Summary
हम Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) के आधार पर तय हो, सभ्य न्यूरॉन्स में vesicles की पढ़ाई लागू करने के लिए क्या करते हैं. हमारे प्रोटोकॉल के मुख्य घटक एक सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी प्रणाली के साथ कम नमूना कच्चे छवियों का संग्रह है, और एक सुपर संकल्प छवि का निर्माण करने के लिए कच्चे छवियों प्रसंस्करण photoconvertible काइमेरा के साथ लेबलिंग पुटिका, शामिल हैं.
Abstract
प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आधुनिक जैविक और चिकित्सा अनुप्रयोगों में कार्यरत कई व्यापक रूप से उपयोग और तेजी से आगे बढ़ माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए आधार प्रदान करता है. प्रतिदीप्ति की ताकत इसकी संवेदनशीलता, विशिष्टता, और रहते इमेजिंग के साथ संगतता शामिल हैं. दुर्भाग्य से, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के परंपरागत रूपों ~ 250 एनएम की तुलना में छोटे आयामों के साथ संरचनाओं की पढ़ाई बाधित जो इमेजिंग विमान में एक बड़ी कमजोरी, विवर्तन सीमित संकल्प से पीड़ित हैं. हाल ही में, इस सीमा के इस तरह के Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) के रूप में सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक की शुरूआत के साथ दूर किया गया है. अपनी परंपरागत समकक्षों के विपरीत, पाम नैनोमीटर के दसियों की एक पार्श्व संकल्प के साथ छवियों का उत्पादन कर सकते हैं. यह सेलुलर संरचना और संगठन के पहले दुर्गम विशेषताओं का एक स्पेक्ट्रम स्पष्ट करने के लिए, अपने असंख्य ताकत के साथ, प्रतिदीप्ति उपयोग करने के लिए अब इस प्रकार संभव है.
_content "> दुर्भाग्य से, पाम लागू करने के लिए तुच्छ नहीं है, और सफल रणनीतियों अक्सर अध्ययन के तहत प्रणाली के प्रकार के आधार पर किया जाना चाहिए. इस अनुच्छेद में, हम तय, सभ्य न्यूरॉन्स में vesicular संरचनाओं के एकल रंग पाम पढ़ाई लागू करने के लिए कैसे दिखा. पाम आदर्श 50-250 एनएम ~ से. हमारे दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जो आम तौर पर है कि सीमा आयाम है जो पुटिका, का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है एक साथ कम नमूना कच्चे छवियों का संग्रह, photoconvertible (लाल को हरा) पुटिका कार्गो के काइमेरा साथ न्यूरॉन्स लेबलिंग सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी प्रणाली, और एक उच्च संकल्प पाम छवि का निर्माण करने के लिए कच्चे छवियों प्रसंस्करण. हम भी खंडन जो, संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स में घने कोर vesicles के असाधारण अच्छी तरह से हल हो गई छवियों (DCVs) पेश करने से हमारे दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का प्रदर्शन DCVs की extrasynaptic तस्करी DCV समूहों द्वारा बड़े पैमाने पर मध्यस्थता है कि परिकल्पना.Introduction
सेलुलर प्रक्रियाओं की एक संख्या विशिष्ट subcellular स्थलों के लिए biomolecules की सटीक और कुशल पुटिका की मध्यस्थता की तस्करी पर निर्भर करते हैं. एक प्रमुख उदाहरण संभवतः बाहर का पूर्व और postsynaptic साइटों 1 के लिए neuronal सोमा में जीवजनन की साइटों से synaptic घटक का लंबी लेकर, पुटिका की मध्यस्थता प्रसव से पहले है, जो synaptic विधानसभा है.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पुटिका तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और लोकप्रिय तरीका है. तकनीक की ताकत इसकी संवेदनशीलता, विशिष्टता, और लाइव इमेजिंग 2 के साथ संगतता शामिल हैं. दुर्भाग्य से, अपेक्षाकृत हाल तक, तकनीक ~ 250 एनएम की तुलना में छोटे आयामों के साथ संरचनाओं की पढ़ाई बाधित है, जो एक बड़ी कमजोरी, विवर्तन सीमित समाधान 2 से पीड़ित है. हाल ही में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में पार्श्व संकल्प सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति मील की शुरूआत के साथ विवर्तन बाधा को पारपाम के रूप में 3 croscopy तकनीक,. हथेली के पार्श्व संकल्प, दसियों नैनोमीटर, आदर्श आमतौर पर ~ 50-250 एनएम 4 से लेकर उस आयाम है जो पुटिका, का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. यह विशिष्ट subcellular साइटों के लिए उनकी तस्करी के कुछ पहलुओं सहित vesicles के पहले दुर्गम विशेषताओं, की एक स्पेक्ट्रम स्पष्ट करने के लिए, अपने असंख्य ताकत के साथ, प्रतिदीप्ति उपयोग करने के लिए अब इस प्रकार संभव है.
पाम लागू करने के लिए तुच्छ नहीं है, और सफल रणनीतियों अक्सर अध्ययन के तहत प्रणाली के प्रकार के आधार पर किया जाना चाहिए. यहाँ हम vesicular संरचनाओं की हथेली पढ़ाई कैसे लागू करने का वर्णन है, और हम hippocampal न्यूरॉन्स में DCVs के मामले के लिए हमारे दृष्टिकोण की प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. विशेष रूप से, हम hippocampal न्यूरॉन्स में synapses के लिए परिकल्पना DCVs की है कि तस्करी से निपटने के लिए हथेली उपयोग DCV समूहों 5-8 से मध्यस्थता है.
N विकसित करने में synapses के लिए vesicles के क्लस्टर की मध्यस्थता की तस्करीयह तेजी से synaptic स्थिरीकरण और विधानसभा 9,10 सुविधा हो सकती है क्योंकि eurons एक साज़िश संभावना है. DCVs के क्लस्टर तस्करी के समर्थकों क्लस्टरिंग 6 समर्थन सबूत के रूप में एक्सोजेनस DCV कार्गो शरण extrasynaptic फ्लोरोसेंट puncta के बड़े स्पष्ट आकार का हवाला देते हैं. हालांकि, इन puncta क्लस्टरिंग से उत्पन्न होने वाली उन से विवर्तन से उत्पन्न होने वाले भेद आकार प्रभाव के लिए अनुकूल नहीं हैं जो विवर्तन सीमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करते हुए उत्पन्न छवियों में दिखाई देते हैं.
इस समस्या को हल करने के लिए, हम पारंपरिक widefield प्रतिदीप्ति और DCVs को लक्षित काइमेरा व्यक्त hippocampal न्यूरॉन्स की हथेली छवियाँ एकत्र. इन चित्रों के विश्लेषण परंपरागत छवियों में ख्यात extrasynaptic DCV समूहों की> 92% 80 एनएम पाम छवियों में (व्यक्तिगत DCV आकार) 11 puncta के रूप में हल कर रहे हैं कि पता चला. Hippoca विकसित करने में DCVs करने के लिए आवेदन के रूप में इस प्रकार, इन आंकड़ों को काफी हद तक क्लस्टरिंग परिकल्पना रद्दmpal न्यूरॉन्स.
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Protocol
1. नमूना तैयार
- मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग कर, DCVs को लक्षित एक photoconvertible या photoactivatable कल्पना एन्कोडिंग डीएनए तैयार.
नोट: एक संभावना यह डीएनए एन्कोडिंग है एक ऊतक plasminogen उत्प्रेरक-Dendra2 कल्पना (टीपीए-Dendra2). Dendra2 हरे रंग से पराबैंगनी प्रकाश से 12 जोखिम पर लाल उत्सर्जन पर स्विच करता है एक photoconvertible प्रोटीन होता है. - उच्च प्रदर्शन # 1.5 कवर पर संस्कृति hippocampal न्यूरॉन्स मानक प्रोटोकॉल 13 के बाद, ~ 5-10 दिनों के लिए निकल जाता है.
- एक cationic लिपिड अभिकर्मक का उपयोग hippocampal न्यूरॉन्स के विकास Transfect.
नोट: वायरल की मध्यस्थता संक्रमण परिपक्व न्यूरॉन्स के लिए अधिक प्रभावी है. यह वैकल्पिक दृष्टिकोण कहीं 14 विस्तार से वर्णित किया गया है.- ~ डीएनए की 1 ग्राम और न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) और cationic लिपिड अभिकर्मक के 4 μl और 250 μl युक्त एक दूसरा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के 250 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब तैयारसदस्य के.
- 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं.
- दो समाधान गठबंधन और एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण सेते हैं.
- ऊष्मायन के दौरान, संस्कृति के माध्यम से कई मिलीलीटर युक्त पकवान 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम तैयार
- धीरे गर्म मध्यम युक्त डिश के लिए न्यूरॉन्स युक्त कवर फिसल जाता है हस्तांतरण और अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें.
- धीरे पकवान झुकाव और फिर 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में जगह है.
- उनके "घर पकवान" न्यूरॉन्स लौटें और ~ 12-18 घंटे इंतजार.
- फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde / 4% sucrose में 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें (पीबीएस, पीएच 7.4) 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम
नोट: पाम प्रयोगों में, यह फैटी का अच्छा संरक्षण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और immunofluorescence धुंधला के लिए इस्तेमाल मानक formaldehyde निर्धारण प्रोटोकॉल आमतौर पर 15 पर्याप्त नहीं हैं. गरीब संरचनात्मक संरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण कारण अपर्याप्त है चformaldehyde निर्धारण अभिवर्तन गठन और प्रोटीन crosslinking शामिल है, और बाद की प्रक्रिया 16 काफी धीमी है ixation समय है. एक 45 मिनट निर्धारण प्रतिदीप्ति का कोई detectable overfixation प्रेरित नुकसान के साथ इस समस्या को कम करने में मदद करता है. - धो कवर फ़िल्टर्ड पीबीएस के साथ ~ 10x निकल जाता है.
नोट: यह फ्लोरोसेंट contaminants कम कर देता है. छवि नमूनों अपेक्षाकृत जल्दी निर्धारण के बाद. एक प्रकाश तंग कंटेनर में फ़िल्टर्ड पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतरिम, दुकान कोशिकाओं में. - फ़िल्टर की पीबीएस में एक कक्ष में न्यूरॉन्स युक्त पर्वत कवर फिसल जाता है.
नोट: नमूना कांच की तुलना में कम अपवर्तनांक साथ पीबीएस की तरह एक जलीय मध्यम, में रखा जाना चाहिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) आधारित रोशनी को लागू करने के लिए. केवल कवर पर्ची समीपस्थ fluorophores उत्साहित हैं क्योंकि TIRF आधारित रोशनी बहुत उपयोगी है, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 17 में एक बड़ी जुड़े बूंद है.
2. छवि अधिग्रहण </ P>
- सुपर संकल्प इमेजिंग प्रणाली पर बारी.
- आर्क दीपक पर मुड़ें.
- करने के लिए (शक्ति दूरदराज के स्विच पर) "प्रणाली / पीसी" और "घटक" स्विच फ्लिप "पर."
- कंप्यूटर (माइक्रोस्कोप नियंत्रण गोली / डॉकिंग स्टेशन के बाद पर आता है) पर मुड़ें.
नोट: डॉकिंग स्टेशन प्रकाशिकी और प्रकाश पथ के कई गुण, उद्देश्य और ध्यान देने की विशेष रूप से चुनाव के लिए नियंत्रण और निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - डबल सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करें और लॉगइन संवाद में "प्रारंभ प्रणाली" विकल्प चुनें.
- नमूना जांच करते हैं.
- लेजर सुरक्षा कैबिनेट पर आगे और ऊपर पहुँच पैनल खोलें.
- मंच और उद्देश्यों तक पहुँचने के लिए प्रेषित प्रकाश हाथ झुकाएँ.
- अल्फा योजना Apochromat 100X संख्यात्मक एपर्चर पर तेल डाल / एनए 1.46 (TIRF) उद्देश्य =.
नोट: एक 63x उच्च NA उद्देश्य 100X के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है. - मंच पर नमूना माउंट, और वें बढ़ानमूना ओर ई उद्देश्य.
- डॉकिंग स्टेशन के xyz समारोह का उपयोग कर लेंस स्थिति पर नज़र रखें. लेंस ध्यान के ballpark (जैसे, जेड ~ 2.50 मिमी) में है जब बंद करो.
- पूरी तरह से उपयोग पैनलों बंद करें.
नोट: लेजर सुरक्षा संलग्न हैं. - ठीक धुन का पता लगाने के टैब में oculars और बटन का प्रयोग फोकस.
नोट: का पता लगाने टैब आर्क दीपक आधारित रोशनी उत्पादन और oculars के नमूने के साथ प्रत्यक्ष अवलोकन की सुविधा है कि बटन के लिए पहुँच प्रदान करता है. इसी तरह, अधिग्रहण टैब लेजर आधारित रोशनी उत्पादन और कैमरा से छवि पर कब्जा करने की सुविधा है कि उपकरणों का उपयोग प्रदान करता है.- चयन, पता लगाने टैब पर जाएं "ट्रांस पर."
- आंख का विस्तार प्रतीक क्लिक करें.
नोट: इस पथ प्रकाश की एक योजनाबद्ध को पेश करती है. प्रकाश पथ के गुण बाईं योजनाबद्ध में उपयुक्त माउस को क्लिक करके या डॉकिंग स्टेशन पर टच स्क्रीन का उपयोग करके बदला जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक फिल्टरDendra2 से उत्सर्जन को देखने के लिए उपयुक्त परावर्तक रिवाल्वर चिह्न का उपयोग चुना जा सकता है. - Eyepieces में देखो, और एक गाइड के रूप में डॉकिंग स्टेशन का उपयोग ध्यान में कोशिकाओं को ले आओ.
नोट: hippocampal न्यूरॉन्स transfect मुश्किल हो जाता है, और इस प्रकार यह परिलक्षित रोशनी का उपयोग ध्यान केंद्रित करने के लिए थोड़ा मुश्किल हो सकता है क्योंकि नमूना बहुत कम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के साथ आबादी वाले हो जाएगा. यदि यह मामला है, एक गाइड के रूप में प्रसारित रोशनी और डॉकिंग स्टेशन की जेड पढ़ने का उपयोग करें. - ध्यान केंद्रित करने के बाद "बंद" प्रकाश टॉगल करें.
- काफी उज्ज्वल है कबरा प्रतिदीप्ति दर्शाती है, और अच्छे स्वास्थ्य का सूचक है कि एक क्लासिक आकारिकी है कि एक सेल को पहचानें.
- परिलक्षित प्रकाश और Dendra2 से हरी उत्सर्जन को देखने के लिए फिल्टर उपयुक्त चुनें.
- कम तीव्रता उत्तेजना प्रकाश का उपयोग Dendra2 काइमेरा व्यक्त कोशिकाओं के लिए कवर पर्ची स्कैन करें.
- Acq में स्विच करेंuisition टैब.
- उचित डिजाइन या आसानी से संशोधित किया गया है कि एक पाम अधिग्रहण विन्यास लोड करने के लिए "प्रयोग प्रबंधक" का प्रयोग करें.
नोट: लेजर शक्ति स्लाइडर्स:: ऐसा कोई प्रयोग मौजूद है, एक गाइड के रूप में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर एक प्रारंभिक प्रयोगात्मक विन्यास डिजाइन 405 एनएम (~ एक 50 मेगावाट लेजर के लिए 0.01%); 488 एनएम (~ एक 100 मेगावाट लेजर के लिए 3%); 561 एनएम (~ एक 100 मेगावाट लेजर के लिए 40%); एक्सपोजर समय: ~ 50 मिसे; कैमरा लाभ: ~ 200; बहुआयामी अधिग्रहण: समय श्रृंखला (चक्र = 30000, अंतराल = 0); पटरियों: महामारी रोशनी के साथ 488 एनएम, और TIRF आधारित रोशनी (कदम 2.5.1 देखें) के साथ 561 एनएम; उद्देश्य: 100X (एनए 1.46 =); TIRF कोण स्लाइडर: घटना कोण ~ 67-72 °; पिक्सेल का आकार: 100 एनएम; देखने के फील्ड: TIRF (वैकल्पिक विकल्प उच्च लेजर तीव्रता उपज और ब्लीच करने के लिए और अधिक मुश्किल हो जाता है कि fluorophores के लिए उपयोग किया जाता है). - एक पॉप अप मेनू पराबैंगनीकिरण पर स्विच करने के बारे में एक प्रश्न के साथ प्रकट होता है जब 'हां' पर क्लिक करें.
- उचित डिजाइन या आसानी से संशोधित किया गया है कि एक पाम अधिग्रहण विन्यास लोड करने के लिए "प्रयोग प्रबंधक" का प्रयोग करें.
- छवि लाओकैमरा विमान पर ध्यान केंद्रित करने में सेल की.
- 488 एनएम महामारी रोशनी लेजर ट्रैक चुनें.
नोट: ट्रैक्स इमेजिंग के दौरान इस्तेमाल किरण विन्यास कर रहे हैं. इधर, ट्रैक नामों कैमरे को पारित कर दिया है कि उत्सर्जन पैदा करता है कि उत्तेजना तरंगदैर्ध्य से निर्धारित होते हैं. उदाहरण के लिए, 561 एनएम ट्रैक 405 और 561 एनएम लेजर लाइनों दोनों का उपयोग करता है, लेकिन फिल्टर घन कैमरे के लिए 561 एनएम प्रकाश से उत्साहित photoconverted Dendra2 से केवल उत्सर्जन गुजरता है. - "निरंतर" अधिग्रहण बटन का उपयोग कर कैमरे पर सेल की छवि को ध्यान.
- 488 एनएम महामारी रोशनी लेजर ट्रैक चुनें.
- एक पारंपरिक widefield छवि लीजिए.
- "तस्वीर" बटन का प्रयोग करें.
- "फाइल" मेनू करने के लिए जा रहा है और चयन करके छवि बचाने के लिए "के रूप में बचाने / बचाने के लिए."
- TIRF आधारित रोशनी की स्थापना की.
- 488 ट्रैक चुनें और महामारी / TIRF बटन का उपयोग "TIRF" करने के लिए स्विच.
- "निरंतर" अधिग्रहण चुनें.
- टी समायोजितवह TIRF आधारित रोशनी स्लाइडर.
नोट: वहाँ पृष्ठभूमि का एक अचानक काला है और नमूना एक विमान 18 में केंद्रित किया जा सकता है जब TIRF हासिल की है. नई सुविधाओं के नमूने में ऊपर ध्यान केंद्रित के माध्यम से स्पष्ट हो गया है, तो TIRF में ध्यान केंद्रित करने का केवल एक ही विमान है, क्योंकि घटना कोण बहुत कम है. - डबल 405 एनएम लेजर के साथ 561 ट्रैक का उपयोग TIRF कोण की जांच "बंद."
- एक ताड़ के प्रयोग की शुरुआत से पहले "पर" वापस 405 एनएम लेजर मुड़ें.
- पाम डेटा लीजिए.
- "प्रयोग शुरू करते हैं." मारा
नोट: अगर वांछित, "ऑनलाइन प्रसंस्करण विकल्प" टैब खुला और कच्चे डेटा संग्रह के दौरान खंगाला पाम छवि नजर रखने के लिए (प्रयोग शुरू करने से पहले) "ऑनलाइन प्रोसेसिंग पाम" और "फ़िट Gauss2D" की जाँच करें. इस डेटा की गुणवत्ता और अपेक्षाकृत समय लेने वाली डेटा संग्रह प्रक्रिया को जारी रखने के इस प्रकार मूल्य का आकलन की सुविधा होगी. - दिखने मेंphotoconversion निगरानी.
- 405 एनएम (photoconverting) लेजर की तीव्रता में वृद्धि जब Dendra2 photoconversion घटता (आमतौर पर ~ 10,000 कच्चे छवियों के अधिग्रहण के बाद).
- Photoconversion बढ़ जाती है अगर प्रयोग जारी रखें. अन्यथा, "रोक" मौजूदा कदम बटन मार से (डेटा की हानि के बिना) प्रयोग बंद करो.
- डेटा संग्रह (~ 15 मिनट के बाद) पूरा हो गया है जब छवियों को बचाने.
- "प्रयोग शुरू करते हैं." मारा
3. इमेज प्रोसेसिंग, प्रदर्शन, और विश्लेषण
- डिस्क को बचाया गया है कि ऑनलाइन प्रसंस्करण, प्रक्रिया कच्चे छवियों के अभाव में.
- , प्रसंस्करण टैब पर क्लिक करें विधि टैब खोलें, और चयन "पाम."
- चार suboptions से फिर से "हथेली" चुनें.
- खुला, फ़ाइल मेनू पर जाएँ और ब्याज की फाइल देखने, और हिट "का चयन करें."
- मारो "लागू होते हैं."
नोट: यह डिफ़ॉल्ट OPTI साथ शिखर / फ्लोरोफोरे खोज और शिखर स्थानीयकरण आरंभ हो जाएगाons. यदि आवश्यक हो, चोटियों भी "पाल समूह" टैब का उपयोग बांटा जा सकता है. समूहन शिखर निर्देशांक पर्याप्त रूप से समान हैं अगर एक ही अणु के लिए कई लगातार फ्रेम में दिखाई देने वाली चोटियों प्रदान करती है. इसके अलावा, डेटा सॉफ्टवेयर के मॉडल के आधार पर बहाव संरेखण विकल्प का उपयोग नमूना बहाव के लिए सही किया जा सकता है.
- शिखर स्थानीय डेटा में खराब स्थानीयकृत और खराब जांचा घटकों बाहर तक.
- स्थानीयकरण precisions साथ fluorophores त्यागें, σ,> "पाल तक" उपकरण का उपयोग 35 एनएम.
- चोटियों, घ के बीच औसत दूरी, व्यास, डी. के पुटिका को हल करने के लिए बहुत बड़ी है जहां क्षेत्रों में fluorophores त्यागें
- स्थानीयकरण परिशुद्धता हिस्टोग्राम से, σ, मतलब स्थानीयकरण परिशुद्धता निकालें.
- Σ के आधार पर विकास के लिए एक अधिकतम स्वीकार्य मूल्य, और शान्नोन-Nyquist criteron 19 गणना, संकल्प सन्निकटन 20 आर में सन्निहित के रूप में = डी =[(2.35σ) 2 (2 डी) 2] 1/2.
- त्रिज्या डी / 2 के एक सर्कल के भीतर / (4D 2) πD 2 की तुलना में कम से घिरे चोटियों को हटाने के लिए "पाम outliers निकालें" उपकरण में पड़ोसियों सीमा निर्धारित करें.
- "पाल प्रतिपादन" उपकरण का उपयोग एक हथेली छवि में संसाधित पाम डेटा परिवर्तित; चित्रा 1 देखें.
- "प्रोफाइल" समारोह का चयन करके आकार और विभाजन यों.
- संबद्ध पंक्ति और तालिका विकल्पों की जाँच करें, और छवि में वांछित दिशा साथ एक रेखा खींचना.
- आधा अधिक से अधिक तीव्रता पर पूर्ण widths के निर्धारण से व्यास यों.
- तीव्रता प्रोफाइल के शिखर से पीक spacings निर्धारण से विभाजन यों.
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Representative Results
चित्रा 1 इमेजिंग और प्रसंस्करण के एक छोर उत्पाद से पता चलता है. यह हथेली छवि में, स्थानीयकृत fluorophores के पार्श्व निर्देशांक केन्द्रक प्रदर्शन मोड का उपयोग कर दिखाए जाते हैं, और जुड़ा DCV के सुपर संकल्प छवि गाऊसी प्रदर्शन मोड का उपयोग कर दिखाया गया है.
चित्रा 2A अनुरूप widefield और टीपीए-Dendra2 व्यक्त विट्रो हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन में एक आठ दिनों की सोमा और समीपस्थ प्रक्रियाओं की हथेली छवियों को दिखाता है. छवियों के महत्वपूर्ण विशेषताएं पारंपरिक और पाम छवियों में puncta के बीच (1) व्यापक, एक से एक पत्राचार, और ओवरलैप करते हैं, शामिल हैं, पाम puncta के (2) काफी छोटे आकार, और एक (3) सामयिक संकल्प कई पाम puncta में एकल widefield बुंदकी.
चित्रा 2B टीपीए-Dendra2 व्यक्त एक दूसरे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन की एक प्रक्रिया का हिस्सा साथ DCVs की एक हथेली छवि को दर्शाता है. महत्वपूर्णइस छवि की विशेषताएं (1) छोटे व्यास, और सजातीय उपस्थिति, puncta के, और बारीकी से apposed puncta / ख्यात DCV समूहों की (2) निराला अवलोकन शामिल हैं.
चित्रा 3 दो या अधिक DCVs एक क्लस्टर शामिल करने के काफी करीब हैं, यह निर्धारित करने के लिए एक सरल मात्रात्मक विधि की रूपरेखा; क्लस्टरिंग प्रचलित है जहां सिस्टम में, वितरण कार्यों के आधार पर और अधिक परिष्कृत तरीके, मात्रा का ठहराव 21 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सरल विधि DCV जुदाई और DCV चौड़ाई यों इस्तेमाल किया जा सकता है (रेखांकन में दिखाया गया है) puncta तीव्रता, की लाइन प्रोफाइल के सृजन पर आधारित है. जुदाई काफी (कथा में चर्चा) चौड़ाई से अधिक है जुदाई लगभग चौड़ाई के रूप में ही है, तो DCVs से संपर्क हो सकता है, जबकि DCVs "संपर्क" नहीं है. इस कसौटी के आधार पर, पैनल में DCVs "नहीं संपर्क में" के रूप में वर्गीकृत किया गया पैनल बी में उन चुनाव में के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जबकि चातुर्य. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम hippocampal न्यूरॉन्स के विकास में extrasynaptic DCVs के संपर्क से जुड़े क्लस्टरिंग पर ~ 8% की ऊपरी ही डाल दिया. हमारे DCV आकार और क्लस्टर डेटा तालिका 1 में संक्षेप हैं.
चित्रा 1. एक DCV (लाल) के एक गाऊसी गाया पाम छवि ओवरले और DCV में निहित व्यक्तिगत photoconverted fluorophores (सफेद डॉट्स) के निर्देशांक दिखा एक केन्द्रक प्रदर्शन मोड पाम छवि. पूर्व मोड के साथ गाऊसी कार्यों के लिए प्रदान की fluorophores प्रदर्शित करता है उनके स्थानीयकरण precisions द्वारा निर्धारित चौड़ाई, और उनके (एक्स, वाई) में स्थानीय डॉट्स के रूप में बाद में प्रदर्शित करता है fluorophores / चोटियों निर्देशांक. बार = 0.1 माइक्रोन.टी = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. ओवरले अभिव्यक्त widefield (हरा) और टीपीए-Dendra2 व्यक्त एक विकासशील हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन की सोमा और समीपस्थ प्रक्रियाओं की हथेली (लाल) छवियों (ए). ओवरलैप के क्षेत्र पीला / नारंगी दिखाई देते हैं. टीपीए-Dendra2 व्यक्त एक और सेल की एक प्रक्रिया का एक छोटा प्रदेश अस्तर DCVs की हथेली छवि (बी). सलाखों = 5 और 2 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. ओवरले ( जुड़े पाम छवि इस एक बिंदी का निराकरण जबकि अभिव्यक्त widefield (हरा) और पाम (लाल) टीपीए-Dendra2 व्यक्त एक विकासशील हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन में puncta की छवियों के ए और बी). दोनों पैनलों में, widefield छवि, एक बड़ी बिंदी से पता चलता है दो बहुत संकरा puncta में. रेखांकन पैनल (बाएं ग्राफ) में और पैनल बी (दाएं) ग्राफ में puncta के लिए प्राप्त तुलनात्मक रूप से रंग कोडित तीव्रता प्रोफाइल दिखाने. ; puncta है कि ~ अपने चरम पीक रिक्ति के 40% आधा अधिक से अधिक तीव्रता पर एक पूर्ण चौड़ाई है कि एक शो के पैनल में पाम छवि से निकाली गई प्रोफाइल के इस प्रकार, इन दो puncta संपर्क में नहीं हैं और एक ख्यात क्लस्टर के रूप में वर्गीकृत नहीं किया गया. इसके विपरीत, puncta अनिवार्य रूप से अपने शिखर से पीक अंतर के रूप में एक ही है कि आधे से अधिक से अधिक तीव्रता पर एक पूर्ण चौड़ाई है कि पैनल बी शो में पाम छवि से निकाली गई प्रोफाइल; इस प्रकार, इन एक ख्यात क्लस्टर के रूप में वर्गीकृत किया गया है. बार = 0.2 माइक्रोन./ 51394fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| प्राचल | परिणाम | विश्लेषण किया DCVs की संख्या |
| क्लस्टर DCVs पर ऊपरी बाध्य | 7.9 ± 5.9% | 618 |
| DCV व्यास मतलब | 77 ± 21 एनएम | 60 |
तालिका 1. DCV आकार और क्लस्टर डेटा सारांश.
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Discussion
पाम और संबंधित सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक हाल ही में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 22-24 का बेहतर से स्थापित रूपों के लिए एक मूल्यवान पूरक के रूप में उभरा है. हथेली के सकारात्मक गुण अपेक्षाकृत सरल नमूना तैयार करने और कम से कम नमूना गड़बड़ी में शामिल हैं. सिद्धांत रूप में, पाम भी जीवित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शायद हथेली के मुख्य नकारात्मक विशेषता काफी जीवित कोशिकाओं में तेजी से गतिशील प्रक्रियाओं की पढ़ाई बाधित जो समय लेने वाली डाटा अधिग्रहण, है. इसके अलावा, पाम अपेक्षाकृत नया है, और इस तरह उपयुक्त, मजबूत fluorophores और नमूना तैयार करने के लिए और डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के पूरी तरह से विकसित और / या 3 दर्ज़ नहीं हैं.
यहाँ हम निश्चित, सभ्य कोशिकाओं में vesicles के एकल रंग, हथेली आधारित अध्ययन के लिए अनुकूल है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. प्रोटोकॉल भी इसी तरह के विकास के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हैनिर्देशित, दोहरी रंग पाम पढ़ाई. हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता हमारे पाम डेटा की दो प्रमुख गुण द्वारा समर्थित है. सबसे पहले, हमारे खंगाला पाम, और पूरक widefield, छवियों में puncta के वितरण के समान है. वितरण में एक महत्वपूर्ण अंतर - पाम द्वारा कई puncta में विवर्तन सीमित puncta के सामयिक संकल्प - हथेली के स्पष्ट रूप से बढ़ाया संकल्प को दर्शाता है और आगे तकनीक की प्रभावकारिता और उपयोगिता को रेखांकित करता है.
दूसरा, हमारे ताड़ के परिणाम अन्य प्रासंगिक परिणाम के साथ लगातार अच्छा समझौते में हैं, और / या. उदाहरण के लिए, ईएम का उपयोग कर प्राप्त hippocampal न्यूरॉन्स की छवियों कभी कभी DCVs के माध्यम से स्लाइस प्रकट, और स्लाइस से deduced DCV व्यास ~ 70-100 एनएम 11 है. हमारे ताड़ के डेटा और ईएम डेटा के बीच उल्लेखनीय समझौता दोनों तरीकों के लिए आश्वस्त करता है. पाम अभी भी परीक्षण किया जा रहा है, और उन्हें आम तौर पर अपेक्षित कठोर नमूना तैयार करने के बारे में चिंता का विषय है. इसी तरह,DCVs को लक्षित हरे और लाल काइमेरा coexpressing hippocampal न्यूरॉन्स रहने का विवर्तन सीमित फिल्में ओवरलैपिंग हरे और लाल puncta लगातार comovement 25 गुजरना बताते हैं कि. इस परिणाम का सबसे सरल व्याख्या - लाल और हरे रंग का संकेत है वही DCV से उठता है - विवर्तन सीमित puncta घने व्यक्ति DCVs का प्रतिनिधित्व करते हैं जो यह दर्शाता है पाम, के साथ संगत है. Comovement की एक कम सीधा व्याख्या - लाल और हरे रंग का संकेत संकुल DCVs से उठता है - मोटे तौर पर पाम द्वारा अवैध है.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य सकारात्मक गुण है. (1) पुटिका photoconvertible या photoactivatable fluorophores के साथ लेबल किया जाना चाहिए, और (2) तय कोशिकाओं सर्वश्रेष्ठ जलीय मीडिया में बढ़ रहे हैं: विशेष रूप से, नमूना तैयार अपेक्षाकृत सरल और दो उल्लेखनीय अपवाद के साथ, पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए कि अनुकूल करने के लिए काफी समान है. इस रिश्तेदार simpliciTy प्रयोगों कम कर रहे हैं, और इस तरह के नमूने 26 मुश्किल हो सकता है, जो (बहाव सुधार की सुविधा के लिए) असंदिग्ध मोती के साथ लेबल होने की जरूरत नहीं है कि इस तथ्य को दर्शाता है. इसके अलावा, पुटिका आमतौर पर कई fluorophores के साथ टैग कर रहे हैं; इस प्रकार, पर्याप्त fluorophore लेबलिंग घनत्व को प्राप्त सीधा है. इसके विपरीत, अन्य संरचनाओं के लिए, इस 3 काफी मुश्किल हो सकता है. छवि अधिग्रहण भी अपेक्षाकृत सरल है. हालांकि, पाम पाम संकेतों आंतरिक रूप से बहुत कमजोर हैं क्योंकि महंगे और अत्याधुनिक हैं कि इलेक्ट्रॉनिक और ऑप्टिकल घटकों की आवश्यकता होती है.
शायद सबसे परिष्कृत प्रोसेसिंग, विश्लेषण, और पाम छवियों का प्रदर्शन चारों ओर हथेली केंद्र के पहलुओं. यहां डाला, हथेली के इन पहलुओं को लागू करने के संकल्प और स्थानीयकरण परिशुद्धता के बीच नमूना और संकल्प के बीच के रिश्ते, और गौरव सहित कई सूक्ष्म मुद्दों की समझ की आवश्यकता है. इस प्रकार, कुल मिलाकर, पाम हैtudies सदा ही काफी जटिल हैं, लेकिन यह महत्वपूर्ण होने की संभावना है कि संकल्प वृद्धि से संतुलित है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम है, (बास) 2 R15 GM061539-02 अनुदान (jel) 2 R15 NS40425-03, महाराष्ट्र 66,179 (ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय / OHSU के डॉ. गैरी बैंकर के) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित है, और P30 गया था NS061800 (OHSU के डॉ. मुकदमा Aicher के लिए). हम hippocampal न्यूरॉन्स की संस्कृति के साथ व्यापक समर्थन के लिए बारबरा Smoody धन्यवाद, और डीआरएस. इस पांडुलिपि की एक महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ब्रायन लंबी और जेम्स Abney.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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