Summary
Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Neuralrohrs geboren, aber wandern, um geeignete Ziele zu erreichen. Gesichts branchiomotor (FBM) Neuronen sind ein nützliches Modell zur neuronalen Migration zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt die wholemount ex vivo Kultur von Maus-Embryo hindbrains zu Mechanismen, die FBM Migration regulieren zu untersuchen.
Abstract
Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Gehirns geboren, aber anschließend wandern zu neuen Zielen, um geeignete Ziele zu erreichen. Die Entschlüsselung der molekularen Signale, die kooperativ zu führen neuronalen Migration im embryonalen Gehirn ist daher wichtig zu verstehen, wie die komplexen neuronalen Netzwerke zu bilden, die später unterstützt postnatale Leben. Gesichts branchiomotor (FBM) Nervenzellen in der Maus-Embryo-Hinterhirn wandern von Rhombomer (r) 4 kaudal die gepaarten Gesichts Kerne in der r6 abgeleiteten Bereich der Hinterhirn bilden. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll für wholemount ex vivo Kultur von Maus-Embryo hindbrains geeignet ist, die Signalwege, FBM Migration regulieren zu untersuchen. In diesem Verfahren werden hindbrains von E11.5 Mausembryonen in einem offenen Buch Vorbereitung auf Zellkultur-Einsätzen für 24 h präpariert und kultiviert. Während dieser Zeit wandern FBM Neuronen kaudal hin R6 und können funktionsblockierende Antikörper und molecul ausgesetzt werdenes in den Kulturmedien oder Heparin Perlen mit rekombinanten Proteinen geladen, um Rollen für Signalwege in Führungs neuronalen Migration verwickelt zu untersuchen.
Introduction
Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Gehirns geboren, aber anschließend wandern zu neuen Zielen, um geeignete Zielregionen, die in großer Entfernung befinden, zu erreichen. Die korrekte Positionierung der neuronalen Zellkörper an geeigneten Stellen entlang der dorso-ventralen und anterior-posterioren Achse des sich entwickelnden Gehirns ist für die korrekte Verdrahtung, das Überleben und die Funktion dieser Nervenzellen nach dem Migrationsstufe 1-4. Ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die Axon Führung 5-7 zu steuern, werden die kombinatorische Gruppen von anziehenden und abstoßenden Signale gedacht, um die Migration Neuronen 1,8 führen. Jedoch aufgrund der Wechselwirkungen von mehreren Zelltypen, die Signale, die neuronale Migration wurden weniger intensiv untersucht als die in Axon Führung, die Zelle autonom untersucht werden können beteiligt. Die Entwicklungshinterhirn von Wirbeltieren in mehreren jüngsten Studien verwendet worden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu verstehenneuronaler Migration, zum Beispiel in Hühner, Maus und Zebrafisch 1-4,9. Dieses Organ enthält verschiedene Arten von Neuronen, einschließlich mehrerer Subtypen precerebellar und motorischen Neuronen 5,7,10,11.
Hinterhirn Motoneuron in der ventrikulären Zone in der Nähe der Bodenplatte geboren, und sie in bestimmte Untergruppen zu differenzieren nach ihren Herkunfts Rhombomer 1,12. Die Gesichts branchiomotor (FBM) Neuronen in Rhombomer (r) 4 im Hinterhirn erzeugt und erweitern ihre Axone dorsal durch eine r4 Austrittspunkt in den zweiten Kiemenbogen, um die Gesichtsmuskeln 2,9,13 innervieren. FBM Neuronen des Zebrafisch und Maus bieten hervorragende Modelle, um die molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Migration in einem Prozess, der leicht visualisiert studieren, weil diese Neuronen transloziert reproduzierbar ihre Somata in einer raumzeitlich klar definierten Prozess. Bei Mäusen, FBM Neuronen ersten migrieren cautrödeln durch r5 und dann sowohl kaudal und ventral bis zu ihrer endgültigen Position auf der Pia-Seite des Hinterhirn im Gebiet der r6, wo sie die gepaarten Kerne der VII. Hirnnerv (VIIn) 10,11,14 bilden erreichen. Im Zebrafisch, FBM Neuronen zunächst ventral wandern und ändern Sie dann Richtung bei der R4-R5 Grenze weiterhin die Migration in Richtung der Pia-Oberfläche in einer Laminin-abhängige Weise 4,12,15,16. Diese Migration verläuft über einen Zeitraum von mehreren Tagen in der Entwicklung und in Phasen der tangentialen und radialen Migration unterteilt werden, die eine Identifizierung von Molekülen, die diese beiden unterschiedlichen Prozesse vermitteln. Im Gegensatz dazu sind die FBM Neuronen des embryonalen Hühnerhinterhirn bleiben in R4 3,13,17-19.
Während der Migration können FBM Neuronen identifiziert werden, wie andere Arten oder motorischen Neuronen, die durch ihre Expression des Transkriptionsfaktors homoeodomain Insel 1 (ISL1) 14. So wholemount Immunfluoreszenz-Färbung oder in-situ-Hybridisierung für diesen Marker in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigt die deutliche Migrationsstrom von FBM Zellkörper, der sich von R4 bis R6 im Zebrafisch oder der Maus 4,15,16. Darüber hinaus haben fluoreszierende transgenen Reporter wie ISL1-GFP als geeignete Werkzeuge zur Visualisierung der Migration FBM Neuronen in Zebrafisch 3,17-19 verwendet. Neben ihrer Eignung für die Bildgebung haben viele Forscher die Migration von Neuronen bei der Entwicklung FBM Zebrafisch untersucht, weil ihre frei lebenden Embryonen kann leicht mit Zelltransplantation Techniken und pharmakologischen Verbindungen direkt an das Aquarienwasser angewendet manipuliert werden. Im Gegensatz dazu entwickelt sich der Maus-Embryos in der Gebärmutter umgeben, dass dadurch der Implantation von Perlen Buchführungssignale oder die Verwaltung von funktionsblockierende Antikörper, die die Plazentaschranke nicht kreuzen. Darüber hinaus können pharmakologische Verbindungen zu der schwangeren Mutter verabreicht haben ungewünschte Nebenwirkungen, die Embryogenese indirekt beeinträchtigen können. Diese Einschränkung zu umgehen, haben wir ein ex vivo-Kulturverfahren für die gesamte Hinterhirn der Maus, die mit FBM Neuron Migration und Überleben für 24 Stunden nach der Explantation 7,16 kompatibel ist, entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache pharmakologische Manipulation Implantation Kügelchen mit Führungssignale oder die Verabreichung von funktionsblockierende Antikörper und auch geeignet ist, die Migration von anderen neuronalen Subtypen im Hinterhirn in verschiedenen Entwicklungsstadien zu untersuchen.
Protocol
1. Optional: Bereiten Affi-Gel-Heparin-Beads (Perlen Gel) für FBM Art Assay
HINWEIS: Bereiten Gelperlen mindestens 1 Tag vor Beginn der Explantation Verfahren.
- Waschen 100 ul Gel-Heparin Perlensuspension mit sterilem PBS für 20 min auf einer Walze bei Raumtemperatur (RT).
- Pellet Kügelchen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 13.000 x g. In sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang 4x.
- Nach dem letzten Waschen, entfernen PBS und genießen Sie die Perlen in einem kleinen Volumen einer sterilen Lösung, die das rekombinante Protein der Wahl enthält, kümmert sich um die Perlen mit der Lösung abzudecken. Dieses Protokoll verwendet 100 ng / ul rekombinanten humanen VEGF165 in PBS, um eine zuvor veröffentlichte Experiment 16 zu reproduzieren.
- Die Gel-Heparin-Kügelchen, die mit dem rekombinanten Protein-Lösung für mindestens 12 Stunden und höchstens 1 Woche auf einer Walze Inkubieren bei 4 ° C.
2. Beschichtung von Kultureinsatzs
Hinterhirn Explantate werden auf Corning Kultur kultiviert fügt mit einem 8 um Porengröße oder entsprechende Einsätze. Kultureinsätze können nach Abschluss des Protokolls wieder verwendet werden, sofern sie mit destilliertem Wasser gewaschen, mit Ethanol sterilisiert und in 70% Ethanol bis zum Gebrauch gelagert.
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem Strömungshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Vorbereitung Explantat Kulturmedien aus Neurobasalmedium mit B27 (20 ul / ml) ergänzt, Glucose (6 mg / ml) und Penicillin / Streptomycin (5 ug / ul).
- Waschkultur-Inserts mit sterilem PBS für 5 min und trocken für 5-10 min unter der Flow-Haube.
- Legen Sie ein Kultureinsatz in jede einzelne Vertiefung einer 12well Platte. Hinweis: Einsätze können einen kleinen Push-to-fest in die gut passen müssen.
- Decken Sie die Kultureinsätze mit 10-20 pg / ml Maus-Laminin in Neurobasalmedium und legen Sie sie in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO
3. Dissektion der Hindbrains von E11.5 Maus Embryonen
- Cull zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren an embryonalen Tag (E) 11,5 und legen die Gebärmutter, die die Embryonen in einer 100-mm-Kunststoffschale mit eiskaltem L15 Medium.
HINWEIS: Alle Dissektion Schritte müssen in eiskaltem L15 durchgeführt werden. - Mit einem Binokular und Dumont Uhrmacherpinzette Nummer 5, reißen die Uterusmuskulatur Wand, um die Embryonen aussetzen, lassen jeden Embryo, die Nabelschnur durchtrennen und entfernen Sie vorsichtig den Dottersack.
- Mit einem Kunststoff Pasteur-Pipette mit einem Weitbohrungsöffnung, jeder Embryo zu übertragen in eine saubere Plastikschale mit eiskaltem L15.
- Mit Dumont Pinzetten, enthaupten den Embryo direkt über den Vordergliedmaßen. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln Gewebeproben für die Isolierung genomischer DNA (z. B. eine kleine piece der Dottersack oder Schwanzspitze 16,20).
- Drehen Sie den Kopf Rückenseite und identifizieren die 4. Herzkammer, die von einer dünnen Gewebeschicht (2B) abgedeckt ist. Sorgfältig durchbohren die roofplate und beginnen, es kaudal entlang der Mittellinie über den hinteren Hinterhirn und Rückenmark abzulösen und rostral über das Mittelhirn. Rautenhirn sollte nun ausgesetzt werden (Fig. 2C).
- Sorgfältig necken das verbliebene Kopfmesenchyms und keine Hirnhäute, die der Pia-Seite des Hinterhirn (Abbildung 2D) befestigt sind.
- Entfernen Mittelhirn und Rückenmark, so dass das Hinterhirn entfaltet und flach in einem offenen Buch Vorbereitung (2E) liegen.
- Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette jede seziert Hinterhirn zu einer 12-Well-Platte mit eiskaltem L15 und speichern sie auf Eis, bis alle hindbrains wurden seziert.
- Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette eine Sündegle Hinterhirn in eine leere Schüssel, halten sie ein offenes Buch Vorbereitung, ventrikuläre Seite nach oben in einem Tropfen ca. 100 ul L15.
- Bringen Sie ein paar Mikroliter der Heparin-Gel inkubiert Perlen auf die gleiche Tröpfchen. Hinweis: Da die Größen der Perlen sind variabel, empfiehlt es sich, rund 10 Perlen Transfer und wählen Sie dann eine optimale Größe für die Transplantation in den Hinterhirn.
- Machen Sie einen kleinen Riss in der Hinterhirn Gewebe und vorsichtig einführen 1-3 Gel-Kügelchen in der Hinterhirn Gewebe auf der Ebene der r5 / 6, etwa auf halbem Weg zwischen der Mittellinie und der Seitenkante des Hinterhirn, Senken sie in das Gewebe, so dass die Perle wird direkt unter der Oberfläche positioniert Hinterhirn.
HINWEIS: Die Dissektion Verfahren kann zwischen 5-20 min / Hinterhirn dauern, je nach Erfahrung und kann sich über einen längeren Zeitraum zu strecken, wenn Würfe groß sind, in jedem Fall, hindbrains sollte in der Kultur nicht länger als 3 Stunden post mortem für das Gute sein Ergebnisse.
4. HinterhirnExplantation Kultur
- Entfernen Sie die Platte mit den Kultureinsätze aus dem Inkubator, saugen Sie den Laminin-Beschichtungslösung.
- Legen Sie ein Kultureinsatz in eine separate Kulturschale mit eiskaltem L15 und gefüllt, mit einem breiten Kunststoff-Bohrung Pasteur Pipette jede Hinterhirn Bauchseite nach oben auf der Kultureinsatz (2G). Das Hinterhirn sollte auf den Einsatz Membran vollständig flach liegen.
- Heben Sie die Kultureinsatz aus der Schüssel und tupfen Sie es mehrmals auf saubere Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dieser Prozess stellt sicher, dass das Hinterhirn hält sich an die Kultureinsatz in einem flachen, offenen Buch Vorbereitung. Wenn das Hinterhirn rollt sich, kann seine Gewebe irreversibel zusammen wachsen.
- Füllen Sie den ursprünglichen 12-Well-Platte mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedien und setzen Sie den Einsatz wieder in das gut. Die Lautstärke mit einem anderen 400-600 ul Medium, um nur die Hinterhirn decken vorsichtig einstellen, so dass die Hinterhirn nicht schwimmenAus der Membran. Wenn es schwimmt, kehren Sie zu Schritt 4.4 und wiederholen, bis das Hinterhirn bleibt an der Membran angebracht.
- In diesem Stadium ist es möglich, biologische Inhibitoren von Interesse für die Medien zu ihrer Wirkung auf die Migration von FBM Neuronen zu untersuchen.
HINWEIS: Wenn die Implantation Perlen oder anderen Behandlungen verabreicht, ist es empfehlenswert, mindestens zwei Steuer Explantate unter normalen Wachstumsbedingungen pro Experiment, um zu gewährleisten, dass das Experiment wurde erfolgreich eingerichtet. - Explantate Inkubation für 24-30 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
5. Wholemount Immunfluoreszenz-Färbung der Hinterhirn Explantate
- Saugen Sie das Medium aus jedem Well gründlich in PBS und fixieren für 2 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln in eiskaltem 4% Formaldehyd (frisch zubereitet oder frisch aufgetauten 4% Paraformaldehyd in PBS gelöst). Hinweis: Versuchen Sie nicht, aus dem Hinterhirn Kultureinsatz vor der Fixierung entfernenist abgeschlossen.
- 3x mit PBS spülen. Die hindbrains Sie vorsichtig von den Kultureinsätze mit Dumont Pinzette. Einige Explantate sind schwer zu schälen, kann aber in der Regel durch sanften Druck durch immer wieder vertreiben PBS aus einer Pipette abgehoben werden.
- Übertragen Sie die hindbrains bis 2,0-ml-Rundrohre für Immunfluoreszenz-Kennzeichnung. Durchdringbar hindbrains für 30 min bei Raumtemperatur (RT) in PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 (PBT) mit sanften.
- Inkubation für 1 h bei RT in PBT mit 10% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum mit sanften.
- Explantate mit sanften Inkubation bei 4 ° C für 5 Tage mit primärer Antikörper, der für ISL1, 1:100 in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum.
- Waschen Sie die Explantate bei RT 4x mit PBT für 15 min je.
- Explantate mit sanften Inkubation bei RT für 3 h mit Fluorophor-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörper (z. B. Alexa Fluor 488 Ziege antiMaus, 1:200 verdünnt) in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum.
- Waschen Sie die Explantate 4x bei RT mit PBT für 15 min mit je sanften.
- Postfix die Explantate in 4% Formaldehyd für 30 Minuten bei RT.
- Decken einen Glasobjektträger mit 3 Lagen schwarzem Isolierband und Verbrauch mit einem Skalpell eine kleine Quadrat der Schichtband, um eine Tasche für den Explantaten zu erstellen, alternativ, verwenden Sie eine Depression Glasträger.
- Montieren Sie jede Hinterhirn in Slowfade Reagenz in einer Tasche und mit einem Deckglas sorgfältig vermieden, um Lufteinschlüsse und Bild unter Verwendung eines konfokalen Laserrastermikroskop.
HINWEIS: Als Alternative zu Immunfärbung in situ Hybridisierung mit Ribosonden, die FBMs (dh Isl1 oder PHOX2B) erkennen kann zum FBM Neuronen 16,21 visualisieren.
Zusammenfassung der Schritte und die Zeit
Zeitgesteuerte Paarung E11.25 Schwangerschaften zu erhalten: ~ 14 Tage
Optional: Bead Vorbereitung (Protocol 1): ~ 2 Stunden, am Tag vor der Embryo Isolation
Bereiten Kultureinsätze und Medien (Protokoll 2): ~ 30 min, vor dem Embryo Isolation
Embryo Isolation und Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,1 bis 3,4): ~ 10 min / Embryo
Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,5 bis 3,7): ~ 5-10 min / Hinterhirn
Explantation Verfahren (Schritte von 3,8 bis 3,9): ~ 5-10 min / Hinterhirn
Optional: Perle Implantation (Schritte 3,10-3,11): ~ 5-10 min / Hinterhirn
Explantatkultur (Schritt 4.7): 24 h
Fixierung für Antikörperfärbung (Schritt 5.1): 2 Stunden
Färbeverfahren und Bildgebung (Protokoll 5): 5 Tage
Representative Results
Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele von Ergebnissen, die durch das Studium FBM Neuronenwanderung im Hinterhirn der Maus durch ex vivo-Kultur erhalten werden können. Wir zeigen, dass die Neuronen im FBM explantiert hindbrains von Tag 11 Maus-Embryonen zunächst eine tangentiale Migration (3A) unterziehen und dann damit beginnen, die Gesichts motorischen Kerne (3B), ähnlich wie ihr Verhalten in utero (siehe Abbildung 1) zu montieren. Wir zeigen weiter, daß die Implantation eines VEGF165-getränkten Wulst zieht FBM Neuronen (Fig. 3C und 3D), wie zuvor gezeigt 16. Wichtig ist, ermöglicht dieses Protokoll Studium FBM Migration in Abwesenheit der Blutgefäße oder Behälter abgeleitete Faktoren, die FBM Migration in utero beeinflussen kann, da der nicht-perfundierte Gefäß degeneriert in Kultur 16. Somit wird, wenn mit der Maus-Antikörper ISL1 auf frisch beobachtet die unspezifische Blutzellmarkierungisolierten Maus hindbrains (Fig. 1) nicht mehr in Rautenhirn Gewebe vorhanden Nach 24 Stunden in Kultur (Fig. 3A-F). Schließlich zeigen wir zwei Beispiele, die nicht korrekt hindbrains explantiert wurden und enthalten FBM Neuronen in einem abnormalen Verteilung daher, entweder weil das Hinterhirn wurde nicht früh genug nach dem Embryo Trennung (3E) oder explantiert, weil das Hinterhirn Gewebe in der Transwell gefaltet ( 3F).
Fig. 1 ist. FBM Neuronenmigration Konfokale Z-Stapel von Wildtyp-Maus hindbrains nach ISL1 wholemount Immunomarkierung und flatmounting;.. Rautenhirn Mittellinie ist mit einem Stern auf allen Seiten angezeigt (A) ventrikuläre Oberfläche eines E11.5 Hinterhirn in die Gebiet mit ISL1 FBM-positiven Neuronen (Pfeil) zeigen ihre tangentiale Migration von R4 bis R6;. die Position von R4, R5 und R6 angegeben ist (A ') Pia-Oberfläche einer Hälfte derselben Rautenhirns in der Umgebung, die die Anlage . von einer der gepaarten Kerne FBM (mit VIIn angegeben), wie auch andere ISL1-positiven Neuronen-Populationen (B) ventrikuläre Oberfläche eines E12.5 hindbrain FBM enthält Neuronen, die tangential migrieren (Pfeil), wobei die Pfeilspitze zeigen ein Beispiel eines Blutgefäßes enthält zirkulierenden Zellen unspezifisch durch Kreuzreaktion des Anti-Maus-Sekundär-Antikörper verwendet, um die ISL1 Maus-IgG-Antikörper nachzuweisen markiert sind. (B ') Pia-Oberfläche einer Hälfte derselben E12.5 Hinterhirn, das enthält einer der gepaarten Kerne FBM. Die Mittellinie ist mit einem Stern in jeder Tafel angegeben. Maßstabsbalken (alle Panels): 200 um. V, ventrale, P, Pia./ 51397fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. E11.5 Maus Hinterhirn Dissektion und Ex-vivo-Kultur. (A) Head 1 mm des Embryos, nachdem es von dem Rest des Embryos bei forelimb Ebene geschnitten (B) Die rostralen Teil der: Maßstab; (AE) Schlüsselschritte in der E11.5 Hinterhirn Dissektion Protokoll.. Kopf wurde entfernt, und der Rest des Kopfes Gewebe so positioniert, dass der 4. Ventrikel (Pfeil) wurde nach oben ausgerichtet. (C) Das Dach des 4. Ventrikels wurde abgezogen und das Hinterhirn wurde durch Abziehen Gewebe unter der Hinterhirn entfernt ausgesetzt rostral und kaudal. (D) Die Pia-Membran wurde entfernt (beachten Sie, dass in diesem Ex-ausreichend, einige Halsmark (SC) Gewebe an der Hinterhirn befestigt geblieben ist). (E) Überschüssiges Hirn (MB) und des Rückenmarks (SC) Gewebe entfernt worden ist, nur die Hinterhirn erhalten. (F) Kultur-Inserts wurden mit beschichteten Laminin und in eine 12-Well-Gewebekulturplatte gelegt. (G) Jedes Hinterhirn wurde auf einen Einsatz gegeben und mit Medien abgedeckt. (H) Schematische Darstellung des Weges durch die Migration FBM Neuronen (blau) während 24 Stunden der Kultur gemacht. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Maus-Hinterhirn ex vivo Kultur. (A, B) Ein E11.5 Hinterhirn war für 24 h kultiviert und immunofluoresc hängig für ISL1 FBM Neuronenwanderung in einem Explantat illustrieren markiert, beide Ventrikel (A) und Pia (B) Seiten der Rautenhirn gezeigt sind (C, D) E11.5 Wurf hindbrains wurden in der Gegenwart von Heparin implantiert Wulst getränkten kultiviert. in PBS (C) oder VEGF 165 (D); FBM beachten Sie, dass Neuronen in Richtung und auf die VEGF165 Wulst migriert und die wandernde Strom daher weiter ausgebaut kaudal im Vergleich zu der unbehandelten Seite der gleichen Hinterhirn oder Hinterhirn, das die Steuer Wulst (E. , F) Beispiele für unbefriedigend E11.5 hindbrain Explantaten, wobei FBMs nicht von r4 wandert (E), oder in denen das Hinterhirn Gewebe während der Kultur (F) gefaltet. Die Mittellinie ist mit einem Stern in jeder Tafel angegeben. Maßstabsbalken (für alle Panels): 200 um. V, ventrale, P, Pia."> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Wholemount Kultur von E11.5 Maus hindbrains in einem Transwell-Systems, um die Migration von FBM Neuronen zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht hindbrain Motoneuronen der Maus für einen Zeitraum von 24 Stunden am Leben und Migration gehalten werden, wodurch ex vivo-Manipulation. Dieses Verfahren besitzt zahlreiche Vorteile für experimentelle Forscher versucht, die molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Migration zu identifizieren. Während traditionelle Migrationsassays Explantation kleinen Nervengewebe in Stücke Matrix auf Kulturschalen ermöglichen Beobachtung einzelner Neuronen, wie sie auf exogene Stimuli zu reagieren, ein Hauptvorteil der Transwell-Assay ist seine Eignung für die Migration Neuronen innerhalb der Wirtsorgan Umgebung beeinflussen und damit eine weitere physiologischen Kontext. Wichtig ist, dass Stoffe ohne weiteres an die Ex-vivo-Hinterhirn-Explantate angewandt, um ihre Wirkung auf die neuronale Migration zu testen, Umgehung möglichen Nebenwirkungen in Verbindung gebracht werden mit administeRing, die diese Stoffe zu einer schwangeren Maus. Schließlich erlaubt die Ex-vivo-Modell auch die Prüfung von Stoffen, die die Plazentaschranke, wie funktionsblockierende Antikörper nicht kreuzen. Aufgrund dieser Vorteile bietet die ex vivo-Kultur hindbrain eine alternative und ergänzende Methode zur Verwendung von Zebrafisch-Embryonen, die mit wasserlöslichen niedermolekularen im Aquarienwasser oder in utero Elektroporation der embryonalen Gehirn, was den Einsatz von Spezial erfordert behandelt werden können, Ausrüstung und ist schwieriger zu beherrschen als der hier beschriebenen Kulturverfahren. Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist dessen Eignung für das Implantieren Perlen in rekombinantes Protein oder andere Reagenzien eingeweicht, so dass deshalb die Anwendung eines Hühnerembryos entwickelt, um zu einem Mausmodell der neuronalen Migration manipulieren Standard embryologischen Verfahren. Insbesondere kann der Ex-vivo-Kulturmodell zu hindbrains von gentechnisch veränderten Mäusen angewandt werden defekttive in spezifischen Molekülen in der neuronalen Wanderung beteiligt, wie z. B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder Führung, und mit Wulst Implantate zu testen, ob Reaktion auf Liganden verloren. Zusätzlich zu pharmakologischen Manipulation kann die ex vivo-Kulturverfahren auch geeignet ist, um Expressionsvektoren, die die Expression von Genen von Interesse manipulieren könnte Elektroporation werden, geeignete Verfahren für die Elektroporation wurden zuvor beschrieben 22,23. Dieses Protokoll kann auch angepasst, um Neuronenmigration durch Zeitraffer-Mikroskopie in der Hinterhirn Explantate von transgenen Mäusen enthält fluoreszenzmarkierten FBM Neuronen, z. B. Isl1-Cre visualisieren; Rosa26Yfp 21. Schließlich kann dieses Protokoll auch verwendet werden, um andere Arten von migrierenden Neuronen im Hinterhirn, wie diejenigen, die den unteren Olive bilden studieren, was allerdings die Verwendung von hindbrains bei älteren embryonalen Stadien erfordern und Kultur für bis zu 48 Stunden benötigen, abhängig von neuronalen Lebensfähigkeit Kritische Schritte und Fehlersuche Für den Erfolg dieses Protokolls ist es entscheidend, dass die Embryonen werden früh am Tag E11.5, E11.25 näher an, wenn FBM Neuronenmigration hat gerade erst begonnen gesammelt. Allerdings ist es nicht immer möglich, Embryonen auf dieser Entwicklungsstufe fangen aufgrund der natürlichen Variabilität Paarung von Mäusen, und dementsprechend kann es eine gewisse Variabilität in der Umfang der FBM Migration zwischen verschiedenen Experimenten. Variabilität in FBM Migration kann auch beobachtet, wenn das Experiment nicht innerhalb des Zeitrahmens zugeordnet abgeschlossen, etwa 3 h, wie in Fig. 3E zu sehen ist. Hinterhirn Gewebe von Maus-Embryonen E11.25 ist zart. Bei der Analyse und in dem Explantat Verfahren ist es wichtig, das Hinterhirn Gewebe im Bereich von R4-R6, in dem die FBM Zellen befinden nicht reißen. Wegen der empfindlichen Natur der dissbschnitt Prozess, und weil die Geschwindigkeit, mit der hindbrains werden in Kultur genommen beeinflusst Ergebnis, könnte das Verfahren nehmen ein paar Trainingsläufe zu meistern, insbesondere vor der kostbaren Proben oder Reagenzien verwendet werden. Schließlich ist es wichtig, dass das Hinterhirn Gewebe in einem offenen Buch-Konfiguration auf dem Kultureinsatz gelegt, weil Falten des Hinterhirn Gewebe während der Kultur wird die normale FBM Migration zu verhindern (siehe Abbildung 3F).
Disclosures
Keiner der Autoren konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte.
Acknowledgments
MT wird von einem Doktoranden-Stipendium [ref unterstützt. 092839/Z/10/Z] und CR von einem New Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] aus dem Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., et al. The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. Biol, D. ev. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -L., Heisenberg, C. -P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
