Summary
胚胎神经元是出生在神经管的脑室区，但迁移到达到适当的目标。面部branchiomotor（FBM）的神经元，研究神经细胞迁移的有用模型。本协议描述的小鼠胚胎hindbrains平片的体外培养研究，规范FBM迁移机制。
Abstract
胚胎神经元是出生在大脑的脑室区，但后来迁移到新的目的地，以达到适当的目标。破译分子信号的共同指导神经细胞迁移在胚胎大脑因此重要的是理解复杂的神经网络是如何形成的，后来支持产后生活。在小鼠胚胎后脑面部branchiomotor（FBM）神经元免受菱（R）4尾侧迁移以在后脑的[6 - 衍生的区域配对的面神经核。在这里，我们为平片体外适宜的调查信号通路调节FBM迁移小鼠胚胎hindbrains文化的一个详细的协议。在该方法中，E11.5小鼠胚胎hindbrains在细胞培养插入物24小时开卷制备解剖并培养。在此期间，FBM神经尾侧移向r6和可暴露于功能阻断性抗体和小moleculES在装有重组蛋白研究的信号通路牵连指导神经细胞迁移的作用培养基或肝素珠。
Introduction
胚胎神经元是出生在大脑的脑室区，但后来迁移到新的目的地到达了位于大的距离合适的目标区域。神经元细胞体沿大脑发育的背腹和前后轴的适当位置的正确定位是正确的接线，生存，而这些神经元的功能的迁移阶段1-4后必不可少的。类似于控制轴突导向5-7的分子机制，组合套具吸引力和排斥力的线索被认为是引导神经元迁移1,8。然而，由于多种细胞类型的相互作用，控制神经细胞迁移的信号已被减广泛研究比那些参与轴突导向，可以自主地研究细胞。脊椎动物的显影后脑已用于近来的一些研究，了解细胞和分子机制神经细胞迁移的，例如在鸡，小鼠，斑马鱼和1-4,9。这个器官包含了几种不同类型的神经元，其中包括前小脑的几个亚型和运动神经元5,7,10,11。
后脑motorneuron出生在脑室区靠近floorplate，他们分化 为特定子集，根据产地1,12他们菱。在菱（R）4生成在后脑面部branchiomotor（FBM）神经元和背侧通过R4的出口点延伸它们的轴突到第二腮弓到支配面部肌肉2,9,13。斑马鱼和小鼠的神经元FBM提供优良的模型来研究神经细胞迁移的分子和细胞机制在于易于可视化的方法，因为这些神经元可再现易位其胞体在时空方式明确定义的过程。在小鼠中，富时大马神经元先迁移CAU玩弄通过R5，然后双方和尾端腹侧以达到他们在R6，在那里形成了第7届颅神经（VIIn）10,11,14的配对核境内后脑的软脑膜侧的最终位置。在斑马鱼中，FBM神经元最初迁移腹侧，然后在R4-R5边界改变方向继续在用层粘连蛋白依赖性4,12,15,16对软脑膜表面迁移。这种迁移进行了一段在发展的若干天，可分为切向和径向迁移的阶段，使调解这两个不同的过程的分子鉴定。相比之下，鸡胚后脑的神经元的FBM留在R4 3,13,17-19。
在他们的迁移，富时大马神经元可以被识别，像其他类型或运动神经元，通过他们的homoeodomain转录因子胰岛1（ISL1）14的表达。因此，wholemount免疫荧光染色或原位杂交对这个标记在不同的发育阶段揭示FBM胞体在斑马鱼和小鼠4,15,16从R4延伸至R6的明显迁移流。此外，荧光转基因记者如ISL1-GFP已经被用作合适的工具来可视化在斑马鱼3,17-19迁移FBM神经元。除了其适合用于成像，许多研究者已研究了FBM神经元在显影斑马鱼的迁移，因为它们的自由生活的胚胎可以很容易地与细胞移植技术和直接涂在水族馆的水药理化合物被操纵。相反，在小鼠胚胎发育封闭在子宫，排除的珠子进行指导线索或功能阻断性抗体不穿过胎盘屏障的给药植入。此外，给予孕妈妈药理化合物可能有未所需的副作用，可以间接地损害胚胎。绕过这个限制，我们已经开发了一个体外培养法在全鼠标后脑就是explanting 7,16后与FBM神经元的迁移和存活24小时兼容。这种方法可以方便的药理操纵，珠携带的指导线索或功能阻断抗体的行政植入，也可适应于不同的发育阶段，研究其他神经元亚型迁移的后脑。
Protocol
1。可选：准备阿菲 - 凝胶肝素珠（胶珠）为富时大马景点含量
注：在开始植程序之前准备凝胶珠至少1天。
- 20分钟的滚筒，在室温（RT）洗涤100μl的凝胶肝素珠悬浮液用无菌PBS。
- 丸粒珠在台式离心机5分钟，在13000×g下。加入无菌PBS和重复洗涤过程4倍。
- 最后一次洗涤后，除去PBS，浸泡珠子在小体积的含有精选的重组蛋白中的无菌溶液，小心地覆盖有孔玻璃珠与该溶液。该协议使用100纳克/微升重组人VEGF165在PBS重现以前发表的实验16。
- 孵育凝胶肝素珠最少12小时的重组蛋白质溶液和最多1周上的辊子在4℃下
2。文化插入的涂层s
后脑外植体康宁文化培养插入一个8微米孔径的大小，或等效的插入。培养插入可以在协议完成后，可以重复使用，只要它们用蒸馏水洗涤，消毒用乙醇和直到需要保存在70％乙醇中。
注意：下面的步骤应在无菌条件下进行，在一个流罩。
- 制备外植体的培养基包括补充有B27（20微升/毫升）的Neurobasal培养基中，葡萄糖（6毫克/毫升）和青霉素/链霉素（5微克/微升）。
- 洗涤培养插入用无菌PBS 5分钟，干燥的流罩下5-10分钟。
- 将一种文化中插入操作12well板的每一个人好。注：刀片可能需要一个小推，以适应紧紧地里去了。
- 覆盖培养插入10-20微克/毫升小鼠层粘连蛋白在Neurobasal培养基，并放置在一个组织培养箱（37℃，5％CO2
3。从E11.5小鼠胚胎解剖Hindbrains的
- 扑杀逾怀孕雌性小鼠与胚胎一天一个合乎伦理的程序（E）11.5，并把含有胚胎的子宫在一个100毫米的塑料培养皿用冰冷的L15培养基。
注意：所有的解剖步骤必须在冰冷L15来执行。 - 用解剖显微镜和杜蒙钳钟表匠5号，撕裂子宫肌壁，暴露的胚胎，释放每个胚胎，割断脐带，并小心地取出卵黄囊。
- 使用塑料巴斯德吸管用大口径开放，每个转移胚胎到一个干净的塑料盘用冰冷的L15。
- 使用杜蒙钳，杀头胚胎刚刚前肢上方。如果实验需要的胚胎的基因分型，收集组织样本进行基因组DNA的提取（ 例如小PIECË卵黄囊或尾尖16,20）的。
- 转动头部背侧，并确定4 个心室，其覆盖有薄的组织层（ 图2B）。小心刺破roofplate并开始尾端剥它拿走沿中线在后后脑和脊髓，并吻侧在中脑。后脑现在应该露出（ 图2C）。
- 仔细逗相差其余头间质和连接到后脑（ 图2D）的软膜侧的任何脑膜。
- 去除脑和脊髓组织，使后脑，随即渡过，并且可以在一个开放的书准备（ 图2E）平躺。
- 使用宽口塑料巴斯德吸管中，每个解剖后脑转移到一个12孔板中含有冰冷L15，并将它们存储在冰上直到所有hindbrains已被切开。
- 采用大口径塑料巴斯德吸管，转让罪GLE后脑到一个空盘子，保持一个开放的书准备，心室的一面朝上，在大约100微升L15液滴。
- 转让的培养肝素凝胶珠几微升到同一个液滴。注意：因为珠子的大小是可变的，最好是转大约10珠，然后选择用于移植的最佳大小到后脑。
- 做一个小撕裂在后脑组织并小心地插入1-3凝胶珠入后脑组织在R5 / 6的水平，对中线和后脑的横向边缘之间的半路上，降低他们进入组织，使胎圈正好位于后脑表面之下。
注：解剖过程可能需要5-20分钟/后脑之间，这取决于经验，可以舒展在较长时间内，如果胎大，在任何情况下，hindbrains应该在文化不长于3小时验尸好结果。
4。后脑植文化
- 删除包含从孵化器中培养插入板，吸层粘连蛋白涂层解决方案。
- 放置1培养插入到一个单独的培养皿中充满了冰冷L15和，使用宽口塑料巴斯德吸管中，每个后脑腹侧转移到培养插入物（ 图2G）。后脑应该说谎完全平放在插入膜。
- 小心地从培养皿解除培养插管并轻轻拍上干净的纸巾数次以除去过量的液体。这个过程确保了后脑坚持在平坦，开阔的书准备文化插入。如果后脑蜷缩起来，它的组织可能会不可逆转地共同成长。
- 用500μl预热的培养基填充原来的12孔板，然后将插回这口井。仔细调整与另一400-600微升的媒体仅仅覆盖后脑的体积，确保后脑不浮离膜。如果它漂浮，则返回步骤4.4，并重复直到后脑仍然附着在膜上。
- 在此阶段，有可能感兴趣的生物抑制剂添加到媒体研究其对FBM神经元的迁移效果。
注意：如果植入珠或给予其他治疗方法，建议保持在每个实验中正常生长条件下至少有2个控制外植体，以确保实验已经成功建立。 - 培养外植体为24-30小时，在细胞培养箱（37℃，5％CO 2）。
5。后脑植平片免疫荧光染色
- 从每个孔中吸出介质，冲洗的PBS中并在4℃下，在冰冷却的4％多聚甲醛（新鲜制备的或刚解冻的4％多聚甲醛溶于PBS）温和搅拌定为2小时。注意：不要尝试从固定前文化插入后脑删除已完成。
- 冲洗3次，用PBS。小心地从使用杜蒙镊子培养插入剥离hindbrains。有的外植体难以剥离，但是通常可以通过从移液管反复排出的PBS施加温和的压力被解除。
- 转移hindbrains至2.0圆底管免疫荧光标记。在含有0.1％的TritonX-100（PBT），轻轻压延室温（RT）的PBS中透化hindbrains 30分钟。
- 孵育1小时，在室温下在PBT中含有10％热灭活，轻轻压延正常山羊血清。
- 培养外植体，轻轻压延，在4℃下进行5天，具体为ISL1初级抗体，1:100稀释在PBT中含有1％热灭活的正常山羊血清。
- 在室温下用4倍的PBT，每次15分钟洗外植体。
- 培养外植体用温和的轧制在室温搅拌3小时以荧光团偶联的山羊抗小鼠抗体（ 例如的Alexa Fluor 488羊抗小鼠，1:200稀释）在PBT中含有1％热灭活的正常山羊血清。
- 洗植4倍于室温与PBT的15每个轻揉分钟。
- postfix的外植体在4％多聚甲醛在室温30分钟。
- 盖上的黑色电工胶带3层和消费用手术刀分层磁带的小广场载玻片上创建一个口袋为外植体，或者，使用抑郁载玻片上。
- 装载每个后脑在SlowFade试剂成一个口袋里，盖上盖玻片，小心避开陷阱气泡和图像使用激光扫描共聚焦显微镜。
注意：作为一个替代的免疫染色，与核糖核酸探针能识别FBMS（即ISL1或PHOX2B）原位杂交可用于可视化FBM神经元16,21。
的步骤和时间安排概要
定时交配获得E11.25怀孕：〜14天
可选：珠制剂（ProtocoL-1）：〜2小时，对前胚胎隔离的日子
准备培养插入和媒体（协议2）：〜30分钟，前胚胎隔离
胚胎分离及后脑清扫术（步骤3.1-3.4）：〜10分钟/胚胎
后脑清扫术（步骤3.5-3.7）：〜5-10分钟/后脑
植过程（步骤3.8-3.9）：〜5-10分钟/后脑
可选：珠植入术（步骤3.10-3.11）：〜5-10分钟/后脑
外植体培养（步骤4.7）：24小时
固定的抗体染色（步骤5.1）：2小时
染色过程和成像（协议5）：12天
Representative Results
本节说明了可以通过研究FBM神经元迁移，通过体外培养的小鼠后脑来获得结果的例子。我们表明，FBM神经元中从第11天小鼠胚胎中取出的hindbrains先经过切向迁移（ 图3A），然后开始以组装的面部运动核（ 图3B），类似于其在子宫内的行为（参见图1）。我们进一步证明，一个VEGF165浸泡过的珠子植入吸引FBM神经元（ 图3C和3D），如前所示16。重要的是，这个协议允许FBM学习迁移在没有血管或血管源性因素可能影响FBM移民在子宫内的，因为未注血管退化的文化16。因此，在使用上新鲜的ISL1小鼠抗体时的非特异性血细胞标记观察离体的小鼠hindbrains（ 图1）不再存在于后脑组织24小时培养（ 图3A-F）之后。最后，我们表明，没有正确地取出的，因此，含有氨酯神经元的异常分布hindbrains的两个例子中，这可能是因为后脑后胚胎隔离（ 图3E），或没有被取出的很快，因为后脑组织折叠起来，在transwell小（ 图3F）。
图1。 FBM神经元迁移的共焦Z堆栈的ISL1平片免疫标记和flatmounting后野生型小鼠hindbrains;。在一个E11.5后脑的后脑正中表示，在所有面板带有星号（A）心室面含ISL1阳性FBM神经元（箭头），显示了其切向迁移从R4至R6的面积;的一半相同后脑在含有原基的区域R4，R5和R6的位置被表示（A'）的软脑膜表面。一个E12.5后脑含有氨酯神经元迁移切线方向（箭头所示）的一个配对FBM核（与VIIn表示），以及其他ISL1阳性的神经元群（B）的心室表面;箭头指示的示例含有循环细胞是由用于检测ISL1小鼠IgG抗体的抗小鼠第二抗体的交叉反应非特异性地标记的血管（B'）。的一半相同E12.5后脑，其中包含的软脑膜表面一个配对FBM核。中线指示，在每个面板中的星号。比例尺（所有面板）：200微米。 V，腹，P，软脑膜。/ 51397fig1highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2。 E11.5小鼠后脑解剖和体外培养。 （AE）在E11.5后脑解剖协议的关键步骤;比例尺：胚胎1毫米（A）打印头也被切离的胚胎前肢级之后的其余部分（B）的延髓部分。头被除去，头部组织的剩余部分定位，使得第 4心室（箭头）被向上定向（C） 第 4脑室的屋顶被剥离，并且后脑被剥离的组织的后脑下方远离暴露吻侧和尾侧（D）的软膜的膜除去（请注意，在这个前充足的，一些脊髓型颈椎病（SC）组织一直连接到后脑）（E）中脑过剩（MB）和脊髓（SC）的组织已被移除，保留只是后脑。（六）文化刀片涂有层粘连蛋白和放入12孔细胞培养板。（G）每个后脑被放置到一个插入和覆盖介质。（H）所采取的文化在24小时FBM迁移神经元（蓝色）路径的示意图。 点击这里查看大图。
图3。鼠标后脑体外培养。 （A，B）的E11.5后脑为24小时和immunofluoresc培养 ently标示ISL1说明FBM神经元迁移的外植体;两个心室（A）和软脑膜后脑（二）双方都显示（C，D）E11.5同窝hindbrains在植入肝素珠浸泡的存在进行培养。在PBS中的（C）或VEGF 165（D），注意，FBM神经元迁移的朝向和到VEGF165胎圈，因此，迁移流扩展进一步尾端相比，在相同后脑或含有该控制珠后脑的未处理侧（E。 ，不尽人意E11.5后脑植体，其中FBMS没有从R4移民（E）或F）的例子中，后脑组织培养（F）的过程中被折叠。中线指示，在每个面板中的星号。比例尺（适用于所有面板）：200微米。 V，腹，P，软脑膜。“>点击这里查看大图。
Discussion
本协议描述了Transwell小系统来研究FBM神经元的迁移E11.5小鼠hindbrains的平片文化。该协议允许鼠标后脑运动神经元来维持生命和迁移，为期24小时，使体外操纵。这种方法有许多实验优势，为研究者试图找出神经细胞迁移的分子和细胞机制。而传统的迁移实验外植体小神经组织块放入矩阵的培养皿，使观察单个神经元，因为他们对外源性刺激作出反应，Transwell小法的主要优点是它的适宜宿主器官的环境中操纵神经元迁移，因此更生理环境。重要的是，物质可以容易地应用到体外后脑外植体，以测试它们对神经元迁移，避开与administe相关的可能副作用响这些物质的孕鼠。最后， 体外模型还允许不穿过胎盘屏障，如功能阻断抗体的物质进行测试。由于这些优点，在体外培养后脑提供使用斑马鱼胚胎中，可以用水溶性的小分子被视为在水族箱中的水，或在胚胎大脑的子宫内的电，这需要使用专门的替代和补充方法设备，并且更难以掌握比这里所描述的培养方法。这里描述的协议的另一个优点是它的顺从到植入珠浸泡在重组蛋白或其他试剂，因此允许开发操纵小鸡胚胎神经细胞迁移的小鼠模型中的标准胚胎学方法的应用。特别地， 在体外培养模型可应用于遗传工程小鼠hindbrains有缺陷略去中牵连的神经元迁移的特定分子，如生长或导向因子受体，和结合珠植入物来测试是否响应于配体的丢失。除了 药理操纵，在离体培养的协议也可以适应于电穿孔，可以操纵感兴趣的基因的表达的表达载体，适当的方法电穿孔先前已描述的22,23。这个协议也可适于通过时间推移显微镜中从含有荧光标记的FBM神经元， 如ISL1-Cre重组酶的转基因小鼠后脑植可视化神经元的迁移; Rosa26Yfp 21。最后，该协议也可以用来研究其他类型的神经元迁移的后脑，如那些形成的下橄榄，虽然这将需要在较旧的胚胎阶段使用hindbrains的，并且可能需要培养长达48小时，根据神经元的存活率 关键步骤和故障排除 对于本协议的成功，至关重要的是，胚胎在E11.5天，接近E11.25，当FBM神经元的迁移才刚刚开始早期收取。然而，它并不总是可能在该发育阶段的胚胎赶上由于小鼠自然交配变异性，因此，可能会出现一些变异性在不同实验之间FBM迁移的延伸。变异FBM如果迁移实验未分配的时间框架内完成，约3小时，如在图3E可以看出，也可以观察到。从E11.25小鼠胚胎后脑组织细腻。当解剖和整个外植体的过程，它不是撕裂后脑组织中的R4-R6，其中富时神经元所在的区域是很重要的。由于迪斯的微妙性主要树立的过程，因为这hindbrains被置于文化的速度影响的结果，该过程可能需要几个实践运行掌握，珍贵的样品或试剂在使用前特别。最后，重要的是后脑组织被放置到在培养插入打开的书的配置，因为在培养期间的后脑组织的折叠会阻止正常FBM迁移（参见图3F）。
Disclosures
没有作者都相互竞争的利益或利益冲突。
Acknowledgments
MT是由博士助学金[参考支持。 092839/Z/10/Z]和CR由新研究者奖[参考。从威康信托基金会095623/Z/11/Z]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
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