Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

Summary

La biomasa vegetal ofrece un recurso renovable para varios productos, incluido el combustible, piensos, alimentos y una variedad de materiales. En este trabajo investigamos las propiedades del árbol del tabaco (Nicotiana glauca) y el álamo como fuentes adecuadas para un gasoducto de biorrefinería.

Abstract

La demanda mundial de alimentos, los piensos, la energía y el agua presenta desafíos extraordinarios para las generaciones futuras. Es evidente que las plataformas robustas para la exploración de los recursos renovables son necesarias para superar estos desafíos. En el marco multinacional MultiBioPro estamos desarrollando tuberías de biorrefinería para maximizar el uso de la biomasa vegetal. Más concretamente, se utiliza el álamo y tabaco arbóreo (Nicotiana glauca) como especie de cultivo de destino para mejorar la sacarificación, isoprenoides, los contenidos de hidrocarburos de cadena larga, la calidad de la fibra, y suberina y lignina contenido. Los métodos utilizados para la obtención de estos resultados incluyen GC-MS, LC-MS y plataformas de secuenciación de ARN. Las tuberías de metabolitos son herramientas bien establecidas para generar este tipo de datos, sino que también tienen las limitaciones de dicha metabolitos sólo bien caracterizados se pueden utilizar. La secuenciación profunda nos permitirá incluimos todas las transcripciones presentes durante las etapas de desarrollo de la hoja del árbol del tabaco, pero hcomo para ser asignada de nuevo a la secuencia de Nicotiana tabacum. Con estos montajes, nuestro objetivo es una comprensión básica de los procesos subyacentes y al establecimiento de un marco industrial para explotar los resultados. En una perspectiva de más largo plazo, creemos que los datos generados aquí proveerán medios para que un proceso de biorrefinería sostenible utilizando álamo y el tabaco como materia prima. Hasta la fecha, el nivel basal de metabolitos en las muestras se han analizado y los protocolos utilizados se proporcionan en este artículo.

Introduction

Población y crecimiento económico han provocado una creciente demanda de alimentos, agua y combustibles. Gran parte de estos suministros se producen, elaboran y transportan el uso de medios basados ​​en combustibles fósiles finitos, como el petróleo. Es, sin embargo, es evidente que esta práctica no es sostenible, y por lo tanto el desarrollo de recursos alternativos, será de gran importancia ^1. Muchos de los recursos renovables son, en distintos grados, que está siendo explotado, como el viento, el movimiento del agua, solar, geotérmica, y agitan las fuentes de energía basadas. Otro recurso sostenible y en gran parte sin explotar es la biomasa de las plantas. Este recurso también ofrece una forma muy rentable para convertir la energía solar en combustibles derivados ^2. Además de proporcionar combustible a base de bio, la biomasa de la planta también ofrece oportunidades únicas para los productos alternativos, incluyendo plásticos, detergentes y productos químicos valiosos.

La pared celular vegetal, que en gran parte se compone de polímeros a base de azúcar, makES hasta el grueso principal de la biomasa de la planta y un gran esfuerzo en la actualidad se está invirtiendo en su conversión eficiente en bioetanol. La biomasa restante podrá posteriormente ser procesados ​​en biogás y productos relacionados con el petróleo ^3. Gran parte de las especies de plantas perennes, incluyendo hierbas y los árboles, que producen grandes cantidades de biomasa celulósica típicamente crecen mejor en las zonas templadas. Sin embargo, aproximadamente el 20% de la superficie de la tierra es semiárida, y por lo tanto también es propensa a las sequías ^4. Obviamente, sería de interés para también cultivar estas tierras áridas con plantas que puedan contribuir eficazmente a la producción sostenible de energía y materiales. Estas plantas necesitan tener un uso eficiente del agua óptima y resistencia a la sequía y que incluiría el árbol del tabaco (Nicotiana glauca) y especies del género Agave.

El consorcio MultiBioPro tiene como objetivo implementar un ducto de biorrefinería integrada, utilizando los dos importantes crespecies op, el álamo y el árbol del tabaco. Poplar ha convertido en un cultivo de biocombustible prometedor, ya que está creciendo rápidamente, fácilmente propagados por clones y altamente adaptable a un amplio rango de condiciones climáticas y de suelo. También ofrece una amplia gama de madera, fibra, leña y otros productos forestales ^5. El árbol del tabaco también se ha convertido en una planta adecuada para los propósitos de biocombustibles y de biorrefinería. Se produce típicamente cantidades sustanciales de biomasa, contiene altas cantidades de carbohidratos no estructurales ^6, y también tiene la capacidad rara para acumular grandes cantidades de aceites no alimentarios fácilmente extraíbles (incluyendo cadena larga C _{29-C 31} hidrocarburos saturados y triterpenoides) que son adecuados para el biodiesel producción. El árbol del tabaco es, además, susceptible de mejora genética, tiene una alta capacidad de germinación, y crece felizmente en suelos semiáridos no se utilizan para la producción de alimentos. Por lo tanto, parece que tanto el álamo y el árbol del tabaco tienen un potencial intrínseco para multíparacultivos ROPÓSITO, es decir, como nuevas materias primas de alto valor para una industria de base biológica integrativa. En este artículo nos centramos en conjunto diverso de enfoques para discernir cómo hidrocarburos de cadena depósitos árboles tabaco largas.

En un intento de identificar el mecanismo molecular subyacente responsable de la producción y secreción de los hidrocarburos saturados de cadena larga en las hojas de tabaco, aplicamos "ómicas" modernas tecnologías basadas. Esto incluye ARN siguientes de una serie de hojas de desarrollo (diez etapas), y el metabolito de perfiles multiplataforma aproxima utilizando LC-y GC-MS (para los metabolitos y lipidomics polares y no polares). Estos datos se usan para la extracción para la expresión génica que se correlaciona con, o precede, el inicio de la biosíntesis de las moléculas indicadas anteriormente. Los genes y las vías que parecen ser prometedores de estos esfuerzos serán utilizados para las pruebas funcionales en la especie Arabidopsis modelo y en última instancia podrían ser susceptibles para la ingeniería biotecnológica en tobárbol acco.

Protocol

1. Material vegetal

Cultiva plantas Nicotiana glauca en 30 macetas cm de diámetro que contienen M2 medio de crecimiento profesional. Cultiva plantas en invernadero, con una temperatura diurna de 20 a 25 ° C y la temperatura nocturna de 15 º C. Utilice una luz de 16 horas y el ciclo de oscuridad de 8 horas como régimen de luz complementaria.

2. Preparación de la muestra

1. Para metabolitos primarios:
   1. Materiales vegetales de la cosecha (hojas y tallos de N. glauca) y el material de congelación de inmediato.
   2. Liofilizar materiales vegetales congelados por liofilización durante tres días.
   3. Moler las muestras liofilizadas de molino mezclador con bolas de metal.
   4. Materiales secos Alícuota de tierra fina en un tubo de centrífuga de 2 ml o viales de vidrio.
2. Para metabolitos secundarios:
   1. Tejidos de la planta de cosecha y material liofilizado inmediatamente.
   2. Moler los tejidos vegetales congelados por mmolino ixer con la bola de acero inoxidable o de mortero.
   3. Alícuotas tejidos de tierra fina en tubo de centrífuga de 2 ml (aproximadamente 20 mg de peso húmedo).

3. Protocolo de extracción para el metabolito de perfiles de metabolitos primarios por GC-MS

1. Material de planta seca molida alícuota (10 mg de hoja y 20 mg de materiales madre) en 2 ml, tapón de rosca, tubos de fondo redondo.
2. Añadir 1400 l de metanol al 100% y agitar durante 10 segundos.
3. Añadir 60 l de Ribitol (0,2 mg / ml en H ₂ O) como una norma cuantitativa interior y agitar durante 10 segundos.
4. Añadir un acero inoxidable (o zirconia) pelota y homogeneizar el material con un molino mezclador durante 2 min a 25 Hz.
5. Centrifugar la mezcla durante 10 min a 11.000 x g.
6. Transferir el sobrenadante a un vial de vidrio.
7. Añadir 750 l de cloroformo.
8. Añadir 1500 l de H ₂ O y agitar la mezcla durante 10 segundos.
9. Transferir 150 l de lafase superior (fase polar) en un 1,5 ml tubo de centrífuga fresco.
10. Las muestras secas usando un Speed ​​Vac. Es imperativo que las muestras se redujeron a sequedad para entre 3 y 24 horas hasta que no líquido residual está presente.
11. Añadir 40 l de clorhidrato de metoxiamina (20 mg / ml en piridina).
12. Agitar la mezcla en una coctelera bloque de calor horizontal durante 2 horas a 37 ° C.
13. Añadir 70 l de N-metil-N - (trimetilsilil)-trifluoroacetamida mezcla MSTFA.
14. Agitar la mezcla durante 2 horas a 37 ° C.
15. Centrifugar las gotas en la tapa de una breve centrifugación ~ 1 min a 11.000 x g.
16. Trasvasar el líquido en viales de vidrio apropiados para el análisis de GC-MS.

4. Extractor de metabolito de perfiles de metabolitos secundarios por LC-MS

1. Añadir 500 l de metanol a las muestras de suelo helado.
2. Agitar con un termomezclador durante 15 min a 70 ° C (1.000 seg ^-1).
3. Centrifugar las muestras (5 millasN, 20.000 xg) y la fase líquida se transfirió a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
4. Liofilizar la fase líquida con un evaporador centrífugo (SpeedVac).
5. Añadir 100 l de ciclohexano y 100 l de agua milliQ al sedimento seco.
6. Agitar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente (uso de vórtice).
7. Centrifugar las muestras (5 min, 20.000 xg).
8. Transferir 80 l de la fase acuosa (fase inferior) a viales de inyección de LC-MS con fondo cónico para el análisis LC-MS.

5. Análisis de Datos

1. Configurar Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ o ⁸ XCMS y seleccionar el análisis de los datos a ser procesados.
2. Preparar una tabla de picos detectados de su interés, de acuerdo con la clase de compuesto de la Tabla 1.
3. Identificar los picos por la co-elución de compuestos estándar.
4. Anotar Posteriormente picos detectados mediante análisis MSN, algoritmos de caracterización estructural ^{de 9,10,} la literatura sENCUESTA y metabolito de búsqueda de base de datos ^11,12.

6. Extracción de Hidrocarburos ¹³

1. Sumerja N. recién cosechado hojas glauca (~ 200 mg) en un disolvente (metanol, etanol, cloroformo, hexano o éter de petróleo (punto de 40-60 ° C o 60-80 ° C de ebullición) (5 ml; grado HPLC) de 2 a 20 min.
2. Retire las hojas y secar completamente los disolventes por evaporación rotativa.
3. Volver a suspender las muestras en hexano (1 ml; grado HPLC).
4. Realizar análisis GC-MS mediante cromatografía de gases y con guión a un 5973MSD. Las condiciones de funcionamiento deben ser como sigue; gas portador, helio con un caudal de 0,9 ml min ^-1 / 11 psi. Inyectar muestras (1 mu l) con un inyector splitless a 280 ° C. Mantenga el horno de cromatografía de gases a 70 ° C durante 5 min antes de aumentar a 4 ° C / min hasta 320 ° C. Mantenga la temperatura final durante 10 minutos, lo que hace un tiempo total de 67,5 min. Configure la interfaz con el MS a 280 ° C y perform MS en el modo de barrido completo utilizando 70 eV EI + y escaneado de 10 a 800 D.
5. Inicialmente procesar los componentes del cromatograma por deconvolución MS automatizada y un sistema de identificación, y los que se identifican utilizando la biblioteca NIST MS 98.
6. Confirmar la identificación de hidrocarburos saturados de cadena larga alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontano, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane y tritriacontane) mediante la comparación de los tiempos de retención y patrones de fragmentación clásicos a patrones auténticos conocidos.
7. Determinar hidrocarburos cuantitativamente mediante la comparación de áreas de los picos integrados con las curvas de respuesta a la dosis (0,07 a 2,5 mg), construidos a partir de patrones auténticos.
8. Calcular medios y error estándar de las medias (SEM) utilizando el software Excel.

7. Análisis de isoprenoides ¹⁴

1. Lleve a cabo una homogeneización tal como se describe en la sección 2. Pesar 10 mg de congelación homogeneizada polvo seco en un tubo de centrífuga.
2. Añadir secuencialmente 250 ml de metanol sobre el polvo, se mezcla, a continuación, añadir 500 ml de cloroformo (grado reactivo de laboratorio), y se mezcla por agitación.
3. Deje las muestras en hielo en la oscuridad durante 20 min.
4. Añadir 250 ml de tampón Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) o agua (grado HPLC) a la suspensión y mezclar mediante agitación.
5. Centrifugar la mezcla a 12.000 rpm (13.523 xg) durante 5 minutos para separar el no polar a partir de fases acuosas. La fase de cloroformo no polar que contiene extractos de isoprenoides es en la parte inferior.
6. Transferir la fase a un nuevo tubo de centrífuga.
7. Añadir un adicional de 500 ml de cloroformo a la fase acuosa, y llevar a cabo una segunda extracción por vórtice y centrifugación como se describió anteriormente.
8. Combinar los extractos de cloroformo y llevar las muestras a sequedad en el evaporador y se almacenan a -20 ° C hasta su análisis.
9. Añadir 50 ml de acetato de etilo (grado HPLC) para el extracto de isoprenoides se secó para redisolver el material.
10. Inyectar 3 ml en una columna C18columna usando un módulo de separación ACQUITY UPLC. El gradiente utilizado para separar los pigmentos debe incluir; Un: metanol / H ₂ 0 (50:50) y B: acetonitrilo / acetato de etilo (75:25), y las condiciones iniciales debe ser un 30% (v / v) y B 70% (v / v) de ir a 100 % de B durante 6 min. Utilice una velocidad de flujo de 0,6 ml / min.
11. Vigilar que el efluente continuamente con un arsenal de fotos diodo detector (PDA) 250-600 nm.
12. Identificar los componentes de co-cromatografía y comparaciones espectrales entre patrones auténticos, beta caroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína y zeaxantina.
13. Realizar la cuantificación a partir de curvas de respuesta de dosis.
14. Confirmar compuestos utilizando LC-MS; utilizar condiciones cromatográficas similares. La detección debe hacerse utilizando APCI ionización en modo positivo con un instrumento de Q-TOF.
15. Hacer las modificaciones para la determinación de tocoferol con material seco 25 mg de congelación que se ha extraído y saponificación en 6% KOH a 50 ° C durante 1,5 h.

Este protocolo combina la extracción de RNA de Trizol con un kit RNeasy para obtener ARN de alta calidad.

1. Triturar 100 mg de material vegetal congelado en 2 ml tubos de centrífuga con una bola de metal por un molino mezclador.
2. Añadir 1 ml de Trizol.
3. Centrifugar el material durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
4. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.
5. Añadir 200 l de cloroformo, invertir el tubo varias veces, y se incuba 3 minutos a temperatura ambiente.
6. Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C.
7. Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 700 l) en un nuevo tubo de reacción.
8. Añadir aproximadamente 2,5 volúmenes de etanol (100%), invertir el tubo varias veces, y se incuba durante 30 min a -80 ° C.
9. Mueva la muestra incluyendo el posible precipitado la columna de centrifugación del kit.
10. Centrifugar la columna durante 15 segundos a 8000 xg, y deseche la fbajo a través.
11. Añadir 700 l de tampón RW1 a la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo a través.
12. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar la columna durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo a través.
13. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar durante 2 min a 8.000 x g.
14. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml y añadir 50 l de agua libre de RNasa.
15. Centrifugar la columna durante 1 min a 8000 xg para eluir el ARN.
16. Retire ADN residual utilizando un Kit-ADN libre Ambion según las instrucciones del fabricante.
17. Determinar la calidad de la ARN. El ARN debe tener números de la integridad del ARN (RIN) por encima de 8.
18. Envíe de ARN para la secuenciación de próxima generación.

Representative Results

El perfil de HPLC en la Figura 1 muestra un resultado representativo del análisis de isoprenoides de N. extractos de hojas glauca. Los diferentes isoprenoides de C40 y superiores fueron detectados utilizando un arsenal de fotos diodo detector (PDA). Los picos fueron anotados sobre la base de una co-cromatografía y la comparación espectral entre patrones auténticos, beta caroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína y zeaxantina. Los dos cromatogramas de EM en la figura 2 muestran el resultado del análisis metabolito primario de N. glauca hoja y tallo de materiales, respectivamente. El espectro de MS de un pico correspondiente a serina (indicada por una flecha) también se da como un ejemplo. Figura 3 muestra el Bioanalyzer utiliza para determinar la calidad del ARN y una salida representativa del dispositivo. Los dos picos principales en el cromatograma correspondiente a 18 S y 25 S ribosomal ARN, lo que indica ARN intacto en la muestra. Picos adicionales de costilla fragmentadaosomal ARN aparecería en caso de ARN parcialmente o muy degradadas.

Figura 1. Perfil de HPLC que muestra isoprenoides presentes en extractos de hojas de N. glauca. La mayoría de los isoprenoides de C40 y anteriormente no son susceptibles de análisis de GC-MS. Por ello, utilizó separaciones por HPLC con detección de red de fotodiodos. Se muestra un cromatograma típico registrada a 450 nm. Los pigmentos carotenoides son típicos de los tejidos fotosintéticos en las que predomina la luteína. También está presente la zeaxantina, que rara vez se encuentra en el tejido de la hoja a menos que se sometió a alto estrés lumínico. Los niveles de zeaxantina convierten en una buena fuente de este compuesto de alto valor. Por favor, haga clic aquí para ver una v más grandeersión de esta figura.

Figura 2. MS cromatograma y espectro de N. extractos de tejido glauca. total de iones MS cromatograma (TIC) de la hoja y extractos medida por GC-MS del tallo se presenta (70-600 m / z). Se realizó un análisis GC-MS como se describe anteriormente en ^15. Picos detectados fueron anotados mediante la biblioteca de etiquetas de espectro de masas. MS espectro de serina (2TMS) se muestra como un ejemplo. MS cromatograma: eje X y el eje Y indica el tiempo de retención (min) y la intensidad (abundancia) de la señal, el espectro MS: eje X y el eje Y indican las proporciones M / Z y la intensidad (abundancia) de la señal, respectivamente. Haga clic aquí para ver más grandeimagen.

Figura 3. Medición Bioanalyzer de ARN preparado para el ARN siguientes de N. material de la hoja glauca. Para obtener ARN de alta pureza necesaria para el ARN siguientes se extrajeron los ARN usando reactivo Trizol y posteriormente purificado el ARN usando las columnas de la RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Se determinó la calidad del ARN usando el Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) que se muestra a la izquierda. Un ejemplo de una salida de Bioanalyzer se da a la derecha. Los dos picos principales de la muestra representan 18 S y 25 S ribosomal RNA. Nuestra muestra mostró un número integridad del ARN (RIN) de 9.2, que es muy superior al valor requerido de 8. Haz click aquícorreo para ver la imagen más grande.

Discussion

Los protocolos presentados aquí proporcionan un marco general para analizar las hojas del árbol del tabaco para los metabolitos y transcripciones. Se prevé que estos esfuerzos combinados nos debe proveer de nuevos conocimientos sobre los procesos que subyacen a la síntesis y extrusión de los hidrocarburos y los compuestos de alto valor presentes en este tejido. Estos enfoques, por tanto, deben darnos una mejor comprensión de cómo se sintetizan los compuestos. Además de los aspectos de los árboles de tabaco de la obra, sino que también está dirigido a mejorar la biomasa de chopo, dirigidas especialmente a la lignificación de la estructura de la pared secundaria, sino también para estudiar si se puede utilizar la corteza para la extracción de compuestos valiosos.

Los métodos presentados en este documento son ligeras modificaciones de métodos normalizados para el metabolito de perfiles. Estos métodos son, por supuesto limitan a perfiles metabólicos conocidos, y es posible que varios nuevos picos metabólicos se pueden obtener para which ningún compuesto es conocido. Esperamos poner estos compuestos en el contexto de otros metabolitos mediante la combinación de la conducta de los metabolitos y transcripciones sobre la serie de tiempo de desarrollo.

Ninguno de los métodos presentados aquí se cambian de manera significativa a partir de los métodos normalmente utilizados para materias vegetales. El aspecto interesante reside en la combinación de métodos para entender el marco subyacente para la producción de hidrocarburos principalmente de larga cadena y modificación en las hojas de los árboles de tabaco. Uno de los pasos fundamentales para la obtención de esta información es la posterior combinación de los diferentes tipos de datos. Tenemos la visión de que los datos como una primera evaluación se dividen en diferentes grupos en función del comportamiento de los metabolitos / transcripciones sobre el desarrollo y que estos datos serán utilizados para inferir transcripción vs comportamientos de metabolitos, y también para asignar potencialmente ciertos metabolitos a las vías . Además, los análisis basados ​​en redes más elaboradas son luego imaginaron to explotar las relaciones causales.

Los protocolos analíticos presentados aquí también proporcionarán una base para pruebas de campo y la explotación industrial de la biomasa. Para lograr esto, el consorcio MultiBioPro contiene varios socios industriales que tienen las habilidades para explorar aún más la biomasa, con el objetivo de ofrecer el biodiesel, el bioetanol y otros compuestos de alto valor. Este tipo de explotación de la biomasa se evaluarán en base a; (1) probar la robustez y la calidad de los productos biológicos producidos (pruebas estándar de la industria típicos se llevarán a cabo para garantizar que los productos generados tienen buen valor de mercado), (2), se llevará a cabo una evaluación económica, social y medioambiental de las tecnologías utilizando fuentes bibliográficas, entrevistas y material que se genera durante las pruebas de campo y evaluaciones de biorrefinería de planta piloto. Estas actividades incluirán costo-beneficio y el análisis del ciclo de vida, la generación de un expediente del medio ambiente y el mercado y los negociosestrategias ss. Creemos que esta tubería se convertirá en una mezcla útil de la academia, la ciencia y la explotación industrial aplicada a una mayor biomasa de los árboles de álamo y el tabaco para productos finales de consumo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424