Protocol
1. Beredning av lösningar för Cellular pH kalibrering
- Lägg följande föreningar till fem separata 50 ml koniska rör för att framställa fem lösningar som skall användas för kalibrering:
- NaCl (1 ml av 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g i 10 ml H 2 0)
- KCl (6,75 ml av 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g i 10 ml H 2 0)
- Glukos (1 ml av 1 M D-glukos) (1 M D-glukos = 1,80 g i 10 ml H 2 0)
- MgS0 4 (0,05 ml 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g i 10 ml H 2 0)
- 20 mM HEPES (1 ml av 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g i 10 ml H 2 0)
- CaCl2 (0,05 ml 1 M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g i 10 ml H 2 0)
Förbered alla lösningar i dubbeldestillerat H2O (DDH 2 O).
- Avsluta varje lösning med 35 ml DDH 2 O och blanda med en magnetomrörare tills sålution uppnås.
- Justera pH-värdet hos varje lösning med 1 N KOH eller 1 N HCl för erhållande av pH-värden av 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 och 7,5. Därefter, justera volymen med avjoniserat vatten till en slutlig volym på 50 ml.
- Åtgärd 5 mg nigericin och lägga till 670 l av absolut EtOH för att förbereda en 10 mM nigericin stamlösning.
Varning: nigericin är mycket giftigt och måste hanteras med stor försiktighet (handskar, skyddsglasögon och mask). Blanda lösningen genom inversion tills nigericin är helt upplöst. - Lägg till 0,05 ml 10 mM nigericin (slutlig koncentration 10 ^ M) till varje kalibreringslösning. Nigericin är en jonofor som ökar cellmembranets permeabilitet och orsakar ekvilibrering av intracellulära och extracellulära pH-värdet i närvaro av ett depolariserande koncentration av extracellulära K ^.
- Kalibreringslösningar kan lagras upp till 1 månad vid 4 ° C
2. Cellberedning
- Enligt en biologisk Safety huv, utsädes celler i 35 mm x 10 mm odlingsskålar i 2 ml tillväxtmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och antibiotika. Använd mängd celler som behövs för att se till cirka 50% konfluens efter 24 timmar.
OBS: I våra experiment använder vi HT-1080 cellinje och platta 1 x 10 5 celler per odlingsskål. - Bestäm antalet av odlingsskålar som behövs för experimentet och plattan 5 ytterligare odlingsskålar som skall användas för kalibrering.
- Place odlingsskålar i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator under minst 24 tim.
3. Beredning av pH-avkännande sonder
- Bered en 1 M stamlösning av fluorescerande pH-sond 8-hydroxipyren-1, 3,6 trisulfonsyra, trinatriumsalt (HPTS / pyranin) i DDH 2 0. Denna lösning ska förvaras vid rumstemperatur och skyddas från ljus.
- Bered en förrådslösning av 1 mM 5 - (och-6)-karboxyl seminaphthorhodafluor acetoximetylester acetat (C-Snarf-01:00; kallas Thereafter Snarf-1) genom upplösning av 1 mg av snarf-1 i 1,76 ml DMSO. Blanda noggrant genom upprepad pipettering. Snarf-1-lösning måste lagras vid -20 ° C och skyddas från ljus.
4. Cellmärkning
- Sexton timmar innan live-cell imaging, tillsätt 2 l av 1 M HPTS stamlösning (slutlig koncentration 1 mM) till varje odlingsskål innehållande 2 ml komplett medium.
- Returnera kultur rätter till inkubatorn. Den HPTS proben är cell-ogenomträngligt, därför att märka organ sonden måste tas upp av pinocytos. Detta villkor innebär att cell inkubationer med HPTS utförs i serum-kompletterat odlingsmedium.
- Efter inkubation med HPTS, tvätta cellerna två gånger med steril PBS och tillsätt 2 ml av serumfritt medium under åtminstone 2 timmar. Inkubation med Snarf-1 behöver utföras i serumfritt medium, eftersom serum kan förhindra upptag av sonden.
- Tillsätt 10 | il av en 1 mM Snarf-en förrådslösning för erhållande av en final koncentration av 5 pM och tillåta cellerna att inkubera i 20 min vid 37 ° C under svagt ljus. C-snarf-1-koncentration och tid för inkubation kan variera beroende på celltyp.
- Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna två gånger i steril PBS och tillsätt 2 ml av serumfritt medium.
5. Tillsats av pH-modulatorer
- För att bedöma om metoden kan detektera pH-förändringar i celler, kan olika reagens som modulerar intracellulära pH användas:
- Bafilomycin A1, en specifik hämmare av V-ATPas 5
- Na + / H + växla isoform 1 (NHE-1) 6
- NH4CI, en svag bas, som ökar intracellulärt pH 7
- Framställ stamlösningar av de reagens som nämnts ovan:
- Bafilomycin A1: tillsätt 10 mikrogram av bafilomycin A1 till 160 l av DMSO för att få en stamlösning av 100 ^ M
- EIPA: tillsätt 25 mg EIPA till 1,67 ml metanol till obtaina slutkoncentration av 50 mM
- NH4CI: Lös 0,53 g ammoniumklorid i 10 ml DDH 2 O för erhållande av en slutkoncentration av 1 mM.
Obs: Alla stamlösningar måste hållas vid 4 ° C utom bafilomycin A1 som måste lagras vid -20 ° C och skyddas från ljus. - I separata kultur rätter, tillsätt en av de reagenser som beskrivs nedan:
- 2 l av 100 ^ M bafilomycin A1 (slutlig koncentration 100 nM)
- 1 pl av 50 mM EIPA (slutlig koncentration 25 pM)
- 40 | il av 1 M NH4CI (slutlig koncentration 20 mM)
- Inkubera cellerna under 30 min vid 37 ° C.
- Gå vidare till bildtagning.
6. Specifikationer för Live-cell imaging Mikroskop och Förvärvs inställningar
- Utför live-cell imaging med en 40X objektiv monterat på en spektral inverterad scanning konfokal microscope utrustad med en motoriserad XY skede, en kammare som rymmer glas botten kultur rätter på ett miljömässigt kontrollerat (temperatur, fuktighet, CO2) stadium inkubator.
- Den konfokala instrumentet (Olympus FV1000) som används här är utrustad med:
- En diodlaser 405 nm
- En 40 mW argonlaser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
- En heliumneonlaser (543 nm)
- Fluorit 10X objektiv, NA0.4
- En LUCPLFLN 40X objektiv, NA0.60
- En PLAPONSC PLAN APO 60X olja målet, NA1.4
- En dikroisk spegel DM 405/458/488/543
- En SDM 560 och en SDM 640 tvåfärgsfilter
- En BA655-755 spärrfilter
- En stråldelare BS20/80
- Dataanalys programvara för bildtagning och analys,
- När scenen inkubatorn har värmts upp till 37 ° C och mikroskopet sätts upp, placera en odlingsskål som tidigare odlades med HPTS och Snarf-1 in i konfokala scenen avbildning kammaren.
- ETTfter att lokalisera ett område av intresse, justera förvärvsprograminställningar Figur 1.
- Ställ in två virtuella kanaluppsättningar.
- Initiera den första fasen som motsvarar HPTS excitation vid 405 nm och emissionsuppsamlings vid 505-525 nm och Snarf-1 excitation vid 543 nm och emissionsuppsamlings vid 570-600 nm.
- Inleda den andra fasen som motsvarar HPTS excitation vid 458 nm och emissionsuppsamlings vid 505-525 nm och Snarf-1 excitation vid 543 nm och emissionsuppsamlings vid 640-650 nm.
- Den konfokala bländaren är inställd på 175 nm som standard och optimal bländare måste manuellt satt till 300 um.
- Ta bild genom att stapla serie horisontella optiska sektioner (800 x 800 pixlar) med 0,4 ìm tjocklek.
OBS: En 40X objektiv är bra att observera flera celler samtidigt och fungerar bra för organell visning. Emellertid rumslig upplösning och signalintensitet är better uppnås med en 60X olje mål. Dessutom finns det ingen excitation eller överhörning utsläpp mellan de två färgämnena.
7. Kalibrering av pH-avkännande sonder
- Innan kalibrering, ta bort mediet från odlingsskålen tidigare odlades med HPTS och Snarf-1, tvätta två gånger med sterilt PBS och tillsätt sedan 2 ml av en av de fem kalibreringslösningar.
- Placera kulturen skålen i konfokala scenen kammaren.
- Gå vidare till tidsförlopp bild förvärv i enlighet med följande inställningar:
- Ställ in antalet bilder och intervallvaraktighetstider för experimentet.
OBS: Vi använder typiskt en 1 minuters intervall mellan bilder i upp till 30 min. - Programmera slutaren för att stänga mellan förvärvet av varje bild.
- Ställ in antalet bilder och intervallvaraktighetstider för experimentet.
- Spela in fluorescensintensiteten per minut i ett kalkylprogram och bestämma tid när fluorescensintensiteten är stabil. Intracellulära pH är vanligen stabil efter 15 - 20 minuter.
- REPEAT steg från 7,1 till 7,4 med hjälp av en ny kultur maträtt för varje återstående kalibreringslösning.
8. Datainsamling
- När kalibreringen har gjort, skaffa exempeldata 4-5 slumpmässigt valda områden som innehåller 15-20 celler per fält. Två bilder erhålls för varje fält: ett för HPTS märkning (vesiklar) och den andra för Snarf-1 märknings (cytosol).
- Bakgrund fluorescens (extracellulärt område) är digitalt subtraheras från fluorescerande bilder av båda sonderna. Märkta blåsor och cytosolen från deras respektive lagrade bilder väljs med hjälp av en binär mask. För varje pH-sonden, är fluorescensintensiteterna mättes på en numerisk skala (0-4,095 grånivå skala). En medelintensitet för alla bildpunkter i organellen eller cytoplasman beräknas och värdena används för att beräkna fluorescenskvoter.
9. Dataanalys
- Olika mjukvarupaket finns kommersiellt tillgängliga för dataanalys. DvsFluoView Software.
- I ett kalkylblad, spela in värden och beräkna fluorescens nyckeltal enligt följande: När det gäller HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) och, i fråga om Snarf-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
- Plotta data med hjälp av vetenskapliga grafer program som GraphPad Prism. Tomten ska skildra fluorescens nyckeltal (Y-axeln) som funktion av pH (X-axel). Kurvan montering uppnås med användning av icke-linjär regression.
- Samla fluorescensintensiteter av proverna såsom beskrivs i steg 8,2 och beräkna fluorescensförhållanden. Använd kalibreringskurvor för att omvandla förhållanden i pH-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För samtidig mätning av pH i både intracellulära och endosomal / lysosomala cell fack, var ratiometrisk fluorescerande pH-avkänning prober Snarf-1 och HPTS används. Snarf-1 är begränsad till den cytosoliska utrymmet medan HPTS medger ratiometrisk pH-mätning av det endosomala / lysosomala utrymmet. Cell lastning med HPTS för 16 tim gör sitt selektiva lokalisering i endosomer / lysosomer 4. Ett typiskt exempel på fluorescens registrerades från HT-1080-celler laddade med de pH-avkännande prober visas i figur 2A. Bevis för att HPTS etiketter både endosomala och lysosomala fack erhölls genom samtidig färgning med Alexa 546-konjugerat transferrin (endosomes) eller en fluorescerande lysotrophic sond (Lysotracker Djup Reddye). Data visade tydligt att HPTS färgade båda avdelningarna Figur 2A.
Med användning av förfarandet beskrivet ovan, intracellulära pH-värden i levande celler bestämdes med användning aven kalibreringskurva för varje sond figurerna 2B och 2C, som bygger på den kvotmetriska egenskaperna för varje pH-känsligt färgämne. De fem kalibreringslösningar användes för att omvandla fluorescensintensiteterna för pH-enheter. Data från tre oberoende kalibreringar rapporteras för varje pH-sonden Figur 2C. Varje datapunkt representerar ett förhållande av fluorescensintensiteten vid exciteringsvåglängder av 458/405 nm för HPTS eller emissionsvåglängder av 644/584 nm för snarf-1 vid ett givet pH. De kalibreringskurvor för båda sonderna visade en icke-linjär relation som var bäst försedd med en exponentiell ekvation figur 2C. Effektiviteten av metoden för detektering av cellulär avdelning associerade pH-förändringar utvärderades i levande HT-1080-celler med användning av NH4CI, en svag bas, som ökar intracellulärt pH, bafilomycin A1, en farmakologisk inhibitor av V-ATPaser och EIPA, en NHE- en inhibitor. NH4CI triggered intravesikulär och cytoSolic pH ökar från 6,35 till 7,10 och 7,00 till 7,40, siffror respektive 3A och 3B. Bafilomycin A1 inducerad alkalisering av endosomala och lysosomala fack utan att förändra cytosolic pH. Däremot EIPA inducerad försurning av cytosolen nå ett pH-värde av 6,62, jämfört med 7,00 i obehandlade celler figurerna 3A och 3B.
Figur 1. Diagram över förvärvs inställningar för konfokala laserskanning mikroskop. (A) Den första fasen är inställd på att väcka HPTS vid 405 nm och Snarf-1 vid 543 nm samtidigt genom en dikroisk (DM405/488/543/633) spegel. Fluorescens utsläpp är först registreras för HPTS vid 505-525 nm med en dikroisk spegel (SDM560). Fluorescensemission av Snarf-en övervakas sedan genom en bandpass interferensfilter i intervallet 570-600 nm. (B) Den andra fasen är inställd på att samtidigt samla fluorescens utsläpp av HPTS (ex moms, 458 nm) och Snarf-1 (ex moms, 543 nm). Probe excitation genereras av laserstrålen passerar genom en stråldelare (BS20/80) och fluorescens utsläpp för varje sond samlas in genom de dikroiska speglar som används i den första fasen. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. In situ kalibrering av pH-sensorsonder. (A) Representativa bilder av HPTS och Snarf-1 sub-cellulära lokalisering i HT-1080 fibrosarkomceller. Övre bilder visar att Snarf-1 etiketter cytoplasman medan HPTS-associerad fluorescens visar intravesikulär lokalisering. HT-1080-celler inkuberades under 30 min med Alexa 546-konjugerat transferrin (5 ug / ml) eller en lysotrophic färgämne (Lysotracker Djupt Reddye) (100 nM), respektive. Lägre bilder visar att HPTS colocalizes med transferrin och lysotrophic färgämne (60X). (B) Representativa bilder av både pH-avkänning sonder i celler inkuberas i 15 min med kalibreringslösningar vid pH 6,0 och pH 7,5. (C) Förhållandet mellan fluorescensintensiteten nyckeltal för HPTS och Snarf-1 bestäms med hjälp av kalibreringslösningar som en funktion av pH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Modulering av jag ntracellular pH genom bafilomycin A1, EIPA och NH4CI. Farmakologiska hämmare (bafilomycin A1, EIPA) och det intracellulära pH-modulator NH4CI användes för att validera den metodik. Grafer visar pH-värden som registrerats i det endosomala / lysosomala utrymmet (A) eller i cytoplasman (B) av HT-1080-celler laddade med HPTS och Snarf-1 och inkuberades under 30 min i närvaro eller frånvaro (kontroll) av NH4CI ( 20 mM), EIPA (25 ^ M) eller bafilomycin A1 (100 nM). Data representeras som medelvärde + SEM (** p 0,005, *** p 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det behövs Kvantitativ pH-mätning i live-cell imaging av olika cellulära fack för att noggrant mäta pH-variationer i cellsvar till externa utmaningar. Men en av de stora hinder som återstår är att enkelt och specifikt rikta mobilfack. I detta avseende har några studier visat på användningen av HPTS som en intracellulär pH-indikator införas i celler genom elektroporation eller mikroinjektion 8-10. Dessa tekniker lider av allvarliga nackdelar, nämligen elektroporation orsakar omfattande skador på celler, och mikroinjektion kräver speciell utrustning och tekniska färdigheter. Av intresse, Hinton et al. Har tidigare rapporterat att HPTS kan tas upp av celler genom en process av pinocytos och att kombinationen av Snarf-1 och HPTS kan användas för att övervaka pH i cytosolen och endosomala / lysosomala fack 3 . Vi har använt den här egenskapen för att spela in pH-variationer i lysosomala / endosomala compartment av levande HT-1080 celler. Bevis för att HPTS låg i detta fack och därmed kan fungera som en tillförlitlig pH-indikator erhölls genom samtidig färgning med fluoroforen-konjugerade transferrin, en markör av det lysosomala / endosomala fack, eller med en acidophilic färgämne som oftast märker lysosomer Figur 2. Dessutom har användningen av olika intracellulära pH-modulatorer som riktar distinkta cellulära avdelningar indikerade att bafilomycin A1 specifikt ökade intravesikulär pH utan att förändra cytoplasmisk pH. Däremot EIPA huvudsakligen förändras cytosoliska pH men hade liten eller ingen effekt på endosomala och lysosomala pH medan ammoniumklorid påverkade pH för båda avdelningarna. Dessa resultat fram bevis för att Snarf-1 och HPTS kan användas för att samtidigt övervaka pH-förändringar i dessa två olika cellulära fack.
Ett viktigt inslag i den här beskrivna metoden är att använda konfokala laserskanning mikroskopi. De flesta studier reported i litteraturen på intracellulära pH-mätningar har gjorts av spektrofluorometri. Även lätt att använda och ger snabb datainsamling, blir det svårt att tillåta observation av celler under experimentet. Denna nackdel kan bli av betydelse eftersom det har varit vår erfarenhet att under kalibreringssteget, får förlängd inkubation under sura (pH 5,5) eller alkaliskt (pH 8,0) förhållanden påverka olika celltyper och utlösa apoptos. I fallet med HT-1080-celler, leder apoptos till röd autofluorescens, således att interferera med pH-beroende fluorescens av Snarf-1 (data visas ej). För att kringgå detta problem har vi använt ett separat odlingsskål för varje kalibrering och kasserade experiment där tecken på apoptos eller andra cellförändringar observerades. Användningen av konfokalmikroskop för pH-mätningar gör också analys av data enklare. Exempelvis kan analys av konfokal fluorescensmikroskopiska bilder användas för att göra sig av artefakter, apoptotic celler och bakgrundsljud, vilket gör beräkningar enklare och mer exakt.
Även om den metod som beskrivs här har många fördelar jämfört med andra metoder, har den vissa begränsningar. En av dessa är relaterade till de olika lastförhållanden som krävs för varje sond. Med avseende på HPTS har färgämnet som skall tas upp av pinocytos. Denna begränsning innebär att celler måste upprätthållas under en längre tidsperiod (t.ex. 12 timmar) i ett serum-kompletterat medium för att främja pinocytos och därmed märkning av endocytic facket. I motsats härtill måste cellgenomträngande snarf-1 som skall inkuberas i ett serumfritt medium för att förhindra möjligheten att acetoximetylester (AM) hydrolys av seruminnehållande icke-specifika esteraser. Dessa restriktioner kommer att utesluta experimentella protokoll som kräver lastning-inkompatibel cellodlingsförhållanden. Dessutom är känsligheten för HPTS till surt medium en viktig begränsning. Såsom visas i fig. 2, fluorescence intensiteter av HPTS exciteras vid 458 nM visar minimal variation vid pH 6,0 eller lägre, med förhållanden som ligger nära bakgrundsvärden. Denna inneboende egenskap hos HPTS borde tas i beaktande när det gäller studier av mycket sura cellulära utrymmen såsom lysosomer som har pH-värden så låga som 4,0 till 5,0. Men så vitt vi vet, är HPTS den enda tillgängliga ratiometrisk färgämne som kan användas för att mäta intraendosomal pH. Till exempel, den vanligen använda lysosensor färgämne kommer mestadels skiljevägg inom den surare lysosomala utrymmet. Omfattningen av delningen av detta färgämne inom endosomala utrymmet kommer att bero på pH-värden inom dessa vesiklar, vilket är en stor nackdel vid mätning intravesikulär pH i celler där endosomala pH homeostas ändras.
Avslutningsvis beskriver vi här en metod för att samtidigt mäta cytosoliska och endosomala pH-värden i enskilda celler. Detta är särskilt viktigt för att studera pH-homeostas i celler where mutationer eller droger kan påverka utflödet och inflödet av protoner i endosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions for calibration | |||
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | |
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | |
| D-Glucose (dextrose) | Fischer | D16-1 | |
| Magnesium sulfate | Fischer | M65-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fischer | M-1612 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| Nigericin | Calbiochem | 481990 | Toxic by inhalation or in contact with skin |
| Keep protected from the light at 4 °C | |||
| Culture dishes ∅ 35mm | BD Biosciences | 354456 | |
| pH-sensing probes | |||
| 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) | Life technologies | H-348 | Keep away from the light at room temperature |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Life technologies | C-1271 | Keep away from the light and humidity at -20 °C |
| Dimethyl Sufoxide (DMSO) | Fischer | BP231-1 | Harmful |
| Phosphate buffered saline (PBS) 100X | |||
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | 20 g |
| Sodium phosphate monobasic | Fischer | S369-1 | 115 g |
| Potassium phosphate monobasic | J.T Baker | 3246-01 | 20 g |
| Deionized water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Autoclave and adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N/A | N/A | 50 ml |
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | 40.5 g |
| Deoinized water | N/A | N/A | Bring to 5 L |
| pH modulators | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) | Sigma-Aldrich | A3085 | |
| Ammonium chloride | Fischer | A649-500 | |
References
- Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
- Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
- Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
- Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
- Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
- Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
- Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
- Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).
