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Neuroscience

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Published: July 2, 2014 doi: 10.3791/51394

Summary

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

Abstract

형광 검출 현대 생물학 및 의료 애플리케이션에서 사용 많은 널리 활용하고 신속하게 진행 현미경 기술에 대한 기반을 제공합니다. 형광의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상과의 호환성이 (가) 있습니다. 불행하게도, 형광 현미경의 전통적인 형태 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 영상 평면에서 하나의 주요 약점, 회절 제한 해상도에서 고통. 최근, 이러한 제한은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM)와 같은 초 고해상도 형광 현미경 기술의 도입으로 극복하고있다. 는 기존의 대응과는 달리, PALM은 수십 나노 미터의 측면 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다. 그것은 세포의 구조 및 조직의 이전에 액세스 할 수없는 속성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다.

_content "> 불행히도, PALM 구현하기 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다.이 문서에서는, 우리는 고정 된 배양 된 신경 세포의 기공을 갖는 구조의 단일 색상 PALM 연구를 구현하는 방법을 보여줍니다. PALM은 이상적으로 50 ~ 250 nm의 ~에서. 우리의 접근의 주요 단계를 포함 일반적으로 범위 치수가 소포의 연구에 적합와 간헐적 샘플링 RAW 이미지를 수집, photoconvertible (빨강 녹색) 소포화물의 키메라와 신경 세포를 라벨 수퍼 - 해상도 현미경 시스템, 고해상도 PALM 화상을 생성하는 것의 이미지를 처리​​. 또한 반박되는 배양 된 해마 뉴런 고밀도 코어 소포 매우 잘 해결 이미지 (DCVs)을 제시하여 우리의 접근 방법의 효능을 입증 DCVs의 extrasynaptic 매매는 DCV 클러스터에 의해 주로 매개되는 가설.

Introduction

세포 프로세스의 숫자는 특정 세포 내 목적지로 생체 분자의 정확하고 효율적인 소포 - 중재 인신 매매에 따라 달라집니다. 한 가지 눈에 띄는 예는 잠재적으로 말초 사전 및 시냅스 사이트 1에 신경 소마의 생합성의 사이트에서 시냅스 성분의 긴 원거리, 소포 - 중재 배달로 시작되는 시냅스 어셈블리입니다.

형광 현미경 소포 인신 매매를 공부 강력하고 인기있는 방법입니다. 기술의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상 2와 호환이 (가) 있습니다. 불행하게도, 비교적 최근까지,이 기술은 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 한 가지 큰 약점, 회절 제한 해결 방법 2, 고통했다. 최근, 형광 현미경의 측 방향 해상도 초해 형광 미시간의 도입으로 회절 장벽을 능가같은 PALM 3과 croscopy 기술. PALM의 측면 해상도는, 수십 나노 미터는 적으로 일반적으로 50 ~ 250 nm의 4 ~ 범위 치수가 소포의 연구에 적합합니다. 그것은 특정 세포 내 사이트에 자신의 인신 매매의 몇 가지 측면을 포함하여 소포의 이전에 액세스 할 수없는 특성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다.

PALM 구현하기가 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다. 여기에서 우리는 기공을 갖는 구조의 PALM 연구를 구현하는 방법을 설명하고, 우리는 해마 신경 세포에있는 DCVs의 경우에 대한 우리의 접근 방식의 효과를 보여줍니다. 특히, 우리는 해마 신경 세포의 시냅스에 가설에게 DCVs의 인신 매매를 해결하기 위해 PALM를 사용은 DCV 클러스터 5-8에 의해 매개된다.

N 개발에 시냅스 소포의 클러스터 매개 매매그것은 빠른 시냅스 안정화 및 조립 9,10을 용이하게 할 수 있기 때문에 eurons는 흥미로운 가능성이다. DCVs의 클러스터 인신 매매의 지지자들은 클러스터링 6을 지원하는 증거로 외인 DCV화물을 품고 extrasynaptic 형광 puncta에의 큰 외관상의 크기를 인용. 그러나 이러한 puncta에 클러스터링에서 발생하는 것과 회절에서 발생하는 구별 크기 효과에 적합하지 않습니다 회절 제한 형광 현미경 기술을 사용하여 생성 된 이미지에 나타납니다.

이 문제를 해결하기 위해, 우리는 기존의 위드 형광 및 DCVs을 대상으로 키메라를 표현하는 해마 신경 세포의 PALM 이미지를 수집. 이러한 이미지의 분석은 기존의 이미지에서 추정 extrasynaptic DCV 클러스터의> 92 %, 80 nm의 PALM 이미지에서 (개인 DCV 크기) 11 puncta에로 해결되는 것으로 나타났다. hippoca 개발 DCVs에 적용 따라서, 이들 데이터는 큰폭 클러스터링 가설 무효화mpal 신경.

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Protocol

1. 샘플 준비

  1. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, DCVs을 대상으로 photoconvertible 또는 광활성 키메라를 코딩하는 DNA를 준비합니다.
    참고 : 하나의 가능성은 DNA의 인코딩 조직 플라스 미노 겐 활성제-Dendra2 키메라 (TPA-Dendra2). Dendra2은 녹색에서 자외선 (12)에 노출시 적색 발광으로 전환 photoconvertible 단백질이다.
  2. 고성능 # 1.5 커버의 문화 해마의 신경 세포는 표준 프로토콜 13 다음 ~ 5-10 일 동안 미끄러.
  3. 양이온 성 지질 시약을 사용하여 해마의 신경 세포를 개발하는 형질.
    참고 : 바이러스 성 매개 감염이 성숙한 신경 세포에 대한 더 효과적입니다. 이러한 대안은 다른 곳에서 14 상세히 설명되었다.
    1. ~ DNA 1 μg 최소 필수 배지 (MEM)와 양이온 성 지질 시약 4 μL, 250 μl를 함유하는 제 1.5 ㎖의 튜브 250 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브를 준비MEM의.
    2. 5 분 솔루션을 품어.
    3. 두 용액을 결합하고 추가로 30 분 동안 생성 된 혼합물을 배양한다.
    4. 배양시 배양 배지의 여러 ML을 포함하는 요리는 37 ℃로 가온 준비
    5. 부드럽게 따뜻한 매체를 포함하는 요리에 신경을 포함하는 커버 전표를 전송하고 형질 전환 혼합물을 추가합니다.
    6. 부드럽게 요리를 기울 후 90 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치합니다.
    7. 그들의 "가정 요리"에 신경을 반환하고 ~ ~ 18 시간을 기다립니다.
  4. 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 45 분 동안 세포를 수정 (PBS, pH를 7.4) 37 ℃로 가온
    참고 : PALM 실험에서, 미세 구조의 양호한 보존을 달성하기 위해 중요하고, 면역 형광 염색법에 사용되는 표준 포름 알데히드 고정 프로토콜은 일반적으로 15 충분하지 않다. 가난한 구조 보존을위한 하나의 중요한 이유는 충분 F입니다포름 알데히드는 고정 부가 형성 및 단백질 가교 결합을 포함하고, 후자의 공정은 16 꽤 느리다 ixation 시간 때문이다. 45 분 고정 형광 감지 할 수없는 overfixation에 의한 손실이 문제를 완화하는 데 도움이됩니다.
  5. 워시 커버 필터링 PBS와 함께 ~ 10 배를 미끄러 져.
    참고 :이 형광 오염 물질을 줄일 수 있습니다. 이미지 샘플 상대적으로 신속하게 고정 후. 빛 단단한 용기에 여과 PBS에서 4 ° C에서 임시 저장 세포.
  6. 필터링 PBS에서 챔버의 뉴런을 포함하는 마운트 커버 전표.
    주의 : 샘플이 유리보다 낮은 굴절률을 가진 PBS와 같은 수성 매질, 장착되어야 전반사 형광 (TIRF) 기반의 조명을 구현할. 전용 커버 슬립 - 근위 형광 흥분 때문에 TIRF 기반의 조명은 매우 유용하고, 배경 형광 17에 큰 관련 드롭이있다.

2. 이미지 수집 </ P>

  1. 슈퍼 해상도 이미징 시스템을 켭니다.
    1. 아크 램프를 켭니다.
    2. 에 (전원 원격 스위치) "시스템 / PC"와 "구성 요소"스위치 뒤집기 "에 있습니다."
    3. 컴퓨터 (현미경 제어 태블릿 / 도킹 스테이션 이후에 제공)을 켭니다.
      주 : 도킹 스테이션은 광학 및 광로의 많은 특성, 목적 및 포커스의 특히 선택을 제어하고 감시하는데 사용될 수있다.
    4. 두 소프트웨어 아이콘을 클릭하고 로그인 대화 상자에서 "시작 시스템"옵션을 선택합니다.
  2. 샘플을 검사합니다.
    1. 레이저 안전 캐비닛의 전면 및 상단 액세스 패널을 엽니 다.
    2. 무대와 목표에 액세스 할 수 투과광 팔을 기울이십시오.
    3. 알파 계획 - 고차 색지움 100X 개구에 기름을 넣어 / NA는 1.46 (TIRF) 목적 =.
      참고 : 63X 높은 NA 목적은 100X 대신에 사용될 수있다.
    4. 무대에 샘플을 장착하고, 일을 높이고샘플을 향해 전자의 목표.
    5. 도킹 스테이션의 XYZ 함수를 사용하여 렌즈 위치를 모니터한다. 렌즈의 초점이 야구장 (예를 들어, Z ~ 2.50 mm)에있을 때 중지합니다.
    6. 완전히 액세스 패널을 닫습니다.
      참고 : 레이저 안전을 참여.
    7. 미세 조정 위치 탭의 접안 및 버튼을 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
      참고 : 위치 탭 아크 램프 기반의 조명을 생산하고 접안하여 샘플의 직접 관찰을 용이하게 버튼에 대한 액세스를 제공합니다. 마찬가지로, 인수 탭 레이저 기반의 조명을 생산하고 카메라가 이미지 캡처를 용이하게 도구에 대한 액세스를 제공합니다.
      1. 선택 위치 탭으로 이동하여 "트랜스에 있습니다."
      2. 안구 확장 기호를 클릭합니다.
        참고 :이 빛의 경로를 개략적으로 나타납니다. 빛의 경로 속성은 왼쪽 회로도에 해당 아이콘을 클릭하거나 도킹 스테이션에 터치 스크린을 사용하여 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 필터Dendra2에서 방출을보기위한 적절한 반사기 리볼버 아이콘을 사용하여 선택할 수 있습니다.
      3. 접안 렌즈로보고, 가이드로 도킹 스테이션을 사용하여 초점으로 세포를 가져옵니다.
        참고 : 해마 신경 세포가 형질하기 어려운, 그리고 따라서 반사 조명을 사용하여 초점을 좀 까다로운 일이 될 수 있기 때문에 샘플이 매우 띄엄 띄엄 형광 세포로 채워집니다. 이 경우, 가이드로서 송신 조명 및 도킹 스테이션의 Z 판독을 사용한다.
      4. 집중 후 "Off"로 빛을 전환합니다.
  3. 상당히 밝은 반점이 형광을 전시하고, 건강을 나타내는 고전적인 형태를 가지고있는 세포를 식별합니다.
    1. 반사 된 빛과 Dendra2에서 녹색 방출을보기위한 필터의 적절한 선택.
    2. 낮은 강도의 여기 광을 사용하여 Dendra2의 키메라를 발현하는 세포의 커버 슬립을 검색합니다.
  4. ACQ로 전환uisition 탭을 클릭합니다.
    1. 적절하게 설계되거나 쉽게 수정 PALM 수집 구성을로드하기 위해 "실험 관리자"를 사용합니다.
      참고 : 레이저 파워 슬라이더 : 그런 실험이 존재하지 않는 경우, 지침으로 다음 설정을 사용하여 시작하는 실험 설계 구성 (405) 뉴 멕시코 (~ 50 mW의 레이저 0.01 %); 488 nm의 (~ 100 mW의 레이저 3 %); 561 nm의 (~ 100 mW의 레이저 40 %) 노출 시간 : ~ 50 밀리 초; 카메라 게인 ~ 200; 다차원 취득 : 시계열 (사이클 = 30,000, 구간 = 0); 트랙 : 에피 조명 488 nm의 및 TIRF 기반 조명 (단계 2.5.1 참조) 561 nm의; 목적 : 100X (NA가 1.46 =); TIRF 각도 슬라이더 : 입사각 ~ 67-72 °; 픽셀의 크기 : 100 nm의; 시야 : TIRF (대안 선택이 더 높은 레이저 강도를 산출하고 표백하기가 더 어렵습니다 형광체에 사용됩니다).
    2. 팝업 메뉴가 레이저에 전환에 대한 쿼리와 함께 표시 할 때 "예"를 클릭합니다.
  5. 이미지를 가져와카메라 평면에 초점 세포의.
    1. 488 nm의 에피 조명 레이저 트랙을 선택합니다.
      참고 : 트랙 이미징 동안 사용되는 빔 구성되어 있습니다. 여기서, 트랙 이름은 카메라로 전달되는 발광을 생성 여기 파장에 의해 결정된다. 예를 들어, 561 nm의 트랙은 405과 561 나노 레이저 라인을 모두 사용하지만 필터 큐브는 카메라 (561) nm의 광에 의해 여기 photoconverted Dendra2으로부터 만 발광을 통과한다.
    2. "연속적인"수집 버튼을 사용하여 카메라에 셀의 초점을 맞춘다.
  6. 기존 위드 이미지를 수집합니다.
    1. "스냅"버튼을 사용합니다.
    2. '파일'메뉴로 이동을 선택하여 이미지를 저장합니다 "다른 이름으로 저장 / 저장합니다."
  7. TIRF 기반의 조명을 설정합니다.
    1. 488 트랙을 선택하고 EPI / TIRF 버튼을 사용하여 "TIRF"로 전환합니다.
    2. "연속"인수를 선택합니다.
    3. T를 조정그는 TIRF 기반 조명 슬라이더.
      참고 :이 배경 갑자기 어두워이며 표본은 한 평면 (18)에 집중 될 때 TIRF는 달성된다. 새로운 기능이 샘플들로 포커싱을 통해 명백해질 경우 TIRF에서 초점이 하나의 평면이 있기 때문에, 입사 각도가 너무 낮다.
    4. 이중 405 nm의 레이저로 561 트랙을 사용하여 TIRF 각도를 체크 "해제."
    5. PALM 실험을 시작하기 전에 "의"다시 405 nm의 레이저를 켭니다.
  8. PALM 데이터를 수집합니다.
    1. "실험을 시작합니다."HIT
      참고 : 원하는 경우, "온라인 처리 옵션"탭을 열고 원시 데이터를 수집하는 동안 복원 PALM 이미지를 모니터링하는 (실험을 시작하기 전에) "온라인 처리 PALM"과 "적당한 Gauss2D"를 확인합니다. 이것은 데이터의 품질과 상대적으로 시간 소모적 인 데이터 수집 프로세스를 계속하는 따라서 값의 평가를 용이하게 할 것이다.
    2. 시각광 변환을 모니터링 할 수 있습니다.
    3. 405 nm의 (photoconverting) 레이저의 강도를 증가하면 Dendra2의 광 변환이 줄어든다 (일반적으로 ~ 10,000 RAW 이미지의 취득 후).
    4. 광 변환이 증가하면 실험을 계속합니다. 그렇지 않으면, "중지"현재 단계 버튼을 눌렀을 때 (데이터의 손실없이) 실험을 중지합니다.
    5. 데이터 수집 (~ 15 분 후) 완료되면 이미지를 저장합니다.

3. 이미지 프로세싱, 디스플레이 및 분석

  1. 디스크에 저장된 온라인 처리, 처리로 이미지의 부재.
    1. , 처리 탭을 클릭하는 방법 탭을 열고 선택 "PALM을."
    2. 네 개의 하위 옵션에서 다시 "PALM"를 선택합니다.
    3. 열려있는 파일 메뉴로 이동하여 그 파일을보고, 히트 "를 선택합니다."
    4. 히트 "에 적용됩니다."
      참고 :이 기본 OPTI와 피크 / 형광 찾는 피크 지역화를 시작합니다기능. 필요한 경우, 피크는 "PAL-그룹"탭을 사용하여 그룹화 할 수 있습니다. 그룹화는 최대 좌표가 충분히 유사한 경​​우 하나의 분자에 여러 개의 연속 프레임에 나타나는 피크를 할당합니다. 또, 데이터는 소프트웨어의 모델 - 기반 드리프트 정렬 옵션을 사용하여 샘​​플 드리프트 보정 될 수있다.
  2. 피크 지역화 된 데이터에 제대로 지역화 저조한 샘플 구성 요소를 필터링합니다.
    1. 현지화 정밀도와 형광 물질을 폐기, σ> "PAL-필터"도구를 사용하여 35 nm의.
    2. 봉우리, D 사이의 평균 거리, 직경, D.의 소포를 해결하기에 너무 큰 영역에서 형광을 폐기
      1. 현지화 정밀 히스토그램에서, σ, 평균 현지화 정도의 ​​압축을 풉니 다.
      2. σ에 기초하여 D를위한 최대 허용 값 및 섀넌 - 나이 퀴 스트 criteron 19을 계산 해상도 근사값 20 R에서 구체화 = D =[(2.35σ) 2 + (2D) 2] 1 / 2.
      3. 반경 D / 2의 원 안에 / (4D 2) πD 2 미만으로 둘러싸인 봉우리를 삭제하려면 "PALM의 이상 값을 제거"도구 이웃 임계 값을 설정합니다.
    3. "PAL-렌더링"도구를 사용하여 PALM 이미지로 처리 PALM 데이터를 변환; 그림 1을 참조하십시오.
    4. "프로필"기능을 선택하여 크기와 간격을 정량화.
      1. 관련 라인과 테이블 옵션을 확인하고 이미지에서 원하는 방향을 따라 선을 그립니다.
      2. 반 최대 강도로 전체 폭을 결정하여 직경을 정량화.
      3. 강도 프로파일의 피크 - 투 - 피크 간격을 측정하여 간격을 정량화.

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Representative Results

도 1은 이미징 처리 한 최종 제품을 나타낸다. 본 PALM 콘텐츠에서 지역화 형광체의 가로 좌표를 중심 디스플레이 모드를 사용하여 도시하고, 연관된 DCV의 수퍼 - 해상도 화상을 가우시안 디스플레이 모드를 사용하여 도시된다.

그림 2A는 유사한 위드와 TPA-Dendra2을 표현 체외 해마 신경 세포에있는 여덟 일 소마와 인접 프로세스의 PALM의 이미지를 보여줍니다. 이미지의 중요한 기능은 종래와 PALM 이미지에서 puncta에 사이 (1) 유용한, 일대일 대응하고, 오버랩을 포함, PALM의 puncta에 (2) 상당히 작은 크기, 및 (3) 임시 해상도 여러 PALM의 puncta에에 단일 위드의 눈물 점.

그림 2B는 TPA-Dendra2을 표현하는 두 번째 해마 신경 세포의 과정의 일부를 따라 DCVs의 PALM의 이미지를 보여줍니다. 중요이 이미지의 특징은 (1) 작은 직경 및 균일 한 외관, puncta에, 그리고 밀접하게 나란히 놓여 puncta에 / 추정 DCV 클러스터 (2) 자주 관찰 있습니다.

도 3은 둘 이상의 DCVs 클러스터를 포함 할만큼 충분히 가까운 경우 결정 간단한 정량 방법을 설명; 클러스터링은 유행하는 시스템에서, 분포 함수에 기초하여보다 정교한 방법은, 21 정량화를 위해 사용될 수있다. 간단한 방법은 DCV 분리 및 DCV 폭을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다 (그래프 참조) puncta에 강도의 라인 프로파일을 생성을 기반으로합니다. 분리가 크게 (범례에 설명 된대로) 폭을 초과하는 경우 분리 약 폭과 동일한 경우, DCVs 접촉 할 수있는 반면, DCVs은 "접촉"을하지 않습니다. 이 기준에 따라 패널의 DCVs은 "하지 접촉"으로 분류 된 패널 B에있는 사람들은 사기꾼과 같이 분류 된 반면, 전술. 이 방법을 사용하여, 우리는 해마 신경 세포의 개발에 extrasynaptic DCVs의 접촉 관련 클러스터링 ~ 8 %의 상한을 뒀다. 우리 DCV 크기 및 클러스터 데이터는 표 1에 요약되어있다.

그림 1
그림 1. DCV (빨강)의 가우스 렌더링 PALM 이미지의 오버레이 및 DCV에 포함 된 개별 photoconverted 형광 (흰색 점)의 좌표를 표시하는 중심 디스플레이 모드 PALM 이미지. 전 모드와 가우스 함수에 렌더링 형광 표시 현지화 정밀도에 의해 결정 폭, 자신의 것 (x, y)에 지역화 된 점으로 후자를 표시 형광 / 피크​​ 위치. 바 = 0.1 μm의.T는 = "_blank"> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 중첩 합산 위드 (녹색) 및 TPA-Dendra2을 표현하는 개발 해마 신경 세포의 세포체와 인접 프로세스의 PALM (빨강)의 이미지 (A)는. 겹치는 영역은 옐로우 / 오렌지 나타납니다. TPA-Dendra2을 표현하는 다른 셀의 프로세스의 하위 영역을 안감 DCVs의 PALM 이미지 (B). 바 = 5, 2 μm의는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 오버레이 ( 관련 PALM 영상이 하나의 누점을 해결하는 반면 합산 위드 (녹색), PALM (빨강) TPA-Dendra2을 표현하는 개발 해마 신경 세포에있는 puncta에의 이미지의 A와 B). 두 패널에서 위드의 이미지, 하나의 큰 눈물 점을 보여줍니다 두 개의 매우 좁은 puncta에에. 그래프는 패널 (왼쪽 그래프)와 패널 B (오른쪽 그래프)에 puncta에 얻은 유사 색으로 구분 강도 프로파일을 보여줍니다. ; puncta에가 ~ 그들의 피크 - 투 - 피크 간격의 40 %의 절반 최대 강도로 전체 폭이 표시 패널의 PALM 이미지에서 파생 된 프로필 따라서,이 두 puncta에는 접촉하지 않는 및 추정 클러스터로 분류되지 않았다. 반대로, puncta에 본질적 그들의 피크 간 간격과 동일하다 절반 최대 강도로 전체 폭이 패널 B 쇼 PALM 콘텐츠에서 파생 정보는; 따라서, 이러한 추정 클러스터로 분류했다. 바 = 0.2 μm의./ 51394fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수 결과 분석 DCVs 수
클러스터 DCVs에 상한선 7.9 ± 5.9 % 618
DCV의 평균 직경 77 ± 21 nm의 (60)

표 1. DCV 크기 및 클러스터 데이터 종합.

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Discussion

PALM 및 관련 최고 해상도의 형광 현미경 기술은 최근 광학 현미경과 전자 현미경 (EM) 22 ~ 24의 잘 확립 된 형태의 귀중한 보완 등장했습니다. PALM의 긍정적 인 특성은 비교적 간단한 샘플 준비 최소한의 샘플 섭동 (perturbation)이 (가) 있습니다. 원칙적으로, PALM는 살아있는 세포를 연구 할 수있다. 아마 PALM의 주요 음의 속성은 크게 살아있는 세포에 빠르게 동적 프로세스의 연구를 방해 시간이 소요되는 데이터 수집이다. 또한, PALM은 비교적 새로운, 따라서 적절한 강력한 형광 및 샘플 준비를위한 데이터 수집 및 분석을위한 프로토콜은 완전히 개발 및 / 또는 3 문서화되어 있지 않습니다.

여기에서 우리는 고정, 배양 된 세포에있는 소포의 단일 색상, PALM 기반 연구에 적합 프로토콜을 설명했다. 프로토콜은 또한 유사의 개발을위한 좋은 출발점감독, 듀얼 컬러 PALM 연구. 우리의 프로토콜의 효능은 우리의 PALM 데이터의 두 가지 주요 특성을 지원합니다. 첫째, 우리의 재구성 PALM, 보완 위드, 이미지에 puncta에의 분포는 매우 유사합니다. 분포에서 하나의 큰 차이 - PALM으로 여러 puncta에에 회절 제한 puncta에 가끔 해상도 - PALM의 현저하게 향상된 해상도를 반영하고 또한 기술의 유효성과 실용성을 강조한다.

둘째, 우리의 PALM 결과는 관련 결과와 일관된 잘 일치, 및 / 또는. 예를 들어, EM을 사용하여 얻은 해마 신경 세포의 이미지는 종종 DCVs을 통해 조각을 공개하고, 조각에서 추론 DCV 직경은 70 ~ 100 나노 ~ 11입니다. 우리의 PALM 데이터와 EM 데이터 사이의 놀라운 계약은 두 가지 방법에 대해 안심한다. PALM은 아직 테스트되고 있으며, EM은 일반적으로 필요한 거친 시료 준비에 대한 우려에 따라 달라질 수 있습니다. 이와 유사하게,DCVs을 대상으로 녹색과 빨간색 키메라를 coexpressing 해마 신경 세포 생활의 회절 제한 영화 중첩 녹색과 빨간색 puncta에 영구 comovement 25을받을 것을 보여준다. 이 결과의 가장 간단한 해석 - 빨간색과 녹색 신호가 같은 DCV에서 발생이 - 회절 제한 puncta에 압도적으로 개별 DCVs을 나타낸다는 것을 보여줍니다 PALM와 일치한다. comovement의 적은 간단한 해석 - 빨간색과 녹색 신호가 클러스터 DCVs에서 발생은 - 크게 PALM에 의해 무효화됩니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 다른 긍정적 인 특성이 있습니다. (1) 소포가 photoconvertible 또는 광활성 형광으로 표시해야하며, (2) 고정 된 세포가 가장 수성 매체에 장착되어 특히, 샘플 준비는 상대적으로 간단하고 두 가지 주목할만한 예외를 제외하고, 기존의 형광 현미경이 적합와 매우 유사하다. 이 상대 simpliciTY는 실험이 짧고, 따라서 샘플 26 까다로울 수있는 (드리프트 보정을 용이하게하기 위해) 기점 비즈로 표지 할 필요가 없다는 사실을 반영한다. 또, 소체는 일반적으로 많은 형광 태그로된다; 따라서, 적절한 형광 라벨 밀도를 달성하는 것은 간단합니다. 대조적으로, 다른 구조에 대해서는,이 상당히 어려울 수있다. 이미지 수집은 비교적 간단합니다. 그러나, PALM은 PALM 신호가 본질적으로 매우 약하기 때문에 고가의 최첨단입니다 전자 및 광학 부품을 필요로하지 않습니다.

아마도 가장 정교한 처리, 분석 및 PALM 이미지의 디스플레이 주위 PALM 센터의 측면. 여기에 강조으로, PALM의 이러한 측면을 구현하는 해상도 및 현지화 정밀도 사이의 샘플링 해상도 사이의 관계, 그리고 차이 등 여러 가지 미묘한 문제에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 전체, PALM의tudies 변함없이 매우 복잡하지만, 이것은 상당한 될 가능성이 해상도 향상에 의해 균형됩니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은, (BAS에) 2 R15 GM061539-02을 부여 (JEL에) 2 R15 NS40425-03, MH 66179 (오레곤 보건 과학 대학 / OHSU 박사 게리 은행에)는 건강의 국립 연구소에 의해 지원하고, P30했다 NS061800 (OHSU의 박사 슈 아이 허에). 우리는 해마 신경 세포의 문화에 광범위한 지원을위한 바바라 Smoody 감사합니다, 박사 부부. 이 원고의 중요한 읽기 브라이언 긴 제임스 아브 네이.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss PALM Carl Zeiss, Inc. Elyra PS.1 With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Life Technologies 11668-019
Minimum Essential Medium Life Technologies 11095-080
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010049
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19208
Sucrose Sigma-Aldrich S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D Fisher Scientific NC0059095

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References

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Scalettar, B. A., Shaver, D., Kaech, S., Lochner, J. E. Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles. J. Vis. Exp. (89), e51394, doi:10.3791/51394 (2014).

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