Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Published: July 2, 2014 doi: 10.3791/51394
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2,4
1Department of Physics, Lewis & Clark College, 2Program in Biochemistry and Molecular Biology, Lewis & Clark College, 3Jungers Center for Neuroscience Research, Oregon Health & Science University, 4Department of Chemistry, Lewis & Clark College

Summary

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

Abstract

זיהוי של הקרינה מספק את הבסיס לשיטות מיקרוסקופיה רבות מנוצלים באופן נרחב ומתקדמות במהירות המועסקות ביישומים ביולוגיים ורפואיים מודרניים. עוצמות של הקרינה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות. למרבה הצער, צורות מקובלות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סובלות מחולשה, ברזולוציה אחת גדולה עקיפה מוגבלת במטוס ההדמיה, אשר פוגעת לימודים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, מגבלה זו כבר להתגבר עם ההקדמה של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM). שלא כמו עמיתיהם קונבנציונליים שלה, PALM יכול להפיק תמונות ברזולוציה רוחב של עשרות ננומטרים. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של מבנה וארגון תאיים.

_content "> לרוע המזל, PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאם לסוג המערכת תחת מחקר. במאמר זה, אנו מראים כיצד ליישם מחקרי PALM יחיד צבע של מבנים בועי בנוירונים קבועים, בתרבית. PALM הוא אידיאלי למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים, כי בדרך כלל נעים בין ~ 50-250 ננומטר. צעדי מפתח בגישה שלנו כוללים תיוג נוירונים עם photoconvertible (מירוק לאדום) מפלצות מטענים שלפוחית, איסוף תמונות גולמיות שנדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי להפיק תמונת PALM ברזולוציה גבוהה. אנחנו גם להדגים את היעילות של הגישה שלנו על ידי הצגת תמונות יוצאת דופן נפתרו היטב של שלפוחית ​​צפופות ליבות (DCVs) בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית, שלהפריך את ההשערה כי סחר extrasynaptic של DCVs מתווך בעיקר על ידי אשכולות DCV.

Introduction

מספר התהליכים התאיים תלוי בסחר בתיווך שלפוחית ​​מדויק ויעיל של ביומולקולות ליעדי subcellular ספציפיים. דוגמא בולטת אחת היא הרכבה הסינפטי, אשר קדמה משלוח נע ארוך, בתיווך שלפוחית ​​של מרכיבים הסינפטי מאתרים של קיום חיים בסומה העצבית לאתרים מראש וpostsynaptic פוטנציאל דיסטלי 1.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה חזקה והפופולרית של לימוד סחר בשלפוחית. נקודות חוזק של הטכניקה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות 2. למרבה הצער, עד יחסית לאחרונה, הטכניקה סבלה מחולשה אחת גדולה, ברזולוציה מוגבלת דיפרקציה 2, דבר המקשה מחקרים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, ברזולוציה רוחב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלתה המחסום העקיפה עם ההקדמה של מיל הקרינה רזולוציה סופרטכניקות croscopy, כגון PALM 3. ברזולוציה הרוחב של PALM, עשרות ננומטרים, היא אידיאלית למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים שבדרך כלל נעים בין 50-250 ננומטר ~ 4. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של שלפוחית, כוללים כמה היבטים של הסחר שלהם לאתרי subcellular ספציפיים.

PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאמים לסוג המערכת תחת מחקר. כאן אנו מתארים כיצד ליישם מחקרי PALM של מבני ועי, ואנחנו מדגימים את היעילות של הגישה שלנו למקרה של DCVs בנוירונים בהיפוקמפוס. בפרט, אנו משתמשים PALM להתייחס להשערה כי הסחר של DCVs לסינפסות בנוירונים בהיפוקמפוס מתווך על ידי אשכולות DCV 5-8.

סחר בתיווך Cluster של שלפוחית ​​לסינפסות בפיתוח neurons היא אפשרות מעניינת, כי זה עשוי להקל על ייצוב הסינפטי מהיר והרכבה 9,10. חסידי סחר באשכולות של DCVs לצטט את הגודל נראים הגדול של puncta ניאון extrasynaptic מחסה מטען DCV אקסוגני כראיות התומכות באשכולות 6. עם זאת, puncta אלה מופיעים בתמונות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות עקיפה מוגבל הקרינה מיקרוסקופית, שאינם מתאימות לגודל אפקטים ייחודיים הנובעים מעקיפה מאלה הנובעים מאשכולות.

כדי לפתור בעיה זו, אספנו הקרינה widefield קונבנציונלית ותמונות PALM של נוירונים בהיפוקמפוס להביע מפלצות ממוקדות לDCVs. ניתוח של התמונות הללו נחשף כי> 92% מאשכולות DCV extrasynaptic המשוערת בתמונות קונבנציונליות נפתרים כ80 ננומטר puncta 11 (פרט DCV בגודל) בתמונות PALM. לפיכך, נתונים אלה במידה רבה לפסול את השערת האשכולות כפי שהוחל על DCVs בפיתוח hippocaנוירונים mpal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

  1. הכן את ה-DNA מקודד הכימרה photoconvertible או photoactivatable הממוקד לDCVs, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות.
    הערה: אפשרות אחת היא קידוד DNA plasminogen activator רקמות-Dendra2 הכימרה (tPA-Dendra2). Dendra2 הוא חלבון photoconvertible שעובר מירוק לפליטה אדומה בחשיפה ל12 אור אולטרה סגול.
  2. נוירונים בהיפוקמפוס תרבות ב# כיסוי 1.5 ביצועים גבוהים מחליק ל~ 5-10 ימים, בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים 13.
  3. Transfect לפתח נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מגיב שומנים קטיוני.
    הערה: הזיהום בתיווך ויראלי הוא יעיל יותר לתאים בוגרים. גישה חלופית זו תוארה בפירוט במקומות אחרים 14.
    1. הכן את צינור 1.5 מיליליטר מכיל ~ 1 מיקרוגרם של ה-DNA ו250 μl של מדיום מינימאלי חיוני (MEM) וצינור 1.5 מיליליטר שני המכיל 4 μl של מגיב השומנים קטיוני ו250 μlשל ממ.
    2. דגירה הפתרונות למשך 5 דקות.
    3. לשלב בין שני פתרונות ודגירה את התערובת במשך 30 דקות נוספות וכתוצאה מכך.
    4. במהלך הדגירה, להכין את מנה המכילה כמה מיליליטר של מדיום התרבות חיממה 37 ° C.
    5. בעדינות להעביר את התלושים לכסות מכילים נוירונים לצלחת המכילה מדיום חם ומוסיף את תערובת transfection.
    6. הטה את הצלחת בעדינות ולאחר מכן למקם אותו בחממה ב37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
    7. לחזור לנוירונים "הצלחת הביתה" שלהם ולחכות ~ 12-18 שעה.
  4. תקן את תאי דקות 45 ב4% paraformaldehyde סוכרוז 4% / בופר פוספט (PBS, pH 7.4) חימם ל37 ° C.
    הערה: בניסויי PALM, חשוב להשיג שימור טוב של ultrastructure, ופרוטוקולי קיבעון פורמלדהיד סטנדרטיים המשמשים עבור מכתים immunofluorescence הם בדרך כלל לא מספיק 15. אחת סיבות חשובות לשימור מבני עניים היא f מספיקזמן ixation בגלל קיבעון פורמלדהיד כרוך היווצרות adduct וcrosslinking חלבון, והתהליך השני הוא איטי למדי 16. קיבעון דקות 45 מסייע להפחית את הבעיה הזו ללא הפסד הנגרם overfixation לגילוי של הקרינה.
  5. כיסוי לשטוף מחליק ~ 10x עם PBS המסונן.
    הערה: זו מפחיתה מזהמים ניאון. דגימות תמונה במהירות יחסית לאחר קיבוע. בתאי ביניים, לאחסן ב 4 ° C בPBS המסונן במכל אור חזק.
  6. התלושים לכסות הר המכילים תאי עצב בתא ב-PBS המסונן.
    הערה: המדגם חייב להיות מותקן במדיום מימית, כמו PBS, עם מקדם שבירה נמוכה מזו של זכוכית, ליישם הקרינה כוללת פנימית השתקפות (TIRF) מבוססת תאורה. תאורה מבוססת TIRF היא מאוד שימושית כי fluorophores להחליק הפרוקסימלי כיסוי רק שמחים, ויש ירידה קשורה גדולה בקרינת רקע 17.

2. רכישת תמונה </ P>

  1. הפעל את מערכת ההדמיה ברזולוציה סופר.
    1. הדלק את מנורת הקשת.
    2. להעיף את "מערכת / המחשב" ומתגים "מרכיב" (במתג מרחוק הכוח) ל" על ".
    3. הפעל את המחשב (אחרי תחנת לוח / עגינה שליטת מיקרוסקופ מגיע על).
      הערה: תחנת העגינה יכולה לשמש כדי לשלוט ולפקח על תכונות רבות של אופטיקה ונתיב אור, בעיקר בחירה של מטרה ומיקוד.
    4. לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה ולבחור באפשרות "מערכת ההפעלה" בשיח הכניסה.
  2. לבחון את הדגימה.
    1. פתח את החזית ולוחות גישה עליונה על ארון בטיחות לייזר.
    2. הטה את זרוע האור המועברת לגשת לבמה ויעדים.
    3. שים שמן על הצמצם המספרי אלפא Plan-Apochromat 100X / NA = 1.46 אובייקטיבי (TIRF).
      הערה: מטרה גבוה NA 63X ניתן להשתמש בם במקום 100X.
    4. הר את המדגם על הבמה, ולהעלות את המטרת דואר למדגם.
    5. לנטר את מיקום העדשה באמצעות פונקצית XYZ של תחנת העגינה. עצור כאשר העדשה היא באצטדיון של התמקדות (למשל, z ~ 2.50 מ"מ).
    6. באופן מלא לסגור את לוחות הגישה.
      הערה: כדי לעסוק בטיחות הלייזר.
    7. לכוונן את הפוקוס באמצעות oculars ולחצנים בכרטיסיית אתר.
      הערה: כרטיסיית אתר מספקת גישה לכפתורים המייצרים תאורה מבוססת מנורת קשת ומאפשר תצפית ישירה של המדגם עם oculars. בדומה לכך, כרטיסיית הרכישה מספקת גישה לכלים המייצרים תאורה מבוססת לייזר ומאפשר ללכוד תמונה על ידי המצלמה.
      1. עבור לכרטיסייה לאתר, לבחור "טראנס על".
      2. לחץ על סמל ההרחבה העיני.
        שים לב: זה מעלה את סכמטי של נתיב האור. תכונות של נתיב האור ניתן לשנות על ידי לחיצה השמאלית סמלים מתאימים בסכמטית או על ידי שימוש במסך המגע בתחנת העגינה. לדוגמא, מסנןמתאים לצפייה פליטה מDendra2 ניתן לבחור באמצעות סמל אקדח רפלקטור.
      3. תסתכל לתוך העיני, ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות תחנת העגינה כמדריך.
        הערה: המדגם יהיה מאוד מאוכלס בדלילות עם תאי ניאון כי נוירונים בהיפוקמפוס קשים transfect, ולכן יכולים להיות קצת מסובך להתמקד באמצעות התאורה באה לידי ביטוי. אם זה המקרה, השתמש בתאורה משודרת וקריאת z של תחנת העגינה כמדריך.
      4. למתג את האור "כבוי" לאחר ההתמקדות.
  3. זהה את תא שהוא די בהיר, מציג הקרינה punctate, ויש לו מורפולוגיה קלאסית שמעידה על בריאות טובה.
    1. בחר אור מוחזר ומתאים מסנן לצפייה פליטה ירוקה מDendra2.
    2. סרוק את תלוש לכסות לתאים לבטא מפלצות Dendra2 באמצעות עירור בעצימות נמוך אור.
  4. לעבור לACQכרטיסיית uisition.
    1. השתמש "מנהל הניסוי" כדי לטעון את תצורת רכישת PALM אשר נועדה כראוי או בקלות שונה.
      הערה: אם אין ניסוי כזה קיים, לעצב תצורה ניסיונית החל שימוש בהגדרות הבאות כמדריך: מחווני כוח לייזר: 405 ננומטר (~ 0.01% לליזר mW 50); 488 ננומטר (~ 3% לליזר mW 100); 561 ננומטר (~ 40% לליזר mW 100); זמן חשיפה: ~ 50 אלפיות שניים; רווח מצלמה: ~ 200; רכישה רב ממדית: סדרת זמן (מחזורים = 30,000, מרווח = 0); שירים: ננומטר 488 עם עלית תאורה, וננומטר 561 עם תאורה מבוססת TIRF (ראה שלב 2.5.1); מטרה: 100X (NA = 1.46); מחוון זווית TIRF: שכיחות זווית ~ 67-72 °; גודל פיקסל: 100 ננומטר; שדה הראייה: TIRF (האפשרויות חלופיות להניב עוצמות לייזר גבוהות יותר ומשמשות לfluorophores שקשה יותר לאקונומיקה).
    2. לחץ על "כן" כאשר תפריט מוקפץ מופיע בשאילתא על מעבר בלייזרים.
  5. להביא את התמונהשל התא אל מוקד במטוס המצלמה.
    1. בחר את מסלול לייזר עלית תאורת 488 ננומטר.
      שים לב: מסלולי תצורות קרן משמשות במהלך הדמיה. כאן, שמות רצועות נקבעות על ידי העירור באורך הגל שמייצר הפליטה כי הוא עבר למצלמה. לדוגמא, מסלול ננומטר 561 משתמש הן 405 ו561 קווי לייזר ננומטר, אבל קוביית הסינון עוברת רק פליטה מDendra2 photoconverted נרגשת על ידי 561 ננומטר אור למצלמה.
    2. למקד את התמונה של התא במצלמה באמצעות הכפתור "הרציף" הרכישה.
  6. אסוף תמונת widefield קונבנציונלית.
    1. השתמש בלחצן "הצמד".
    2. שמור את התמונה על ידי לחיצה על התפריט "הקובץ" והבחירה באפשרות "שמירה / שמירה בשם."
  7. הגדר את התאורה מבוססת TIRF.
    1. בחר מסלול 488 ולעבור ל" TIRF "באמצעות הלחצן EPI / TIRF.
    2. בחר רכישה "רציפה".
    3. התאם tמחוון תאורה הוא מבוסס TIRF.
      הערה: TIRF מושגת כאשר יש מחשיך פתאומי של רקע ויכול להיות ממוקד הדגימה באחת מטוס 18. אם התכונות חדשות לעין באמצעות התמקדות עד למדגם, זווית השכיחות נמוכה מדי, כי בTIRF יש רק אחד מטוס של מוקד.
    4. בדוק את זווית TIRF באמצעות המסלול 561 עם לייזר 405 ננומטר "את".
    5. הפעל את לייזר 405 ננומטר בחזרה "על" לפני ביצוע ניסוי PALM.
  8. איסוף נתונים PALM.
    1. להיט "להתחיל את ניסוי."
      הערה: אם ירצה, לפתוח את לשונית "אפשרויות עיבוד מקוונות" וסמן את "PALM המקוון עיבוד" ו "Fit Gauss2D" (לפני תחילת הניסוי) כדי לפקח על תמונת PALM שוחזרה במהלך איסוף הנתונים גולמי. זה יקל על הערכה של איכות הנתונים ובכך כדאיויות המשך תהליך איסוף הנתונים יחסית זמן רב.
    2. מבחינה ויזואליתלפקח photoconversion.
    3. הגבר את העצמה של לייזר 405 ננומטר (photoconverting) כאשר פוחת Dendra2 photoconversion (בדרך כלל לאחר רכישת ~ 10,000 תמונות גולמיות).
    4. להמשיך בניסוי אם עליות photoconversion. אחרת, לעצור את הניסוי (ללא אובדן נתונים) על ידי להכות את הכפתור "עצור" הצעד הנוכחי.
    5. שמור את התמונות כאשר איסוף הנתונים הושלם (לאחר ~ 15 דקות).

3. עיבוד תמונה, תצוגה וניתוח

  1. בהעדר תמונות עיבוד, תהליך מקוון גלם שנשמרו בדיסק.
    1. לחץ על כרטיסיית העיבוד, פתח את כרטיסיית השיטה, ובחר "PALM".
    2. בחר "PALM" שוב מארבעה suboptions.
    3. לכו לתפריט הקובץ, לפתוח ולראות את הקובץ של עניין, ופגע "בחירה".
    4. Hit "חלים".
      הערה: פעולה זו תפעיל לוקליזציה שיא / ממצא fluorophore ושיא עם opti ברירת המחדלפיירפוקס. במידת צורך, פסגות גם יכולות להיות מקובצים באמצעות הכרטיסייה "PAL-הקבוצה". קיבוץ מקצה פסגות המופיעות במספר פריימים ברציפות למולקולה בודדת אם קואורדינטות שיא הן דומות מספיק. בנוסף, ניתן לתקן את הנתונים לסחף מדגם באמצעות אפשרות היישור של התוכנה מבוססת מודל להיסחף.
  2. לסנן את הרכיבים בצורה גרועה מקומיים ונדגמו בצורה גרועה בנתונים מקומי השיא.
    1. בטל fluorophores בדיוק לוקליזציה, σ,> 35 ננומטר שימוש באפשרות "PAL-המסנן".
    2. בטל fluorophores באזורים שבם ממוצע המרחק בין פסגות, ד, הוא גדול מדי כדי לפתור שלפוחית ​​של קוטר, ד '
      1. חלץ את דיוק הלוקליזציה הממוצעת, σ, מהיסטוגרמה דיוק לוקליזציה.
      2. חישוב ערך מקסימאלי מקובל לד מבוסס על σ, וcriteron תנון-נייקוויסט 19, המגולמת ברזולוציה קירוב 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
      3. לקבוע את הסף באפשרות "הסרה חריגים PALM" למחוק פסגות מוקפות בפחות מ πD 2 / (4d 2) שכנים בתוך מעגל ברדיוס של ד / 2.
    3. להמיר את נתוני PALM מעובדים לתמונת PALM שימוש באפשרות "PAL-Rendering"; ראה איור 1.
    4. לכמת גדלים והפרדות ידי בחירה בפונקציה "הפרופיל".
      1. בדוק את הקו המשויך ואפשרויות שולחן, ולמתוח קו לאורך הכיוון הרצוי בתמונה.
      2. לכמת קטרים ​​ידי קביעת רוחב מלא בעוצמה מקסימלי חצי.
      3. לכמת הפרדות על ידי קביעת מרווחים בין שיא לשיא של פרופילי עוצמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג מוצר קצה אחד של הדמיה ועיבוד. בתמונת PALM זה, קואורדינטות רוחב של fluorophores מקומי מוצגות באמצעות מצב תצוגת centroid, והתמונה ברזולוציה העל של DCV הקשורים מוצגת באמצעות מצב תצוגת גאוס.

איור 2 א מראה widefield מקביל ותמונות PALM של סומה ותהליכים הפרוקסימלי של שמונה ימים בתא העצב בהיפוקמפוס מבחנה להביע tPA-Dendra2. תכונות חשובות של התמונות כוללות (1) נרחבת, התאמה של אחד לאחד, וחפיפה, בין puncta בתמונות קונבנציונליות וPALM, (2) גודל קטן יותר באופן משמעותי של puncta PALM, ו (3) רזולוציה מזדמנת של "פונקטום widefield בודד לתוך puncta PALM מרובה.

איור 2 מראה תמונת כף DCVs לאורך חלק מתהליך של נוירון בהיפוקמפוס שני להביע tPA-Dendra2. חשובתכונות של תמונה זו כוללות (1) בקוטר קטן, ומראה הומוגני, של puncta, ו (2) תצפית נדירה של puncta / אשכולות DCV משוערים apposed מקרוב.

איור 3 מתאר שיטה כמותית פשוטה של קביעה אם שתיים או יותר DCVs קרוב מספיק כדי מהווה אשכול; במערכות שבן אשכולות הוא שכיחים, בשיטות מתוחכמות יותר, המבוססות על פונקציות הפצה, יכולות לשמש לכימות 21. השיטה הפשוטה מבוססת על יצירת פרופילי קו של עוצמות puncta (מוצגות בגרפים), אשר יכול לשמש כדי לכמת הפרדת DCV ורוחב DCV. אם ההפרדה עולה על הרוחב באופן משמעותי (כפי שנדון במקרא), DCVs לא "קשר", ואילו אם הפרדה היא בערך כמו רוחב, DCVs יכול ליצור קשר. בהתבסס על קריטריון זה, DCVs בפנל סווגו כ" לא במגע ", ואילו אלה שבלוח ב 'סווגו כבקון טקט. שימוש בגישה זו, אנחנו שמים את הגבול עליון של ~ 8% באשכולות הקשורים קשר של DCVs extrasynaptic בפיתוח תאי עצב בהיפוקמפוס. גודל DCV שלנו ונתונים אשכול מסוכמים בטבלה 1.

איור 1
איור 1. כיסוי של תמונת PALM שניתנו גאוס של DCV (אדום) ותמונת PALM מצב centroid-צג המציגה את קואורדינטות של fluorophores הבודד photoconverted (נקודות לבנות) הנכלל בDCV. המצב לשעבר מציג fluorophores שניתנו לפונקציות גאוס עם רוחב נקבע על ידי בדיוק הלוקליזציה שלהם, ואחרון מציג fluorophores / פסגות כנקודות מקומיות בהם (x, y) קואורדינטות. בר = 0.1 מיקרומטר.t = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. Overlay (א) לwidefield סיכם (ירוקה) וכף יד (אדום) תמונות של סומה ותהליכים הפרוקסימלי של נוירון בהיפוקמפוס פיתוח להביע tPA-Dendra2. אזורי חפיפה מופיעים צהובים / כתום. תמונת PALM (ב) לDCVs רירית subregion של תהליך של תא אחר להביע tPA-Dendra2. ברים = 5 ו 2 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. שכבות ( A ו-B) של widefield סיכם (ירוק) וכף יד (אדומה) תמונות של puncta בנוירון בהיפוקמפוס פיתוח להביע tPA-Dendra2. בשני הפנלים, תמונת widefield תערוכות "פונקטום גדול אחד, ואילו תמונת PALM הקשורות פותרת "פונקטום היחיד זה לשני puncta מצומצם הרבה יותר. הגרפים מראים פרופילי עוצמה באנלוגיה-מקודד לפי צבע המתקבלים עבור puncta בפנל (גרף משמאל) ובלוח ב '(גרף מימין). הפרופילים הנגזרים מתמונת PALM בפנל תכנית שיש לי puncta רוחב מלא בעוצמה מקסימלי שמחצית היא ~ 40% מרווח השיא אל שיאם; וכך, שני puncta אלה הם לא במגע ולא סווג כמקבץ משוער. לעומת זאת, הפרופילים הנגזרים מתמונת PALM בB להראות פנל שיש לי puncta רוחב מלא בעוצמה מקסימלי חצי שהיא בעצם אותו הדבר כמו הריווח בין שיא לשיאם; וכך, אלה סווגו כמקבץ משוער. בר = 0.2 מיקרומטר./ "= היעד" _blank 51394fig3highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

פרמטר תוצאה מספר DCVs ניתח
העליון מחויב בDCVs התקבצו 7.9 ± 5.9% 618
מתכוון בקוטר DCV 77 ± 21 ננומטר 60

טבלת 1. גודל DCV וסיכום נתוני אשכול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PALM ושיטות מיקרוסקופיה קשורות רזולוציה סופר הקרינה צמחו לאחרונה כהשלמה חשובה לצורות מבוססות יותר של מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופי אלקטרונים (EM) 22-24. תכונות חיוביות של PALM כוללות הכנת מדגם פשוט יחסית והפרעות מדגם מינימליות. באופן עקרוני, PALM גם יכול לשמש כדי לחקור תאי חיים. כנראה התכונה השלילית העיקרית של PALM היא רכישת נתונים זמן רב, אשר פוגעת באופן משמעותי את מחקרים של תהליכים דינמיים מהיר יותר בתאים חיים. בנוסף, PALM הוא חדש יחסית, ו, fluorophores חזק ובכך מתאים ופרוטוקולים להכנת מדגם ועבור רכישת נתונים וניתוח אינם מפותחים ו / או שתועדו באופן מלא 3.

כאן יש לנו תיארתי פרוטוקול שמתאים ליחיד צבע מחקרים מבוסס PALM, של שלפוחית ​​בתאים קבועים, בתרבית. הפרוטוקול גם הוא נקודת התחלה טובה לפיתוח באופן דומהביימו, מחקרי PALM כפול צבע. היעילות של הפרוטוקול שלנו היא נתמכת על ידי שתי תכונות מפתח של נתונים PALM שלנו. ראשית, חלוקת puncta בכף שלנו שוחזרה, וwidefield המשלים, תמונות היא דומה מאוד. הבדל אחד המשמעותי בהפצה - הרזולוציה מזדמנת של puncta העקיפה המוגבל לpuncta מרובה על ידי PALM - משקף את הרזולוציה המשופרת במידה ניכרת של PALM ועוד מדגיש את היעילות של הטכניקה ושירות.

שנית, תוצאות PALM שלנו הן בהסכם טוב, ו / או עולות בקנה אחד, עם תוצאות רלוונטיות אחרות. לדוגמא, תמונות של נוירונים בהיפוקמפוס שהושגו באמצעות EM מדי פעם לחשוף את הפרוסות דרך DCVs, וקוטר DCV להסיק מהפרוסות הוא ~ 70-100 ננומטר 11. ההסכם יוצא דופן בין נתוני PALM שלנו ואת נתוני EM מרגיע לשתי הגישות. PALM עדיין נבחנת, וEM בדרך כלל כפוף חששות לגבי הכנת המדגם הקשה הנדרשת ל. באופן דומה,סרטים מוגבלים דיפרקציה של חיים נוירונים בהיפוקמפוס coexpressing מפלצות ירוקות ואדום ממוקד לDCVs מראים כי puncta הירוק ואדום חופף לעבור comovement המתמשך 25. הפירוש הפשוט ביותר של תוצאה זו - האותות האדומים וירוקים להתעורר מאותו DCV - עולה בקנה אחד עם PALM, אשר מוכיח כי puncta העקיפה מוגבלת באופן גורף מייצג DCVs הבודד. פרשנות פחות פשוטה של ​​comovement - האותות האדומים וירוקים נובעים מDCVs אשכולות - הוא ייפסל במידה רבה על ידי פאלם.

יש הפרוטוקול המתואר כאן תכונות חיוביות אחרות. בפרט, הכנת מדגם היא פשוטה יחסית ודי דומה לזה שמתאים למיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי, עם שני חריגים בולטים: (1) שלפוחית ​​חייבת להיות מסומנת עם fluorophores photoconvertible או photoactivatable, ו (2) תאים קבועים הם רכובים הטובים ביותר בתקשורת מימית. simplici יחסי זהty משקף את העובדה שהניסויים הם קצרים, ולכן דגימות לא צריכים להיות מתויגות עם חרוזים fiducial (כדי להקל על תיקון להיסחף), שיכול להיות מסובך 26. בנוסף, שלפוחית ​​בדרך כלל מתויגות עם fluorophores רבים; ובכך, השיג צפיפות תיוג fluorophore נאותה הוא פשוט. לעומת זאת, למבנים אחרים, זה יכול להיות קשה למדי 3. רכישת תמונה גם היא פשוטה יחסית. עם זאת, PALM דורש רכיבים אלקטרוניים ואופטיים שהם יקרים וחדשניים משום שאותות PALM הם מיסודם חלשים מאוד.

כנראה ההיבטים המתוחכמים ביותר של מרכז PALM סביב העיבוד, ניתוח והתצוגה של תמונות PALM. כמודגש כאן, יישום היבטים של PALM אלה דורש הבנה של כמה נושאים עדינים, ובכלל זה את מערכת היחסים בין הדגימה ורזולוציה, ואת ההבחנה בין ברזולוציה ודיוק לוקליזציה. לכן, בסך הכל, PALM יםtudies תמיד הם די מורכב, אבל זה מאוזנת שיפור רזולוציה שעשויה להיות משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי R15 2 GM061539-02 (לBAS), 2 R15 NS40425-03 (לjel), MH 66,179 (לד"ר גארי בנקר של אורגון לבריאות ומדע באוניברסיטה / OHSU), וP30 NS061800 (ד"ר סו Aicher של OHSU). אנו מודים לברברה Smoody לתמיכה נרחבת בתרבות של תאי עצב בהיפוקמפוס, ובני זוג. בריאן ארוך וג'יימס Abney לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss PALM Carl Zeiss, Inc. Elyra PS.1 With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Life Technologies 11668-019
Minimum Essential Medium Life Technologies 11095-080
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010049
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19208
Sucrose Sigma-Aldrich S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D Fisher Scientific NC0059095

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
  3. Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
  4. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
  5. Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
  6. Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
  7. Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
  8. Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
  9. Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
  10. Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
  11. Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
  12. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
  13. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  14. Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
  15. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
  16. Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
  17. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
  18. Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
  19. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
  20. Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
  21. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  22. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  23. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
  24. Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  25. Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
  26. Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).

Tags

Neuroscience גיליון 89 מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated Dendra2 שלפוחית ​​צפופות ליבות סינפסה נוירון בהיפוקמפוס אשכול
הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scalettar, B. A., Shaver, D., Kaech, … More

Scalettar, B. A., Shaver, D., Kaech, S., Lochner, J. E. Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles. J. Vis. Exp. (89), e51394, doi:10.3791/51394 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter