per 2 ore a 37 ° C.
15. Spin giù le gocce sul coperchio con un breve centrifugazione ~ 1 min a 11.000 x g.
16. Trasferire il liquido in fiale di vetro idonei per l'analisi GC-MS.

4. Estrazione di metaboliti secondari Profiling per metaboliti mediante LC-MS

1. Aggiungere 500 ml di metanolo ai campioni terreno ghiacciato.
2. Agitare con un thermomixer per 15 min a 70 ° C (1,000 sec ^-1).
3. Centrifugare i campioni (5 kmn, 20.000 xg) e la fase liquida trasferito in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
4. Liofilizzare la fase liquida con un evaporatore centrifugo (speedvac).
5. Aggiungere 100 microlitri cicloesano e 100 microlitri di acqua milliQ al pellet asciutto.
6. Agitare i campioni per 5 min a temperatura ambiente (uso vortice).
7. Centrifugare i campioni (5 min, 20.000 XG).
8. Trasferire 80 ml di fase acquosa (fase inferiore) per fiale LC-MS con fondo conico per l'analisi LC-MS.

5. Analisi dei dati

1. Configurare Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ o ⁸ XCMS e selezionare l'analisi dei dati da elaborare.
2. Preparare un tavolo di picchi rilevati di tuo interesse in conformità con classe di composti nella Tabella 1.
3. Identificare i picchi da co-eluizione di composti standard.
4. Successivamente annotare picchi rilevati tramite analisi MSN, algoritmi di caratterizzazione strutturale ^9,10, letteratura survey e metabolita ricerca del database ^11,12.

6. Idrocarburi Estrazione ¹³

1. Immergere N. appena raccolte foglie glauca (~ 200 mg) in solvente (metanolo, etanolo, cloroformio, esano o etere di petrolio (punto di ebollizione 40-60 ° C o 60-80 ° C) (5 ml; qualità HPLC) da 2 a 20 min.
2. Togliere le foglie e asciugare completamente solventi per evaporazione rotante.
3. Campioni Risospendere in esano (1 ml; qualità HPLC).
4. Eseguire l'analisi GC-MS mediante gascromatografia e la sillabazione di un 5973MSD. Condizioni operative devono essere le seguenti; gas di trasporto elio con un flusso di 0,9 ml min ^-1 / 11 psi. Iniettare campioni (1 mL) con un iniettore splitless a 280 ° C. Tenere il forno gascromatografia a 70 ° C per 5 min prima della rampa a 4 ° C / min a 320 ° C. Mantenere la temperatura finale per altri 10 min, per un tempo totale di 67,5 min. Impostare l'interfaccia con la MS a 280 ° C e peffettuare la giusta MS in modalità di scansione completa con 70 eV EI + e scansionata 10-800 D.
5. Inizialmente elaborare i componenti cromatogramma di deconvoluzione MS automatico e sistema di identificazione, e quelli che vengono identificati utilizzando la libreria NIST 98 MS.
6. Confermare l'individuazione di idrocarburi saturi a catena lunga alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane e tritriacontane) confrontando i tempi di ritenzione e modelli di frammentazione classici standard autentici noti.
7. Determinare gli idrocarburi quantitativamente confrontando aree di picco integrate con le curve dose-risposta (0,07-2,5 mg), costruiti dagli standard autentici.
8. Calcola mezzi e errore standard dei mezzi (SEM) utilizzando il software Excel.

7. Analisi degli isoprenoidi ¹⁴

1. Eseguire omogeneizzazione come descritto nella sezione 2. Pesare 10 mg di congelamento omogeneizzati polvere essiccata in una provetta da centrifuga.
2. Aggiungi sequenziale da 250 ml di metanolo sulla polvere, mescolare, quindi aggiungere 500 ml di cloroformio (laboratorio di grado reagente), e mescolare nel vortex.
3. Lasciare i campioni sul ghiaccio al buio per 20 min.
4. Aggiungere 250 ml di tampone Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) o acqua (qualità HPLC) alla sospensione e mescolare nel vortex.
5. Centrifugare la miscela a 12.000 rpm (13.523 xg) per 5 minuti per separare il apolare da fasi acquose. La fase cloroformio non polare contenente estratti isoprenoidi è in fondo.
6. Trasferire la fase in un tubo da centrifuga.
7. Aggiungere un ulteriore 500 ml di cloroformio per la fase acquosa, e condurre una seconda estrazione con vortice e centrifugazione come descritto sopra.
8. Combinare gli estratti di cloroformio e portare i campioni a secchezza usando l'evaporatore e conservare a -20 ° C fino all'analisi.
9. Aggiungere 50 ml di acetato di etile (grado HPLC) per l'estratto secco isoprenoidi per ridisciogliere il materiale.
10. Iniettare 3 ml su un C18colonna utilizzando un modulo di separazione UPLC. Il gradiente utilizzato per separare i pigmenti dovrebbe comprendere; A: metanolo / H ₂ 0 (50:50) e B: acetato di acetonitrile / etile (75:25), e le condizioni iniziali devono essere 30% (v / v) e B 70% (v / v) andando a 100 % B oltre 6 min. Utilizzare una portata di 0,6 ml / min.
11. Monitorare l'eluato continuamente con un Array Photo Diode (PDA) rilevatore di 250-600 nm.
12. Identificare i componenti mediante co-cromatografia e confronti spettrali tra le norme autentici, Beta-carotene (provitamina A), fitoene, licopene, luteina e zeaxantina.
13. Eseguire la quantificazione da curve dose-risposta.
14. Confermare composti utilizzando la LC-MS; utilizzare condizioni cromatografiche simili. Rilevamento deve essere eseguita utilizzando APCI di ionizzazione in modo positivo con uno strumento Q-Tof.
15. Apportare le modifiche per la determinazione tocoferolo con 25 mg freeze materiale secco che è stato estratto e saponificazione a 6% KOH al 50 ° C per 1,5 ore.

Questo protocollo unisce l'estrazione di RNA Trizol con un kit RNeasy per ottenere RNA di alta qualità.

1. Macinare 100 mg di materiale vegetale congelato in 2 ml provette da centrifuga con una sfera di metallo mediante un mulino miscelatore.
2. Aggiungere 1 ml di Trizol.
3. Centrifugare il materiale per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
4. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di reazione.
5. Aggiungere 200 microlitri cloroformio, capovolgere la provetta diverse volte, e incubare 3 minuti a temperatura ambiente.
6. Centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
7. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 700 ml) in un nuovo tubo di reazione.
8. Aggiungere circa 2,5 volumi di etanolo (100%), invertire la provetta diverse volte, e incubare per 30 minuti a -80 ° C.
9. Spostare il campione compreso l'eventuale precipitato alla colonna di spin dal kit.
10. Centrifugare la colonna per 15 sec a 8.000 xg, e scartare il fbasso attraverso.
11. Aggiungere 700 microlitri Buffer RW1 alla colonna di spin e centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flusso attraverso.
12. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare la colonna per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flusso attraverso.
13. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare per 2 min a 8.000 x g.
14. Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di reazione da 1,5 ml e aggiungere 50 di acqua RNase-free microlitri.
15. Centrifugare la colonna per 1 min a 8000 xg per eluire l'RNA.
16. Rimuovere il DNA residuo utilizzando un kit di connessione-DNA Ambion secondo le istruzioni del produttore.
17. Determinare la qualità dell'RNA. L'RNA dovrebbe avere i numeri integrità dell'RNA (RIN) di cui sopra 8.
18. Inviare via l'RNA per sequenziamento di nuova generazione.

Representative Results

Il profilo HPLC in Figura 1 mostra un risultato rappresentativo dell'analisi isoprenoidi di N. estratti di foglie glauca. Le diverse isoprenoidi di C40 e superiori sono stati rilevati utilizzando un Array Photo Diode (PDA) rivelatore. I picchi sono stati annotati sulla base di co-cromatografia e confronto spettrale tra le norme autentici, Beta-carotene (provitamina A), fitoene, licopene, luteina e zeaxantina. I due cromatogrammi MS in figura 2 mostrano il risultato dell'analisi metabolita primario da N. foglia glauca e lo stelo materiale, rispettivamente. Lo spettro MS di un picco corrispondente a serina (indicato da una freccia) è data anche come esempio. Figura 3 mostra il Bioanalyzer utilizzato per determinare la qualità dell'RNA e un'uscita rappresentante dal dispositivo. I due picchi principali nel cromatogramma corrispondente a 18 S e 25 S ribosomiale RNA, indicando RNA intatto nel campione. Altri picchi di costola frammentataosomal RNA sembrerebbe in caso di RNA parzialmente o fortemente degradati.

Figura 1. Profilo HPLC mostra isoprenoidi presenti in estratti di foglie di N. glauca. maggior parte isoprenoidi di C40 e, soprattutto, non sono suscettibili di analisi GC-MS. Abbiamo quindi utilizzato separazioni HPLC con rivelazione di fotodiodi. Viene mostrato un tipico cromatogramma registrato a 450 nm. I pigmenti carotenoidi sono tipici dei tessuti fotosintetici con luteina predominante. Presente anche è zeaxantina, che si trova raramente in tessuto fogliare meno posto sotto stress elevato luce. I livelli di zeaxantina ne fanno una buona fonte di questo composto ad alto valore. Cliccate qui per vedere una grande versione di questa figura.

Figura 2. Cromatogramma MS e spettro di N. estratti di tessuto glauca. totale di ioni MS cromatogramma (TIC), della foglia e stelo estratti misurati mediante GC-MS viene presentata (70-600 m / z). Analisi GC-MS è stata eseguita come descritto in precedenza in ^15. Picchi rilevati sono stati annotati utilizzando la libreria di tag spettrali di massa. MS spettro di serina (2TMS) è mostrato come un esempio. MS cromatogramma: asse X e Y indicano tempo di ritenzione (min) e l'intensità (abbondanza) del segnale, spettro MS: asse X e Y indicano i rapporti M / Z e l'intensità (abbondanza) del segnale, rispettivamente. Clicca qui per ingrandireimmagine.

Figura 3. Bioanalizzatore misurazione di RNA preparato RNA seq di N. materiale fogliare glauca. Per ottenere RNA altamente puro necessario per RNA ss abbiamo estratto l'RNA utilizzando Trizol reagente e successivamente purificato l'RNA utilizzando le colonne del kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania). Abbiamo determinato la qualità dell'RNA utilizzando il Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Germania) visualizzato a sinistra. Un esempio di uscita Bioanalizzatore figura a destra. I due picchi principali del campione rappresentano 18 S e 25 S ribosomiale RNA. Il nostro campione ha mostrato un RNA numero di integrità (RIN) di 9.2, che è ben al di sopra del valore richiesto di 8. ? Clicca quiE per vedere l'immagine ingrandita.

Discussion

I protocolli qui presentati forniscono un quadro completo per analizzare le foglie degli alberi di tabacco per i metaboliti e trascrizioni. Si prevede che questi sforzi combinati dovrebbero fornire nuove intuizioni in processi sottostanti la sintesi ed estrusione di idrocarburi e di composti ad alto valore presenti in questo tessuto. Questi approcci dovrebbero quindi ci danno una migliore comprensione di come vengono sintetizzati i composti. Oltre agli aspetti albero tabacco del lavoro, è anche lo scopo di migliorare la biomassa di pioppo, specialmente rivolti lignificazione della struttura di parete secondaria, ma anche per esplorare se possiamo usare la corteccia per l'estrazione di composti preziosi.

I metodi presentati in questo documento sono lievi modifiche di metodi standardizzati di metabolita profiling. Questi metodi sono ovviamente limitate a profili metabolici conosciuti, ed è possibile che alcuni nuovi picchi metabolici possono essere ottenuti per which nessun composto è noto. Speriamo di mettere questi composti in un contesto di altri metaboliti combinando il comportamento dei metaboliti e trascrizioni nel corso delle serie temporali di sviluppo.

Nessuno dei metodi qui presentati sono notevolmente cambiato dai metodi tipicamente utilizzati per i materiali vegetali. L'aspetto interessante consiste nella combinazione di metodi per comprendere la struttura di base per la produzione di catena idrocarburica prevalentemente lungo e modifica delle foglie dell'albero di tabacco. Una delle fasi critiche per ottenere queste informazioni è la successiva combinazione dei diversi tipi di dati. Prevediamo che i dati da una prima valutazione saranno divisi in diversi gruppi in base al comportamento dei metaboliti / trascritti sullo sviluppo e che tali dati saranno utilizzati per inferire trascrizione vs comportamenti metaboliti, e anche per assegnare potenzialmente alcuni metaboliti a percorsi . Inoltre, le analisi basate sulla rete più elaborati vengono quindi immaginato to sfruttare le relazioni causali.

I protocolli analitici qui presentati fornirà anche una base per campo-prove e lo sfruttamento industriale della biomassa. Per fare questo, il consorzio MultiBioPro contiene diversi partner industriali che hanno la capacità di esplorare ulteriormente la biomassa, con l'obiettivo di fornire biodiesel, bioetanolo e altri composti ad alto valore. Questi tipi di sfruttamento della biomassa saranno valutate sulla base; (1) testare la robustezza e la qualità dei prodotti biologici ottenuti (tipici i test standard di settore saranno effettuate per garantire che i prodotti generati hanno un buon valore di mercato), (2), verrà effettuata una valutazione economica, sociale e ambientale delle tecnologie utilizzando fonti bibliografiche, interviste e materiale che viene generato durante le prove sul campo e le valutazioni bioraffineria impianti pilota. Queste attività comprendono costi-benefici e analisi del ciclo di vita, la generazione di un fascicolo ambientale e di mercato e businestrategie ss. Noi crediamo che questo gasdotto diverrà una miscela utile del mondo accademico, della scienza e dello sfruttamento industriale applicata ad un ulteriore albero di pioppo da biomassa e tabacco per i prodotti finali di consumo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424