Summary
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של הצינור העצבי, אבל להעביר להגיע למטרות מתאימות. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) הם מודל שימושי ללמוד נדידת נוירונים. פרוטוקול זה מתאר את wholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר עכבר כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את נדידת FBM.
Abstract
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע למטרות מתאימות. פענוח האותות המולקולריים ששיתוף פעולה להנחות את ההעברה עצבית במוח העוברי ולכן חשוב להבין כיצד הרשתות עצביות מורכבות בצורה שמאוחר יותר לתמוך בחיים לאחר לידה. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) במוח האחורי עובר העכבר לעבור מ rhombomere (r) 4 caudally כדי ליצור גרעיני פנים לזווג באזור נגזר-R6 של המוח האחורי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לwholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר העכבר המתאים לחקור את מסלולי איתות המווסתים את נדידת FBM. בשיטה זו, hindbrains של עוברי עכברי E11.5 הם גזורים ותרבותיים בהכנת ספר פתוחה על מוסיף תרבית תאים ל24 שעות. במהלך הזמן הזה, הנוירונים FBM להעביר caudally כלפי R6 והוא יכול להיות חשוף לנוגדנים לחסימת פונקציה וmolecul הקטןes בתקשורת התרבות או חרוזים הפרין עמוס בחלבונים רקומביננטיים לבחון תפקידים לאיתות מסלולים מעורבים בהכוונת נדידת נוירונים.
Introduction
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע לאזורי היעד מתאימים הנמצאים במרחק גדול. המיקום הנכון של גופי תא עצביים במקומות מתאימים לאורך צירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי של המוח המתפתח הוא חיוני לנכון חיווט, הישרדות, ותפקוד של הנוירונים האלה לאחר שלב נדידת 1-4. בדומה למנגנונים המולקולריים השולטים 5-7 האקסון הדרכה, ערכות קומבינטורית של רמזים אטרקטיביים ודוחה הם חשבו להדריך נוירונים נודדים 1,8. עם זאת, בשל האינטראקציות של סוגי תאים מרובים, אותות השליטה נדידת נוירונים נחקרו פחות נרחבים מאלה מעורבים בהדרכה האקסון, שניתן ללמוד בתא באופן אוטונומי. המוח האחורי הפיתוח של בעלי חוליות כבר בשימוש במספר המחקרים אחרונים כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ותאייםשל נדידת נוירונים, למשל בחומוס, עכבר ודג זברה 1-4,9. איבר זה מכיל מספר סוגים שונים של נוירונים, ובם כמה תתי סוגים של precerebellar והנוירונים מוטוריים 5,7,10,11.
motorneuron המוח האחורי נולד באזור חדרית הקרוב לfloorplate, והם להתמיין תת ספציפיים לפי rhombomere מוצאם 1,12. נוירונים branchiomotor הפנים (FBM) נוצרים בrhombomere (r) 4 במוח האחורי ולהרחיב את האקסונים שלהם dorsally דרך נקודת יציאת R4 לקשת branchial השנייה למעצבבים את שרירי הפנים 2,9,13. נוירונים FBM של דג הזברה ועכברים לספק מודלים מצוינים ללמוד את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית בתהליך שהיא דמיינו בקלות, משום שהנוירונים האלה reproducibly translocate somata בתהליך spatiotemporally מוגדר היטב. בעכברים, תאי עצב FBM להעביר CAU הראשוןלהתמזמז דרך R5 ואז שניהם caudally וventrally להגיע המיקום הסופי שלהם בצד pial של המוח האחורי בשטח של R6, שבו הם יוצרים את הגרעינים לזווג של העצב השביעי הגולגולת (VIIn) 10,11,14. בדג הזברה, הנוירונים FBM בתחילה להעביר ventrally ולאחר מכן לשנות כיוון בגבול R4-R5 להמשיך נודדים לכיוון שטח pial באופן laminin תלוי 4,12,15,16. הגירה זו ממשיכה על פני תקופה של מספר ימים בפיתוח ויכולה להיות מחולקת לשלבים של הגירה משיקה והרדיאלי, המאפשרת זיהוי של מולקולות אשר מתווכות שני תהליכים שונים אלה. לעומת זאת, תאי עצב FBM של המוח האחורי חומוס העוברי להישאר בR4 3,13,17-19.
במהלך הנדידה שלהם, ניתן לזהות נוירונים FBM, כמו סוגים אחרים או נוירונים מוטוריים, דרך הביטוי שלהם של איון שעתוק homoeodomain גורם 1 (ISL1) 14. לפיכך, wholמכתים emount immunofluorescence או הכלאה באתר לסמן זה בשלבי התפתחותיים שונים חושף את זרם הנדידה הברור של somata FBM המשתרע מR4 לR6 בדג הזברה או עכבר 4,15,16. יתר על כן, כתבים מהונדסים ניאון כגון ISL1-GFP היו בשימוש ככלים מתאימים כדי להמחיש נודדים נוירונים FBM בדג הזברה 3,17-19. בנוסף להתאמתם להדמיה, חוקרים רבים חקרו את ההגירה של תאי עצב FBM בפיתוח דג הזברה, כי עוברי חיים הנטולים ניתן להשפיע בקלות עם טכניקות השתלת תאים ותרכובות תרופתיים ליישם ישירות את המים באקווריום. לעומת זאת, בעובר עכבר מפתחת סגור ברחם, לא ניתן ההשתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או המינהל של נוגדנים לחסימת פונקציה שאינו עוברים את מחסום השליה. יתר על כן, תרכובות תרופתי ניתנות לאם בהריון עלולות להיות בלתיתופעות לוואי רצויים שיכול לפגוע בעובר באופן עקיף. עקיפת מגבלה זו, פיתחנו שיטת vivo לשעבר תרבות למוח האחורי של עכבר כולו, כי הוא תואם עם הגירת נוירון FBM והישרדות ל24 שעות לאחר explanting 7,16. שיטה זו מאפשרת מניפולציה תרופתית קלה, השתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או מנהל של נוגדנים חוסם את הפונקציה ויכולה גם להיות מותאמת ללימודי ההגירה של תת עצביים אחרים במוח האחורי בשלבי התפתחות שונים.
Protocol
1. אופציונאלי: הכן הפרין חרוזים Affi-ג'ל (חרוזים ג'ל) עבור assay המשיכה FBM
הערה: הכן את חרוזים ג'ל לפחות יום 1 לפני שתתחיל בהליך explant.
- שטוף 100 השעיה חרוז μl ג'ל הפרין עם PBS סטרילי עבור 20 דקות על רולר בטמפרטורת חדר (RT).
- חרוזים גלולה בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 5 דקות ב 13,000 X גרם. הוסף PBS סטרילי ולחזור על תהליך הכביסה 4x.
- לאחר לשטוף הסופי, להסיר PBS ולהשרות את חרוזים בנפח קטן של תמיסה סטרילית המכילה את חלבון רקומביננטי של בחירה, מקפיד לכסות את החרוזים עם הפתרון. פרוטוקול זה משתמש 100 VEGF165 אנושיים רקומביננטי ng / μl ב-PBS לשחזר ניסוי שפורסם בעבר 16.
- דגירה חרוזים הפרין ג'ל עם פתרון רקומביננטי החלבון למינימום של שעות 12 ועד למקסימום של 1 שבוע על רולר ב 4 ° C.
2. ציפוי של התרבות הכנסשל
explants המוח האחורי בתרבית על תרבות קורנינג מוסיף בגודל 8 מיקרומטר נקבובית, או מוסיף מקביל. ניתן לעשות שימוש חוזר תרבות מוסיף לאחר השלמת הפרוטוקול, בתנאי שהם נשטפים עם מים מזוקקים, מעוקרים עם אתנול, ומאוחסנים ב70% אתנול עד צורך.
הערה: יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימת מכסה המנוע בתנאים סטריליים.
- הכן תקשורת תרבות explant המורכב של מדיום Neurobasal בתוספת B27 (20 μl / מיליליטר), גלוקוז (6 מ"ג / מיליליטר) ופניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / μl).
- תרבות לשטוף מוסיפה עם PBS סטרילי למשך 5 דקות ויבשות ל5-10 דק מתחת למכסה המנוע לזרום.
- הנח להכניס את התרבות אחת לכל אחד גם בודד של צלחת 12well. הערה: ייתכן שיהיה צורך מוסיף דחיפה קטנה כדי להתאים בחוזקה לתוך הבאר.
- כסה מוסיף התרבות עם 10-20 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר במדיום Neurobasal ולמקם אותם בתרבית רקמת חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO
3. Dissection של Hindbrains מE11.5 עוברי עכברים
- לברור נקבת עכבר בהריון מתוזמן עם נוהל שאושר מבחינה אתית ביום עוברי (E) 11.5 ולמקם את הרחם המכיל את העוברים בצלחת פלסטיק 100 מ"מ עם מדיום L15 קר כקרח.
הערה: כל שלבי הנתיחה חייבים להתבצע בL15 קר כקרח. - באמצעות מיקרוסקופ לנתח ושען דומון מלקחי מספר 5, לקרוע את קיר שריר רחם כדי לחשוף את העוברים, לשחרר את כל עובר, לנתק את חבל הטבור, ולהסיר בזהירות את שק החלמון.
- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק עם פתח רחב נשא, להעביר כל עובר לתוך צלחת פלסטיק נקייה עם L15 קר כקרח.
- בעזרת המלקחיים דומון, לערוף את העובר בדיוק מעל forelimbs. אם הניסוי דורש גנוטיפ של העוברים, לאסוף דגימות רקמה לבידוד הדנ"א הגנומי (למשל piec קטןדואר של שק חלמון או קצה זנב 16,20).
- סובב את צד גב הראש למעלה ולזהות את חדר 4 th, אשר מכוסה על ידי שכבת רקמה דקה (איור 2 ב). לנקב בזהירות roofplate ומתחיל לקלף אותו משם caudally לאורך קו האמצע מעל למוח האחורי האחורי וחוט השדרה, וrostrally מעל המוח התיכון. המוח האחורי צריך עכשיו להיות חשוף (איור 2 ג).
- להקניט הזהירות mesenchyme הראש שנותר וכל קרומי המוח המחוברים לצד pial של המוח האחורי (איור 2 ד).
- הסרה של רקמת חוט השדרה ומוח תיכונה, כך שהמוח האחורי נפרש והוא יכול לשכב בהכנת ספר פתוח (איור 2E).
- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר את כל המוח האחורי גזור ל12 גם צלחת המכילה L15 קר כקרח ולאחסן אותם על קרח עד שכל hindbrains כבר גזור.
- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר חטאהמוח האחורי GLE לצלחת ריקה, להשאיר אותו פתוחה הכנת ספר, בצד של חדר למעלה, בטיפה של L15 100 μl המשוער.
- העבר כמה מיקרוליטר של חרוזים הפרין ג'ל הודגרו לאותה הטיפה. הערה: מאחר והגדלים של חרוזים משתנים, מומלץ להעביר סביב 10 חרוזים ולאחר מכן בחר גודל אופטימלי להשתלה למוח האחורית.
- הפוך דמעה קטנה ברקמת המוח האחורי ולהכניס בזהירות 1-3 חרוזים הג'ל לתוך רקמת המוח האחורי ברמה של R5 / 6, בערך בחץ דרך בין קו האמצע ואת הקצה לרוחב של המוח האחורי, הוריד אותם לרקמה, כך חרוז ממוקם ממש מתחת לפני השטח המוח האחורי.
הערה: ההליך לנתיחה עשוי להימשך בין 5-20 דקות / המוח האחורי, בהתאם לניסיון, ועלול למתוח על פני תקופה ממושכת אם המלטות גדולות, ובכל מקרה, hindbrains צריך להיות בתרבות של לא יותר מ 3 שעות שלאחר המוות לטוב תוצאות.
4. המוח האחוריExplant תרבות
- הסר את הצלחת המכילה את התרבות מוסיף מן החממה, לשאוב את פתרון ציפוי laminin.
- הנח להכניס את התרבות אחת לתוך צלחת תרבות נפרדת מלאה קר כקרח L15 ו, באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר כל צד הגחון המוח האחורי לעלות על להכניס את התרבות (איור 2G). המוח האחורי יהיה שטוח לחלוטין על הקרום להוסיף.
- רם בזהירות להכניס את התרבות מהצלחת ומורח אותו כמה פעמים בנייר טישו נקי כדי להסיר את הנוזל עודף. תהליך זה מבטיח שהמוח האחורי שומרת על להכניס את התרבות בהכנת ספר שטוחה, פתוחה. אם המוח האחורי מתכרבל, הרקמה שלה עשויה לגדול ביחד באופן בלתי הפיך.
- מלא את צלחת 12 גם המקורית עם 500 μl תקשורת תרבות prewarmed ובמקום להכניס בחזרה לזה היטב. להתאים בזהירות את עוצמת הקול עם 400-600 μl אחר של מדיה רק כדי לכסות את המוח האחורי, להבטיח כי המוח האחורי אינו מרחףאת הממברנה. אם זה צף, חזור לשלב 4.4 וחזור עד למוח האחורי נשאר צמוד לממברנה.
- בשלב זה, ניתן להוסיף מעכבים ביולוגיים של עניין לתקשורת ללמוד את השפיעו על ההגירה של תאי עצב FBM.
הערה: אם השתלת חרוזים או מתן טיפולים אחרים, מומלץ לשמור על לפחות 2 explants שליטה בתנאי גידול נורמלים בכל ניסוי כדי לוודא שהניסוי הוגדר בהצלחה. - דגירה explants ל24-30 שעות בתרבית רקמת חממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%).
5. Immunofluorescent מכתים Wholemount של המוח האחורי Explants
- לשאוב את התקשורת מכל טוב, יש לשטוף ב-PBS ולתקן במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה בפורמלין 4% קרים כקרח (מוכן טרי או מופשר טרי paraformaldehyde 4% מומסים בPBS). הערה: אל תנסה להסיר את המוח האחורי מלהכניס את התרבות לפני הקיבועהושלם.
- יש לשטוף 3x עם PBS. לקלף את hindbrains זהירות מהתרבות מוסיף באמצעות מלקחיים דומון. explants חלקם קשים להתקלף, אבל בדרך כלל יכול להיות הרים על ידי הפעלת לחץ עדין דרך לגרש שוב ושוב PBS מטפטפת.
- העבר hindbrains ל2.0 מיליליטר צינורות עגול עם תחתית לתיוג immunofluorescence. Permeabilize hindbrains ל30 דקות בטמפרטורת חדר (RT) בPBS המכיל 0.1% TritonX-100 (PBT) עם גלגול עדין.
- דגירה עבור שעה 1 ב RT בPBT מכילה 10% נסיוב עזים נורמלים חום מומת בגלגול עדין.
- דגירה explants עם גלגול עדין על 4 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים עם נוגדן ראשוני ספציפי לISL1, מדולל 1:100 בPBT המכיל 1% נסיוב עזים נורמלים חום מומת.
- שטוף את explants ב RT 4x עם PBT ל15 דקות כל אחד.
- דגירה explants עם גלגול עדין על RT במשך 3 שעות עם עז fluorophore מצומדות נוגדן אנטי עכבר (אנטי 488 עיזים למשל אלקסה פלואורידעכבר, בדילול 1:200) בPBT המכיל 1% נסיוב עזים נורמלים חום מומת.
- שטוף את explants 4x ב RT עם PBT במשך 15 דקות כל אחד עם גלגול עדין.
- Postfix explants בפורמלין 4% ל30 דקות ב RT.
- כסה שקופיות זכוכית עם 3 שכבות של סרט בידוד שחור ובלו עם אזמל ריבוע קטן של הקלטת שכבתית ליצירת כיס עבור explants; לחלופין, השתמש בשקופית זכוכית דיכאון.
- הר כל המוח האחורי במגיב SlowFade לכיס אחד ולכסות עם coverslip זכוכית, הימנעות בקפידה לבועות אוויר מלכודת ואת תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר.
הערה: כחלופה לimmunostaining, הכלאה באתר עם riboprobes שתכיר FBMS (כלומר Isl1 או Phox2b) ניתן להשתמש כדי להמחיש נוירונים FBM 16,21.
סיכום של צעדים ותזמון
בעיתוי הזדווגות להשיג הריונות E11.25: ~ 14 ימים
אופציונאלי: חרוז הכנה (Protocol 1): ~ 2 שעות, ביום שלפני בידוד עובר
הכן מוסיף תרבות ותקשורת (פרוטוקול 2): ~ 30 דקות, לפני בידוד עובר
בידוד עובר ונתיחת המוח האחורי (שלבים 3.1-3.4): ~ 10 דקות / עובר
נתיחת המוח האחורי (שלבים 3.5-3.7): ~ 5-10 דק / המוח האחורי
הליך explant (שלבים 3.8-3.9): ~ 5-10 דק / המוח האחורי
אופציונאלי: השתלת חרוז (שלבים 3.10-3.11): ~ 5-10 דק / המוח האחורי
תרבות explant (שלב 4.7): 24 שעות
קיבוע עבור מכתים נוגדן (שלב 5.1): 2 שעות
הליך מכתים והדמיה (פרוטוקול 5): 5 ימים
Representative Results
סעיף זה ממחיש דוגמאות לתוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד הגירת נוירון FBM במוח האחורי של העכבר באמצעות vivo התרבות לשעבר. אנחנו מראים שנוירונים FBM בhindbrains explanted מ11 עוברי עכבר היום, עוברים קודם הגירה משיקה (איור 3 א) ולאחר מכן להתחיל להרכיב את גרעיני הפנים מנוע (איור 3 ב), בדומה להתנהגות שלהם ברחם (ראה תרשים 1). בנוסף, אנו מראים כי ההשתלה של חרוז ספוג VEGF165 מושכת נוירונים FBM (3C דמויות ו3D), כפי שמוצג 16 בעבר. חשוב מכך, פרוטוקול זה מאפשר לימודי הגירת FBM בהיעדרם של כלי דם או גורמים המופק מכלי שעשויה להשפיע על הגירת FBM ברחם, משום שכלי הדם nonperfused מתנוון בתרבות 16. לפיכך, תיוג תא דם הנוקב שנצפה בעת השימוש בנוגדן עכבר ISL1 על טריhindbrains עכבר מבודד (איור 1) הוא כבר לא קיים ברקמת המוח האחורי לאחר 24 שעות בתרבות (איורים 3A-F). לבסוף, אנו מראים שתי דוגמאות של hindbrains שלא explanted בצורה נכונה, ולכן מכילים נוירונים FBM בהפצה נורמלית, או בגלל שהמוח האחורי לא explanted בקרוב לאחר בידוד העובר (איור 3E) או בגלל שרקמת המוח האחורי מקופלת בtranswell ( 3F איור).
איור 1. הגירת נוירון FBM Z-מחסנית Confocal של hindbrains עכבר wildtype לאחר immunolabeling wholemount ISL1 וflatmounting;.. קו האמצע למוח האחורי מצויינים בכוכבית בכל הפנלים () פני השטח חדרית של המוח האחורי E11.5 ב אזור המכיל נוירונים ISL1 החיובי FBM (חץ), הוכחת ההגירה המשיקה מR4 לR6;. את עמדתו של R4, R5 ו R6 היא מצויינים (') שטח pial של חצי אחד של אותו המוח האחורי בשטח שבו anlage פני השטח של אחד מהגרעינים לזווג FBM (מצויינים עם VIIn), כמו גם אוכלוסיות נוירון ISL1 חיובית אחרות (B) חדרית של המוח האחורי E12.5 המכיל נוירונים FBM שהם נודדים בנקודת השקה (חץ);. ראש החץ מצביעים על דוגמא של כלי דם המכילים תאים במחזור שמתויגים unspecifically מתגובה צולבת של הנוגדנים משני אנטי העכבר משמשים לאיתור נוגדני ISL1 עכבר IgG. (ב ') שטח pial של חצי אחד של אותו המוח האחורי E12.5, המכיל אחד מגרעיני FBM לזווג. קו האמצע מסומן בכוכבית בפנל. סרגל קנה מידה (כל הלוחות): 200 מיקרומטר. V, הגחון, P, pial./ "= היעד" _blank 51397fig1highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. נתיחת עכבר E11.5 המוח האחורי וvivo תרבות לשעבר. ראש 1 מ"מ () של העובר לאחר שנחתך מן היתרה של העובר ברמת forelimb (ב ') החלק מקורי של: סרגל קנה מידה; (AE) צעדי מפתח בפרוטוקול המוח האחורי E11.5 הנתיחה.. הראש הוסר ושארית רקמת הראש מוקם כך שחדר 4 th (חץ) היה מכוון כלפי מעלה. (C) הגג של חדר 4 th היה התקלף, והמוח האחורי נחשף על ידי קילוף רקמה מתחת למוח האחורי משם rostrally וcaudally. (ד ') קרום pial הוסר (שים לב כי באקס זה, כמה חוט השדרה הצווארי מספיק רקמה (SC) נשארה מחוברת למוח האחורי). () המוח התיכון E עודפת (MB) וחוט השדרה (SC) רקמה הוסרה כדי לשמר רק את המוח האחורי. (מוסיף F) תרבות היו מצופה laminin והניח לתוך צלחת תרבות 12 רקמה היטב. (G) כל המוח האחורי הוצב על הוספה אחת ומכוסה בתקשורת. ייצוג סכמטי של המסלול, שנודד נוירונים FBM (כחול) ב24 שעות של התרבות (H). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. המוח האחורי vivo לשעבר תרבות עכבר. (A, B) המוח האחורי E11.5 היה בתרבית למשך 24 שעות וimmunofluoresc כותרת ently לISL1 כדי להמחיש הגירת נוירון FBM בexplant; שני חדרית () וpial (ב ') צדדים של המוח האחורי מוצגות (C, D) hindbrains littermate E11.5 היו בתרבית בנוכחות חרוז הפרין המושתל ספוג. ב-PBS (C) או VEGF165 (ד); לציין כי נוירונים FBM הגרו לכיוון ועל חרוז VEGF165, וזרם הנודדות לכן להאריך עוד יותר caudally לעומת הצד שלא טופל מאותו המוח האחורי או המוח האחורי מכיל את חרוז השליטה (E. , דוגמאות F) של explants לא מספק למוח האחורי E11.5, שבי FBMS לא היגר מR4 (E), או שבו רקמת המוח האחורי המקופלת במהלך התרבות (F). קו האמצע מסומן בכוכבית בפנל. סרגל קנה מידה (לכל הלוחות): 200 מיקרומטר. V, הגחון, P, pial."> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את תרבות wholemount של hindbrains עכבר E11.5 במערכת transwell ללמוד את ההגירה של תאי עצב FBM. פרוטוקול זה מאפשר למוח האחורי motorneurons עכבר כדי להיות כל הזמן בחיים ונודדים לתקופה של 24 שעות, מה שמאפשר vivo לשעבר מניפולציה. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים ניסיוניים המבקשים לזהות את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית. אילו מבחני הגירה מסורתיים explant חתיכות רקמה עצביות קטנות לתוך מטריצה על מנות תרבות ולאפשר תצפית של נוירונים בודדים כפי שהם מגיבים לגירויים חיצוניים, יתרון עיקרי של assay transwell הוא התאמתה כדי לתפעל נוירונים נודדים בסביבת איבר המארח, ולכן יותר הקשר פיסיולוגי. חשוב מכך, חומרים יכולים להיות מיושמים בקלות למוח האחורי לשעבר explants vivo כדי לבדוק את השפיעו על נדידת נוירונים, עקיפת תופעות לוואי אפשרית הקשורים administeתצלצל חומרים אלה לעכבר בהריון. לבסוף, מודל vivo לשעבר גם מאפשר הבדיקה של חומרים שאינם עוברים את מחסום השליה, כגון נוגדנים לחסימת פונקציה. בשל יתרונות אלו, התרבות לשעבר vivo המוח האחורי מספקת אלטרנטיבה ושיטה משלים לשימוש בעוברי דג הזברה, אשר יכול להיות מטופלים עם מולקולות קטנות מסיסים במים במים באקווריום, או לב electroporation ברחם של מוח העוברי, המחייב את השימוש של מתמחים ציוד וקשה יותר להורים מאשר טכניקת התרבות שמתוארת כאן. יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן הוא רמת המוכנות שלה להשתלת חרוזים טבולים בחלבון רקומביננטי או חומרים כימיים אחרים, ובכך מאפשרת את היישום של שיטה עוברית סטנדרטית שפותחה על לתמרן עובר חומוס למודל של עכברים של נדידת נוירונים. בפרט, לשעבר vivo תרבות המודל ניתן להחיל hindbrains של עכברים מהונדסים גנטי defective במולקולות ספציפיות מעורבות בהעברה עצבית, כגון קולטנים צמיחה או גורם הדרכה, ושילוב עם שתלי חרוז כדי לבדוק אם היענות לליגנד הולכת לאיבוד. בנוסף למניפולציה תרופתית, לשעבר vivo פרוטוקול התרבות יכול גם להיות מותאם לelectroporate וקטורי ביטוי שיכול לתפעל ביטוי של גנים של עניין; השיטות מתאימות לelectroporation בעבר תיארו 22,23. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי להמחיש הגירת נוירון ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות בexplants המוח האחורי מעכברים מהונדסים המכילים נוירונים שכותרתו fluorescently FBM, למשל Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד סוגים אחרים של נוירונים נודדים במוח האחורי, כגון אלה היוצרים את הזית הנחות, אם כי זה ידרוש השימוש בhindbrains בשלבים עובריים מבוגרים ועשוי לדרוש תרבות עד 48 שעה, בהתאם לכדאיות עצבית צעדים ופתרון בעיות קריטיים להצלחתו של פרוטוקול זה, חשוב כי עוברים שנאספו בשלב מוקדם E11.5 היום, קרוב יותר לE11.25, כאשר הגירת נוירון FBM רק התחילה. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כדי לתפוס את העוברים בשלב התפתחותי זה בשל השתנות הזדווגות טבעיות של עכברים, ובהתאם לכך, ייתכן שיש כמה השתנות בהארכה של הגירת FBM בין ניסויים שונים. השתנות בהגירה FBM יכולות להיות גם ציינו אם הניסוי לא הושלם בתוך מסגרת הזמן שהוקצתה, שעות על 3, כפי שניתן לראות באיור 3E. רקמת המוח האחורי מעוברי עכברי E11.25 היא עדינה. כאשר לנתח ולאורך כל הליך explant, חשוב שלא לקרוע את רקמת המוח האחורי באזורים מן R4-R6 שבו נוירונים FBM נמצאים. בשל האופי העדין של הפרטים הקטניםתהליך ection, ובגלל המהירות שבה hindbrains ממוקמות לתוך התרבות משפיעה על תוצאה, ההליך עשוי להימשך כמה פעולות תרגול להורים, בפרט לפני דוגמאות או חומרים כימיים יקרות נמצאות בשימוש. לבסוף, חשוב שרקמת המוח האחורי ממוקמת לתוך תצורת ספר פתוחה על להכניס את התרבות, כי קיפול של רקמת המוח האחורי במהלך התרבות ימנע הגירת FBM רגילה (ראה איור 3F).
Disclosures
אף אחד מהמחברים שמתחרה אינטרסים או אינטרסים מנוגדים.
Acknowledgments
MT נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי [נ"צ. וCR 092839/Z/10/Z] על ידי ניו פרס החוקר [נ"צ. 095623/Z/11/Z] מאמון Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., et al. The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. Biol, D. ev. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -L., Heisenberg, C. -P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
