Summary
Vi beskriver hur man ska genomföra photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)-baserade studier av blåsor i anläggningstillgångar, odlade nervceller. Viktiga komponenter i våra protokoll omfattar märknings blåsor med photoconvertible chimärer, samla råbilder glest samplade med en super-upplösning mikroskopi systemet, och bearbetar råbilder för att producera en super-upplösning.
Abstract
Upptäckt av fluorescens är grunden för många allmänt utnyttjade och snabbt framryckande mikroskopi tekniker som används i moderna biologiska och medicinska tillämpningar. Styrkor med fluorescens inkluderar dess känslighet, specificitet, och kompatibilitet med levande bilder. Tyvärr, konventionella former av fluorescensmikroskopi lider av en stor svaghet, diffraktion-begränsad upplösning i bildplanet, vilket försvårar studier av strukturer med dimensioner mindre än ~ 250 nm. Nyligen har denna begränsning övervunnits med införandet av super-upplösning fluorescens mikroskopi tekniker, såsom photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Till skillnad från sina konventionella motsvarigheter, kan PALM producera bilder med en lateral upplösning på tiotals nanometer. Det är alltså nu möjligt att använda fluorescens, med dess otaliga starka sidor, för att belysa ett spektrum av tidigare otillgängliga attribut av cellstruktur och organisation.
_content "> Tyvärr är PALM inte trivialt att genomföra, och framgångsrika strategier ofta måste anpassas till den typ av system som studeras. I den här artikeln visar vi hur man ska genomföra enfärgade PALM studier av vesikulära strukturer i fasta, odlade nervceller. PALM är idealisk för studier av blåsor, som har dimensioner som vanligtvis sträcker sig från ~ 50-250 nm. Viktiga steg i vår strategi ingår att märka nervceller med photoconvertible (grönt till rött) chimärer av vesikler last, samla in råbilder med ett glest samplade super-upplösning mikroskopi systemet, och bearbetning av RAW-bilder för att producera en högupplöst PALM bild. Vi visar också effekten av vår strategi genom att presentera ovanligt väl-upplösta bilder av tät-core vesikler (DCVs) i odlade hippocampus nervceller, vilket motsäger hypotesen att extrasynaptic handel med DCVs förmedlas till stor del av DCV kluster.Introduction
Ett antal cellulära processer är beroende av en noggrann och effektiv vesikel-medierad trafficking av biomolekyler till specifika subcellulära destinationer. Ett framträdande exempel är synaptiska församling, som föregås av långa varierade, vesikler-medierad leverans av synaptiska beståndsdelar från områden med biogenes i neuronala soma till potentiellt distala pre-och postsynaptiska platser 1.
Fluorescensmikroskopi är en kraftfull och populär metod för att studera vesikler människohandel. Styrkor med tekniken inkluderar dess känslighet, specificitet, och kompatibilitet med levande avbildning 2. Tyvärr har fram till relativt nyligen har tekniken led av en stor svaghet, diffraktionsbegränsad upplösning 2, vilket hämmar studier av strukturer med dimensioner mindre än ~ 250 nm. Nyligen, lateral upplösning i fluorescensmikroskopi överträffade diffraktion barriären med införandet av super-upplösning fluorescens milcroscopy tekniker, såsom PALM 3. Den laterala upplösning PALM, tiotal nanometer, är idealisk för studier av blåsor, som har dimensioner som vanligtvis sträcker sig från ~ 50-250 nm 4. Det är alltså nu möjligt att använda fluorescens, med dess otaliga starka sidor, för att belysa ett spektrum av tidigare otillgängliga attribut av blåsor, inklusive vissa aspekter av sin handel till specifika subcellulära webbplatser.
PALM är inte trivialt att genomföra, och framgångsrika strategier ofta måste anpassas till den typ av system som studeras. Här beskriver vi hur man genomför PALM studier av vesikulär strukturer, och vi demonstrera effektiviteten av vår strategi för fallet DCVs i hippocampus nervceller. Framför allt använder vi PALM att ta upp hypotesen att handel med DCVs till synapser i hippocampus nervceller förmedlas av DCV kluster 5-8.
Cluster-medierad handel med blåsor på synapser i utvecklings neurons är en spännande möjlighet för att det kan underlätta en snabb synaptiska stabilisering och montering 9,10. Förespråkare för klustrade handel med DCVs citerar den stora skenbara storleken på extrasynaptic fluorescerande puncta hyser exogen DCV last som bevis för klustring 6. Dessa puncta visas i bilder som genereras med hjälp av diffraktion-begränsad fluorescens mikroskopi tekniker, som inte är anpassade till utmärkstorlekseffekter till följd av diffraktion från de som följer av klustring.
Lös problemet, samlas vi konventionell widefield fluorescens och PALM bilder av hippocampus nervceller som uttrycker chimärer riktade till DCVs. Analys av dessa bilder visade att> 92% av den förmodade extrasynaptic DCV kluster i konventionella bilder löses som 80 nm (individuell DCV stora) 11 puncta i PALM bilder. Således är dessa uppgifter till stor del ogiltig kluster hypotesen som tillämpas på DCVs att utveckla hippocampal neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning
- Förbered DNA som kodar en photoconvertible eller fotoaktiverbar chimären riktad till DCVs, med användning av molekylärbiologiska standardtekniker.
OBS: En möjlighet är DNA som kodar en vävnadsplasminogenaktivator-Dendra2 chimär (tPA-Dendra2). Dendra2 är en photoconvertible protein som växlar från grönt till rött utsläpp vid exponering för ultraviolett ljus 12. - Kultur hippocampus neuroner på högpresterande # 1,5 täckglas för ~ 5-10 dagar, efter standardprotokoll 13.
- Transfektera utveckla hippocampus nervceller med hjälp av en katjonisk lipid reagens.
Anm: Viral förmedlad infektion är mer effektivt för mogna neuroner. Detta alternativa tillvägagångssätt har beskrivits i detalj på annat håll 14.- Bered en 1,5 ml rör innehållande ~ 1 ^ g av DNA och 250 | il av minimalt essentiellt medium (MEM) och en andra 1,5 ml rör innehållande 4 | il av katjonisk lipid-reagens och 250 ^ ilMEM.
- Inkubera lösningar för 5 min.
- Kombinera de två lösningarna och inkubera den resulterande blandningen under ytterligare 30 min.
- Under inkubationen bereds en skål innehållande flera ml odlingsmedium värmdes till 37 ° C.
- Överföra försiktigt täckglas innehållande nervceller i skålen som innehåller varmt medium och tillsätt transfektion blandningen.
- Vippa skålen försiktigt och placera det i en inkubator vid 37 ° C under 90 min.
- Återgå nervceller att deras "hem skålen" och vänta ~ 12-18 timmar.
- Fix celler för 45 min i 4% paraformaldehyd / 4% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) värmdes till 37 ° C.
OBS: I PALM experiment, är det viktigt att uppnå god konservering av ultrastrukturen, och standard formaldehyd fixeringsprotokoll som används för immunofluorescensfärgning är vanligtvis inte tillräckligt 15. En viktig orsak till dålig strukturell konservering är otillräcklig fixation tid eftersom formaldehydfixering innebär adduktbildning och proteintvärbindning, och den senare processen är ganska långsam 16. En 45 min fixering hjälper till att minska detta problem med någon påvisbar overfixation-inducerad förlust av fluorescens. - Tvätta täckglas ~ 10x med filtrerad PBS.
OBS: Detta minskar fluorescerande föroreningar. Bild prover relativt snabbt efter fixering. I delårs, lagra celler vid 4 ° C i filtrerad PBS i en ljustäta behållare. - Montera täckglas innehållande nervceller i en kammare i filtrerad PBS.
OBS: Provet måste monteras i ett vattenbaserat medium, liksom PBS, med brytningsindex lägre än glas, för att genomföra total inre reflektion fluorescens (TIRF)-baserad belysning. TIRF-baserad belysning är mycket användbart eftersom endast täcka slip-proximala fluoroforer är glada, och det finns en stor tillhörande nedgång i bakgrundsfluorescens 17.
2. Image Acquisition </ P>
- Slå på superupplösning bildsystem.
- Sätt på bågen lampan.
- Vänd på "systemet / st" och "komponent" växlar (på strömmen fjärrbrytare) till "den."
- Slå på datorn (efter mikroskopkontroll tabletten / dockningsstation tänds).
Observera: Dockningsstationen kan användas för att styra och övervaka många attribut optiken och ljusbanan, särskilt val av objektiv och fokus. - Dubbelklicka på ikonen för programvaran och välj "start-systemet" i inloggningsdialogen.
- Undersök provet.
- Öppna den främre och övre paneler på lasersäkerhet skåpet.
- Luta genomlysning armen för att komma åt scenen och mål.
- Sätt olja på alfa Plan-Apochromat 100X numerisk bländare / NA = 1,46 (TIRF) mål.
Anmärkning: En 63X stor NA objektiv kan användas i stället för den 100X. - Montera provet på scenen, och höja the mål mot provet.
- Övervaka linspositionen med XYZ funktion av dockningsstationen. Stanna när objektivet är i ballpark i fokus (t ex z ~ 2,50 mm).
- Helt stänga åtkomstpaneler.
OBS: För att aktivera lasersäkerhet. - Finjustera fokus med okularen och knappar på fliken lokalisera.
Obs: Fliken lokalisera ger tillgång till knappar som producerar båglampa baserad belysning och underlättar direkt observation av provet med okularen. Likaså ger fliken förvärvet tillgång till verktyg som producerar laserbaserad belysning och underlättar ta bilder med kameran.- Gå till fliken lokalisera, välj "Trans On."
- Klicka på den okulära expansionssymbolen.
OBS: Detta tar upp ett schema av ljusstrålen. Attribut för den lätta vägen kan ändras genom att vänsterklicka lämpliga ikoner i schemat eller genom att använda pekskärmen på dockningsstationen. Till exempel kan ett filterlämpar utsläpp från Dendra2 kan väljas med hjälp av ikonen reflektorn revolver. - Titta i okularen och föra cellerna i fokus med hjälp av dockningsstationen som guide.
OBS: Provet kommer att vara mycket glest befolkat med fluorescerande celler eftersom hippocampus nervceller är svåra att transfektera, och det därför kan vara lite knepigt att fokusera med reflekterat ljus. Om så är fallet, använd överförd belysning och z läsning av dockningsstationen som guide. - Växla ljuset "Off" efter fokusering.
- Identifiera en cell som är ganska ljus, uppvisar punktformig fluorescens, och har en klassisk morfologi som är ett tecken på god hälsa.
- Välj reflekterat ljus och filtret lämpar grön emission från Dendra2.
- Skanna locket glida för celler som uttrycker Dendra2 chimärer använder låg intensitet excitation ljus.
- Växla till acquisition fliken.
- Använd "experimentet manager" för att ladda en PALM förvärvs konfiguration som på lämpligt sätt är konstruerad eller lätt modifierad.
OBS: Om ingen sådan experiment finns, utforma en start experimentell konfiguration med följande inställningar som guide: Laser power sliders: 405 nm (~ 0,01% för en 50 mW laser); 488 nm (~ 3% för en 100 mW laser); 561 nm (~ 40% för en 100 mW laser); Exponeringstid: ~ 50 ms; Kameravinst: ~ 200; Multidimensional förvärv: tidsserier (cykler = 30.000, intervall = 0); Spår: 488 nm med epi-belysning, och 561 nm med TIRF-baserad belysning (se steg 2.5.1); Mål: 100X (NA = 1,46); Reglaget TIRF vinkel: infallsvinkel ~ 67-72 °; Pixelstorlek: 100 nm; Synfält: TIRF (de alternativa val ge högre laser intensitet och används för fluoroforer som är svårare att bleka). - Klicka på "Ja" när ett popup-meny visas med en fråga om att byta på lasrar.
- Använd "experimentet manager" för att ladda en PALM förvärvs konfiguration som på lämpligt sätt är konstruerad eller lätt modifierad.
- Ta bildenav cellen i fokus på kameran planet.
- Välj 488 nm epi-belysning laser spår.
Obs: Spår är beam konfigurationer som används under avbildning. Här används spårnamnen bestäms av excitationsvåglängd som producerar utsläpp som överförs till kameran. Exempelvis använder 561 nm spår både 405 och 561 nm laserlinjer, men filtret kuben passerar endast utsläpp från photoconverted Dendra2 upphetsad av 561 nm ljus till kameran. - Fokusera bilden av cellen på kameran med hjälp av "kontinuerliga" förvärvs knappen.
- Välj 488 nm epi-belysning laser spår.
- Samla en konventionell widefield bild.
- Använd "Snap"-knappen.
- Spara bilden genom att gå till menyn "Arkiv" och välja "spara / spara som."
- Ställ upp TIRF baserad belysning.
- Välj det 488 spår och växla till "TIRF" med hjälp av EPI / TIRF knappen.
- Välj "kontinuerligt" förvärv.
- Justera than TIRF-baserade reglaget belysning.
OBS: TIRF uppnås när det finns en plötslig mörkare bakgrund och provet kan fokuseras i ett plan 18. Om nya funktioner blir uppenbara genom att fokusera upp i provet, är infallsvinkeln för låg på grund i TIRF det bara finns en plan fokus. - Dubbelkolla TIRF vinkeln med hjälp av 561 spår med 405 nm laser "off."
- Vrid 405 nm laser back "på" innan du startar en PALM experiment.
- Samla PALM data.
- Hit "start experiment."
Obs: Om så önskas, öppnar du fliken "online-bearbetningsalternativ" och kolla "online-bearbetning PALM" och "Fit Gauss2D" (innan försöket) att övervaka rekonstruerade PALM bilden under insamling av rådata. Detta kommer att underlätta bedömningen av uppgifternas kvalitet, och därmed värdet av att fortsätta den relativt tidskrävande datainsamlingsprocessen. - Visuelltövervaka photoconversion.
- Öka intensiteten i 405 nm (photoconverting) laser när Dendra2 photoconversion avtar (typiskt efter förvärv av ~ 10.000 råbilder).
- Fortsätta försöket om photoconversion ökar. Annars avbryta experimentet (utan förlust av data) genom att trycka på "stop" nuvarande steg-knappen.
- Spara bilderna när datainsamlingen är klar (efter ~ 15 min).
- Hit "start experiment."
3. Bildbehandling, Display, och analys
- I avsaknad av online-bearbetning, bearbeta råbilder som sparats på hårddisken.
- Klicka på fliken bearbetning, öppna fliken metoden, och välj "PALM."
- Välj "PALM" igen från de fyra underalternativ.
- Gå till Arkiv-menyn, öppna och visa filen av intresse, och klicka på "Välj".
- Hit "gälla."
OBS: Detta kommer att inleda topp / fluoroforen fynd och topp lokalisering med standard options. Om det behövs, toppar också kan grupperas med hjälp av fliken "PAL-koncernen". Gruppering delar toppar som visas i flera på varandra följande ramar till en enda molekyl om topp koordinaterna är tillräckligt lika. Dessutom kan uppgifterna korrigeras för prov avdrift använder programmet modellbaserad drift justeringsalternativ.
- Filtrera bort dåligt lokaliserade och dåligt samplade komponenter i topp-lokaliserade data.
- Släng fluoroforer med lokaliserings precisering, σ,> 35 nm med hjälp av "PAL-filter" verktyg.
- Släng fluoroforer i områden där medelavståndet mellan toppar, d, är för stor för att lösa vesiklar diameter, D.
- Utdrag medel lokalisering precision, σ, från lokaliserings precision histogrammet.
- Beräkna ett högsta godtagbara värdet för d baserat på σ, och Shannon-Nyquist criteron 19, som kommer till uttryck i resolutionen approximation 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
- Ställ in tröskelvärdet på "Remove PALM outliers" verktyg för att ta bort toppar omgivna av färre än πD 2 / (4d 2) grannar inom en cirkel med radien D / 2.
- Konvertera den bearbetade PALM data i en PALM bild med "PAL-rendering" verktyg; se figur 1.
- Kvantifiera storlekar och separationer genom att välja "Profil"-funktion.
- Kontrollera den tillhörande linjen och bordsalternativ, och dra en linje längs önskad riktning i bilden.
- Kvantifiera diametrar genom att bestämma fulla bredd vid halv maximal intensitet.
- Kvantifiera separationer genom att bestämma topp-till-topp avstånd av intensitetsprofiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en slutprodukt för bildframställning och bearbetning. I detta PALM bild är sido koordinater lokaliserade fluoroforer visas med hjälp av tyngdvisningsläge, och super-upplösning av intresse DCV visas med hjälp av Gauss-visningsläge.
Figur 2A visar analog widefield och PALM bilder av soma och proximala processer för en åtta dagar in vitro hippocampus neuron som uttrycker tPA-Dendra2. Viktiga funktioner i bilderna inkluderar (1) omfattande, en-till-en korrespondens, och överlappning mellan puncta i de konventionella och PALM bilder, (2) betydligt mindre storlek PALM puncta, och (3) tillfällig upplösning av en enda widefield punctum i flera PALM puncta.
Figur 2B visar en PALM bild av DCVs längs en del av en process för en andra hippocampus neuron som uttrycker tPA-Dendra2. Viktigtfunktioner i den här bilden inkluderar (1) liten diameter, och homogent utseende, av puncta, och (2) sällan observation av nära apposed puncta / förmodade DCV kluster.
Figur 3 beskriver en enkel kvantitativ metod för att bestämma om två eller flera DCVs är tillräckligt nära för att bestå av ett kluster; i system där klustring är utbredd, mer sofistikerade metoder, som bygger på fördelningsfunktioner, kan användas för kvantifiering 21. Den enkla metoden bygger på att skapa linje profiler av puncta intensitet (som visas i diagrammen), som kan användas för att kvantifiera DCV separation och DCV bredd. Om separering överstiger bredden signifikant (såsom diskuteras i legenden), de DCVs inte "kontakt", medan om separationen är ungefär densamma som bredden, kanske de DCVs kontakta. Utifrån detta kriterium var DCVs i panel A klassas som "inte är i kontakt", medan de i fält B klassificerades som i kon takt. Med hjälp av denna metod, sätter vi en övre gräns på ~ 8% på kontakt-associerad klustring av extrasynaptic DCVs utveckla hippocampus nervceller. Vårt DCV storlek och kluster uppgifter sammanfattas i tabell 1.
Figur 1. Overlay av en Gauss-renderade PALM bild av en DCV (röd) och en centroid-visningsläge PALM bild som visar koordinaterna för enskilda photoconverted fluoroforer (vita prickar) som finns i DCV. Den tidigare läget visar fluoroforer utfört åt Gaussiska funktioner med bredder bestäms av deras lokalisering precisioner, och de senare visar fluoroforer / toppar som prickar lokaliserade vid sin (x, y)-koordinater. Stav = 0,1 | im.t = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Overlay (A) i summerade vidvinkel (grön) och Palm (röd) bilder av soma och proximala processer i ett utvecklings hippocampus neuron som uttrycker tPA-Dendra2. Regioner överlappning verkar gul / orange. PALM bild (B) av DCVs bekläder en subregion av en process i en annan cell som uttrycker tPA-Dendra2. Bars = 5 och 2 ìm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Överlägg ( A och B) av summerade vidvinkel (grön) och Palm (röd) bilder av puncta i ett utvecklings hippocampus neuron som uttrycker tPA-Dendra2. I båda panelerna, visar widefield bilden en enda stor punctum, medan den tillhörande PALM bilden löser denna enda punctum i två mycket smalare puncta. Diagrammen visar analogt färgkodade intensitetsprofiler som erhållits för puncta i panelen A (vänstra diagrammet) och i fält B (högra diagrammet). Profilerna som härrör från PALM bilden i panel A visar att puncta har en full bredd vid halv maximal intensitet som är ~ 40% av deras topp-till-topp-avstånd; alltså, dessa två puncta inte är i kontakt och inte klassas som en förmodad kluster. Däremot profilerna härledda från PALM bilden i panel B visar att den puncta har en full bredd vid halv maximal intensitet som är väsentligen densamma som deras topp-till-topp-avstånd; sålunda dessa klassificerades som en förmodad kluster. Stav = 0,2 | im./ 51394fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
| Parameter | Resultat | Antal DCVs analyserade |
| Övre gräns för klustrade DCVs | 7,9 ± 5,9% | 618 |
| Medelvärde DCV diameter | 77 ± 21 nm | 60 |
Tabell 1. DCV storlek och klusteruppgifter sammanfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM och tillhörande super-upplösning fluorescens mikroskopi tekniker har nyligen dykt upp som ett värdefullt komplement till mer etablerade former av optisk mikroskopi och elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positiva attribut PALM innefattar relativt enkel provberedning och minimal prov störning. I princip är också PALM kan användas för att studera levande celler. Förmodligen den viktigaste negativa attribut av PALM är tidskrävande datainsamling, vilket avsevärt försvårar studier av snabbare dynamiska processer i levande celler. Dessutom är PALM relativt ny, och därmed lämpligt robusta fluoroforer och protokoll för provberedning och för datainsamling och analys är inte fullt utvecklade och / eller dokumenterad 3.
Här har vi beskrivit ett protokoll som lämpar sig för enfärgade, PALM-baserade studier av blåsor i fasta, odlade celler. Protokollet är också en bra utgångspunkt för att utveckla på samma sättriktade, tvåfärgad PALM studier. Effekten av våra protokoll stöds av två viktiga egenskaper hos våra PALM data. För det första är fördelningen av puncta i vår rekonstruerade PALM, och kompletterande widefield, bilder mycket lika. I en signifikant skillnad i distributionen - tillfällig lösning av diffraktionsbegränsad puncta i flera puncta av PALM - reflekterar markant förbättrad upplösning av PALM och ytterligare understryker teknikens effektivitet och nytta.
För det andra, våra PALM resultat är i god överensstämmelse, och / eller konsekvent, med andra relevanta resultat. Till exempel, bilder av hippocampus nervceller som erhållits med hjälp av EM avslöjar ibland skivor genom DCVs och DCV diametern härledas från skivorna är ~ 70-100 nm 11. Den märkliga avtal mellan vår PALM uppgifter och EM uppgifter är betryggande för båda metoderna. PALM fortfarande testas, och EM är i allmänhet föremål för oro erforderlig hårda provberedning. På liknande sättdiffraktion-begränsad filmer av levande hippocampus nervceller samuttrycker gröna och röda chimärer riktade till DCVs visar att överlappande gröna och röda puncta genomgår ihållande comovement 25. Den enklaste tolkningen av detta resultat - de röda och gröna signaler härrör från samma DCV - är förenlig med PALM, vilket visar att diffraktionsbegränsad puncta väldigande representera enskilda DCVs. En mindre rättfram tolkning av comovement - de röda och gröna signaler uppstår klustrade DCVs - till stor del motsägs av PALM.
Protokollet som beskrivs här har andra positiva egenskaper. Framför allt är provberedning relativt enkelt och ganska lik den lämpad för konventionell fluorescensmikroskopi, med två viktiga undantag: (1) vesiklar måste märkas med photoconvertible eller fotoaktiverbara fluoroforer, och (2) fixerade cellerna bäst monterade i vattenbaserade medier. Denna relativa Simplicity återspeglar det faktum att experimenten är korta, och därför prover inte behöver märkas med referenspunkternas kulor (för att underlätta driftkorrigering), vilket kan vara svårt 26. Dessutom brukar blåsor är taggade med många fluoroforer; därmed uppnå tillräcklig fluoroforen märkning tätheten är okomplicerad. I kontrast till andra strukturer, kan detta vara ganska svårt 3. Bild Förvärvet är också relativt enkelt. Dock gör PALM kräver elektroniska och optiska komponenter som är dyra och banbrytande eftersom PALM signaler är i sig mycket svag.
Förmodligen den mest sofistikerade aspekterna av PALM centrum kring bearbetning, analys och visning av PALM bilder. Som lyfts fram här, att genomföra dessa aspekter av PALM kräver en förståelse av flera subtila frågor, bland annat sambandet mellan provtagning och upplösning, och skillnaden mellan upplösning och lokalisering precision. Således, totalt sett, PALM studies alltid är ganska invecklad, men det uppvägs av upplösningsförbättring som sannolikt kommer att vara betydande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag 2 R15 GM061539-02 (till BAS), 2 R15 NS40425-03 (till JEL), MH 66179 (till Dr Gary Banker i Oregon Health & Science University / OHSU), och P30 NS061800 (Dr Sue Aicher av OHSU). Vi tackar Barbara Smoody för omfattande stöd med den kultur av hippocampus nervceller, och Dr. Brian Lång och James Abney för en kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science Publishing. (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
