Summary
Embriyonik nöronlar nöral tüp ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak uygun hedeflere ulaşmak için göç edilir. Yüz branchiomotor (FBM) nöronlar nöronal göç incelemek için yararlı bir model vardır. Bu protokol FBM göçünü düzenleyen mekanizmaların araştırılması fare embriyo hindbrains arasında Wholemount ex vivo kültür açıklar.
Abstract
Embriyonik nöronların beynin ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak daha sonra uygun hedeflere ulaşmak için yeni hedeflere göç edilir. Işbirliği embriyonik beyinde nöronal göç rehberlik moleküler sinyalleri deşifre karmaşık sinir ağları daha sonra doğum sonrası yaşama destek veren formu nasıl anlamak için önemlidir. Fare embriyosu arka beyin Yüz branchiomotor (FBM) nöronları arka beyin ve R6 türetilmiş bölgesinde eşleştirilmiş yüz çekirdeklerini oluşturmak için rhombomere (r) 4 kaudal göç ederler. Burada FBM göç düzenleyen sinyal yollarını araştırmak için uygun fare embriyo hindbrains arasında Wholemount ex vivo kültür için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntemde, E11.5 fare embriyo hindbrains 24 saat boyunca hücre kültürü ekler üzerinde açık bir kitap hazırlanmasında kesildi ve kültüre edilir. Bu süre boyunca, FBM nöronlar R6 doğru göç kaudal ve bloklama yapmayan antikorların fonksiyon ve küçük Moleküller maruz kalabilirnöronal göç yol gösterilen sinyalleme yolaklarında roller incelemek için, rekombinant proteinleri ile yüklenen kültür ortamı heparin ya da tanelerinde es.
Introduction
Embriyonik nöronların beynin ventriküler bölgesinde doğmuş, ancak daha sonra büyük bir mesafe bulunmaktadır uygun hedef bölgelerine ulaşmak için yeni hedeflere göç edilir. Gelişmekte olan beynin ön-ventral ve ön-arka eksen boyunca uygun yerlere nöronal hücre organlarının doğru konumlandırma göçmen aşamasında 1-4 sonra doğru kablolama, hayatta kalma ve bu nöronların fonksiyonu için gereklidir. Akson rehberlik 5-7 kontrol moleküler mekanizmalarına benzer, çekici ve itici ipuçlarının birleştirici setleri göç nöronlar 1,8 rehberlik düşünülmektedir. Ancak, birden fazla hücre türlerine etkileşimler, nöronal göçü kontrol sinyalleri daha az yaygın olarak bağımsız hücre incelenebilir akson rehberlik, katılan daha incelenmiştir. Omurgalıların gelişmekte Beyin moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için birkaç son çalışmalarda kullanılmıştırnöronal göç, civciv, fare ve zebra balığı 1-4,9 örneğin. Bu organ, birkaç precerebellar alt tipleri ve motor nöronlar 5,7,10,11 dahil nöronlar birkaç farklı tiplerini içerir.
Beyin motornöron zemin plakası yakın ventriküler bölgesinde doğmuş ve menşe 1,12 kendi rhombomere göre belirli alt kümeleri ayırt edilir. Yüz branchiomotor (FBM) nöronlar arka beyin bölgesinde rhombomere (r) 4 üretilen ve yüz kasları 2,9,13 innerve ikinci brankial kemer içine dorsal bir r4 çıkış noktasından aksonları uzanır. Zebra balığı ve fareler FBM nöronlar bu nöronlar tekrarlanabilir bir spatiotemporally iyi tanımlanmış süreç içinde somata translocate, çünkü kolayca görüntülenmiştir bir süreçte nöronal göç moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sağlar. Farelerde, FBM nöronlar ilk cau göççattı r5 yoluyla ve daha sonra hem kaudal ve ventral olarak onlar VII kranial sinir (VIIn) 10,11,14 ve eşleştirilmiş çekirdekleri oluşturmak R6, topraklarında arka beyin ve Pial tarafında kendi nihai konuma ulaşmak için. Zebra balığı, FBM nöronlar başlangıçta ventrale göç ve ardından laminin-bağımlı bir şekilde 4,12,15,16 pial yüzeyine doğru göç devam r4-r5 sınırında yönünü değiştirmek. Bu göç gelişmesinde birkaç günlük bir süre boyunca devam eder ve bu iki farklı süreçleri aracılık moleküllerinin tanımlanmasına izin veren, teğet ve radyal göç evreye ayrılabilir. Buna karşılık olarak, civciv embriyosu arka beyin bölgesinin FBM nöronlar r4 3,13,17-19 kalır.
Göçleri sırasında, FBM nöronlar homoeodomain transkripsiyon faktörü adacık 1 (Isl1) 14 kendi ifadesi ile, diğer türleri veya motor nöronları gibi, tespit edilebilir. Bu nedenle, wholFarklı gelişme aşamalarında, bu marker için emount immünofloresan boyama ya da in situ hibridizasyon zebrabalıkları veya fare 4,15,16 olarak R6 r4 uzanan FBM somata en belirgin göç akışı ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu tür Isl1-GFP floresan transgenik muhabir zebrabalıkları 3,17-19 içinde FBM nöronlar göç görselleştirmek için uygun bir araç olarak kullanılmıştır. Serbest yaşayan embriyoları hücre nakli teknikleri ve akvaryum suya doğrudan uygulanan farmakolojik bileşikler ile kolayca manipüle edilebilir, çünkü görüntüleme için uygunlukları ek olarak, pek çok araştırmacı, zebra balığı gelişmekte FBM nöronların göç inceledik. Buna karşılık olarak, fare embriyosu rehberlik sufle veya plasenta engeli çapraz olmayan fonksiyonu bloke edici antikorların verilmesini taşıyan boncukların implantasyonu engelleyen, rahim içine geliştirir. Ayrıca, hamile anneye uygulanan farmakolojik bileşikler un olabilirdolaylı embriyojenezinin bozabilir istenen yan etkileri. Bu sınırlama engellemeyi, biz 7,16 explanting sonra 24 saat boyunca FBM nöron göç ve yaşam ile uyumlu tüm fare arka beyin için bir ex vivo kültür yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, kolay farmakolojik manipülasyon, rehberlik ipuçları veya fonksiyon-bloke edici antikorların verilmesini taşıyan boncuk yerleştirilebilmesine ve aynı zamanda farklı gelişim aşamalarında arka beyin diğer nöronal alt tiplerinin göçünü incelemek için uyarlanabilir.
Protocol
1.. İsteğe bağlı: FBM Atraksiyon Testi için Affı-jel Heparin Boncuk (Jel Boncuk) hazırlayın
NOT: eksplant prosedürü başlamadan önce en az 1 gün jel boncuk hazırlayın.
- Oda sıcaklığında (RT) bir silindir üzerine 20 dakika için steril PBS ile 100 ul jel heparin boncuk süspansiyonu yıkayın.
- 13000 x g, 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde Pellet boncuk. Steril PBS ekleyin ve yıkama işlemi 4x tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, PBS kaldırmak ve solüsyon ile boncuk kapsayacak şekilde bakımı, tercih edilen bir yeniden birleştirici protein ihtiva eden bir steril çözelti, küçük bir hacim içinde boncuk ıslatın. Bu protokol daha önce yayımlanmış bir deney 16 üretmek için PBS içinde 100 ul / ng yeniden birleştirici insan VEGF165 kullanır.
- 4 ° C 'de bir silindir üzerinde 12 saat arasında, en az rekombinant protein çözeltisi ve 1 haftalık bir maksimum ile jel boncukları heparin inkübe
2. Kültür Ekle Kaplamas
Arka beyin eksplantlar Corning kültürü üzerinde kültürlenmiştir, bir 8 um gözenek büyüklüğü ya da eşdeğer bir ekler ile ekler. Kültür uçlar da, damıtılmış su ile yıkandı, etanol ile sterilize edilmesi ve gerekli olana kadar% 70 etanol içinde saklanır verilen, protokolün tamamlanmasından sonra yeniden kullanılabilir.
Not: Aşağıdaki adımlar, steril koşullar altında bir akış başlığı içinde yapılmalıdır.
- B27 (20 ul / ml) ile takviye edilmiş ortam Neurobasal oluşan eksplant kültür ortamı hazırlayın, glikoz (6 mg / ml) ve penisilin / streptomisin (5 ug / ml).
- Yıkama kültür 5 dakika ve akış kaputu altında 5-10 dakika boyunca kuru için steril PBS ile ekler.
- Bir 12well plakanın her oyuğuna ayrı ayrı bir kültür koyunuz. Not: ekler kuyunun içine sıkıca küçük bir itme gerekebilir.
- , Neuro temelli ortam içinde 10-20 ug / ml fare laminin ile kültür uçları Kapak ve 37 ° C,% 5 CO (bir doku kültürü inkübatörü içinde, koyun
3. E11.5 fare embriyoları Hindbrains diseksiyonu
- Embriyonik günde bir etik onaylı prosedüre (E) 11.5 ile zamanlanmış hamile kadın fare itlaf ve buz L15 ortamı ile 100 mm plastik tabak embriyoları içeren rahim yerleştirin.
Not: Tüm adımlar diseksiyon buz soğukluğunda L15 olarak gerçekleştirilmelidir. - Diseksiyon mikroskobu kullanılarak ve Dumont saatçi, embriyolar maruz rahim kas duvarı gözyaşı her embriyo bırakın, göbek bağını koparmak ve dikkatle sarısı kesesi kaldırmak, sayısı 5 forseps.
- Geniş çaplı bir açıklığı olan bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buz soğukluğunda L15 ile temiz bir plastik çanak içine her embriyo transferi.
- Dumont forseps kullanarak, sadece ön ayakları üzerinde embriyo başını kesmek. Deney embriyoların genotiplendirmesi gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için doku örnekleri toplamak (örneğin küçük piecyolk kesesi veya kuyruk ucu 16,20) e.
- Kadar baş sırt tarafını çevirin ve ince bir doku tabakası (Şekil 2B) ile kaplıdır 4. ventrikül, tanımlamak. Dikkatle roofplate delmek ve arka arka beyin ve omurilik üzerinde orta hat boyunca caudally bunu soyulmaya başlar ve rostrally Ortabeyin bitti. Beyin artık (Şekil 2C) maruz olmalıdır.
- Dikkatle kalan baş mezenşimi ve arka beyin (Şekil 2B) ve Pial tarafına bağlı herhangi meninks uzak kızdırmak.
- Beyin unfurls böylece orta beyin ve omurilik dokusu çıkarmak ve açık bir kitap hazırlanması (Şekil 2E) düz yalan olabilir.
- Geniş çaplı bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buzla soğutulmuş L15 ihtiva eden bir 12-yuvalı plaka her kesilmiş arka beyin transferi ve hindbrains parçalara edilene kadar buz üzerinde saklayın.
- Geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, bir günah aktarmakbunu yaklaşık 100 ul L15 bir damlacık kadar açık bir kitap hazırlama, ventriküler tarafını tutarak boş bir çanak gle Beyin,.
- Aynı damlacık için kuluçkalanmıştır heparin jel boncuklarının birkaç mikrolitre aktarın. Not: boncuk büyüklükleri değişken olduğu için, bu yaklaşık 10 boncuk transferi ve daha sonra arka beyin içine nakil için optimal boyutunu seçmek tavsiye edilir.
- Arka beyin dokusunda küçük bir gözyaşı yapın ve dikkatli bir şekilde doku içine düşürülmesi, orta hat ve arka beyin yanal kenarı arasında yaklaşık yarım, R5 / 6 düzeyinde arka beyin dokusuna 1-3 jel boncukları eklemek ve böylece boncuk sadece arka beyin yüzeyinin altında konumlandırılmış.
NOT: diseksiyon prosedür deneyimine bağlı olarak, 5-20 dakika / arka beyin arasında sürebilir, ve yavrular büyük ise uzun bir süre içinde streç olabilir, herhangi bir durumda, hindbrains iyi için 3 saat otopside daha artık kültür olmalıdır Sonuçlar.
4. BeyinEksplant Culture
- Inkübatör kültür ekler içeren plakasını sökün, laminin kaplama çözüm aspire.
- Kültür insert (Şekil 2G) üzerine kadar her Beyin ventral tarafı aktarmak, geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, buz L15 ile dolu ayrı bir kültür çanak içine bir kültür koyunuz. Beyin uç zarı tamamen düz durmalıdır.
- Dikkatle çanak kültürü eki kaldırın ve aşırı sıvı kaldırmak için temiz doku kağıt üzerinde bunu birkaç kez hafifçe sürün. Bu işlem, arka beyin, düz ve açık bir kitap hazırlanmasında kültür inserte yapışmasını sağlar. Beyin yukarı kıvrılan varsa, onun doku geri dönüşümsüz birlikte büyümek olabilir.
- 500 ul önceden ısıtılmış kültür ortamı ile orijinal 12-plaka doldurun ve de bu geri yerleştirirler. Dikkatle Beyin şamandıra etmez sağlanması, sadece arka beyin karşılamak için başka bir medya 400-600 ul ile ses seviyesini ayarlamakzar kapatır. Bu yüzer ise, 4,4 adım ve arka beyin zara bağlı kalır kadar tekrar geri dönün.
- Bu aşamada, bu FBM nöronların göç üzerindeki etkisini incelemek için ortama ilgi biyolojik inhibitörlerinin ilave edilmesi de mümkündür.
NOT: boncuk implante veya diğer tedavileri uygulamak, bu deney başarıyla kurulduktan emin olmak için her deneyde, normal büyüme koşulları altında en az 2 kontrol eksplantlarının korumak için tavsiye edilir. - Bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2) içinde 24-30 saat boyunca inkübe eksplantlar.
5. Beyin eksplant Wholemount Immunofluorescent Boyama
- Her kuyudan aspire ortam, PBS ile durulayın ve buz soğukluğunda% 4 formaldehit (PBS içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid, taze hazırlanmış ya da taze çözülmüş) içinde hafif bir çalkalama ile 4 ° C'de 2 saat boyunca düzeltin. Not: fiksasyon öncesi kültür Ovülden arka beyin kaldırmak için çalışmayıntamamlandı.
- 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle Dumont forseps kullanarak kültürü ekler gelen hindbrains soyun. Bazı eksplantlan kalkmasına zordur, ancak genellikle tekrar tekrar pipetle PBS kovma yoluyla hafif bir basınç uygulayarak kaldırılabilir.
- Immünfloresans etiketleme için 2.0 ml'lik yuvarlak dipli tüpler hindbrains aktarın. Yumuşak haddeleme ile,% 0.1 Triton X-100 (PBT) ihtiva eden PBS içinde oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hindbrains geçirgenliği.
- Yumuşak haddeleme ile% 10 ısıyla inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Isl1 için spesifik birinci antikor ile 5 gün boyunca 4 ° C'de nazik bir haddeleme ile inkübe eksplantlar,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT içinde 1:100 oranında seyreltildi.
- 15 dakika her biri için PBT ile RT 4x de eksplantlar yıkayın.
- Fluorofor ile konjüge edilmiş keçi anti-fare antikoru (örneğin, Alexa Fluor 488 keçi anti ile, 3 saat boyunca oda sıcaklığında hafif bir haddeleme ile eksplantların inkübeFare,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT) 1:200 seyreltilmiştir.
- Eksplantlar yumuşak haddeleme ile 15 dakika her biri için PBT ile oda sıcaklığında 4x yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde eksplantlar sonek.
- Eksplantlarının için bir cep oluşturmak için 3 siyah elektrik bandı katmanları ve bir neşter katmanlı bant küçük bir kare ile ÖTV ile bir cam slayt kapağı; alternatif olarak, bir depresyon cam slayt kullanın.
- Bir cebine Slowfade reaktif içinde her arka beyin montaj ve dikkatli bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak tuzak hava kabarcıkları ve görüntü kaçınarak, bir cam lamel ile kaplayın.
Not: immun boyama için bir alternatif olarak, FBMS (örneğin Isl1 veya Phox2b) tanıyan riboprobes ile in situ hibridizasyon FBM nöronlar 16,21 görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
Adımlar ve zamanlama Özeti
~ 14 gün: E11.25 gebelik elde Çiftleşmeyi Zamanlı
İsteğe bağlı: Boncuk hazırlık (Protocol 1): embriyo öncesi izolasyon gününde ~ 2 saat,
Kültür ekler ve medya (Protokol 2) hazırlayın: ~ 30 dk önce, embriyo izolasyon
Embriyo izolasyon ve Beyin diseksiyonu (3,1-3,4 adımlar): ~ 10 dk / embriyo
Beyin diseksiyonu (3,5-3,7 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin
Eksplant prosedürü (3,8-3,9 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin
İsteğe bağlı: boncuk implantasyon (3,10-3,11 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin
Eksplant kültür (adım 4.7): 24 saat
Antikor boyama Fixation (adım 5.1): 2 saat
Boyama prosedürü ve görüntüleme (Protokol 5): 5 gün
Representative Results
Bu bölüm, ex vivo kültür yoluyla fare arka beyin nöron FBM içinde göç inceleyerek elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Bu 11 günlük fare embriyolarından eksplante hindbrains olarak FBM nöronlar ilk teğetsel geçiş (Şekil 3A) tabi tutulur ve daha sonra in utero davranışları benzer yüz motor çekirdeği (Şekil 3B), (Şekil 1) monte başlar göstermektedir. Biz daha önce gösterildiği gibi, 16, VEGF165 batırılmış boncuk implantasyon, FBM nöronlar (Şekil 3C ve 3D) çeken göstermektedir. Perfüze olmayan damar kültür 16 bozulur çünkü Daha da önemlisi, bu protokol, kan damarları ya da rahimde FBM göç etkileyebilmektedir damar kaynaklı faktörler yokluğunda FBM göç okuyan sağlar. Taze üzerinde Isl1 fare antikoru kullanılarak Böylece, spesifik kan hücresi etiketleme görülmektedirizole edilmiş fare hindbrains (Şekil 1) kültür (Şekiller 3A-F), 24 saat sonra, artık arka beyin dokusunda bulunur. Arka beyin embriyo izolasyonu (Şekil 3E) sonra ya da yakında eksplante değildi çünkü Son olarak, ya da, eksplante doğru ve bu nedenle de anormal dağılımında FBM nöronlar içeren değildi hindbrains iki örnek göstermek için (transwell içinde katlanmış arka beyin dokusu Şekil 3F).
Şekil 1. FBM nöron göç Isl1 Wholemount immunolabeling ve flatmounting sonra yabanıl tip fare hindbrains Konfokal z-yığını,.. Bir E11.5 arka beyin ve arka beyin orta hat tüm panellerde bir yıldız işareti ile belirtilen (A) Ventriküler yüzey R6 R4 kendi teğet göç gösteren Isl1 pozitif FBM nöronlar (ok) içeren bir alan;. Anlage ihtiva eden bölgede, aynı arka beyin yarısı içinde R4, R5 ve R6'nın konum belirtilmiştir (A ') Pial yüzey . teğet (ok) göç FBM nöronların ihtiva eden bir E12.5 arka beyin bölgesinin (VIIn ile gösterilir) eşleştirilmiş FBM çekirdeklerin biri, hem de diğer Isl1 pozitif nöron popülasyonlarının (B) Ventriküler yüzey, ok ucu bir örnek gösterir spesifik olmayan Isl1 fare IgG antikoru belirlemek için kullanılan anti-fare ikincil antikoru çapraz reaksiyon ile etiketlenir dolaşımdaki hücreleri ihtiva eden bir kan damarının. (B ') içeren aynı E12.5 arka beyin, bir yarısının Pial yüzey Eşleştirilmiş FBM çekirdeklerin bir. Orta hat, her panelde bir yıldız işaretiyle gösterilir. Ölçek çubuğu (tüm paneller): 200 mikron. V, ventral, P, Pial./ 51397fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. E11.5 fare Beyin diseksiyonu ve ex vivo kültür. (AE) E11.5 Beyin diseksiyon protokolü Anahtar adımlar; ölçek çubuğu:. Uzakta ön ayakları seviyesinde embriyonun kalanından kesildi sonra embriyonun 1 mm (A) Baş (B) bir rostral kısmı. baş çıkarıldı ve 4. ventrikül (ok) yukarı doğru dönük olduğu kadar kafa dokusunun geri kalan kısmı bir yer. (C) 4. ventrikül Çatı soyulur, ve arka beyin uzak arka beyin altında doku soyulması ile ortaya edildi rostrally ve kaudal. (D) Pial membran (bu eski unutmayın çıkarıldıgeniş, bir servikal spinal kord (SC) ya da doku) arka beyin bağlı kalmıştır. (E) Fazla orta beyin (MB) ve omurilik (SC) ya da doku, sadece arka beyin korumak için kaldırılmıştır. (F) kültür ekleri ile kaplanmıştır laminin ve bir 12 gözlü bir doku kültür levhası içine yerleştirildi. (G) her bir arka beyin bir elemanının üzerine yerleştirilir ve ortamı ile kaplandı. (H) kültür 24 saat boyunca FBM nöronlar (mavi) göç tarafından alınan yolun şematik temsili. tıklayın Daha büyük resmi görmek için.
Şekil 3,. Fare Beyin ex vivo kültür. (A, B) bir arka beyin E11.5 24 saat ve immunofluoresc için kültürlendi ently bir eksplant içinde FBM nöron geçişini göstermek için Isl1 etiketlenmiştir, ventriküler (A) ve pial arka beyin (B) kısımlarının her iki gösterilmiştir (C, D) E11.5 yavru hindbrains soaked implante boncuk heparin mevcudiyetinde kültürlenmiştir. PBS (C) ya da VEGF165 (D) içerisinde; FBM nöronlar doğru ve VEGF165 boncuk üzerine göç ve göç eden akım, bu nedenle, aynı arka beyin veya kontrol tanesi ihtiva eden arka beyin ve muamele edilmemiş tarafa göre daha fazla kaudal uzatılmış unutmayın (E. , tatmin edici E11.5 arka beyin FBMS R4 göç yok ettiği eksplantlar, (E), veya F) örnekleri, burada kültür (F) boyunca katlanmış arka beyin dokusudur. Orta hat, her panelde bir yıldız işaretiyle gösterilir. (Tüm paneller için) Ölçek çubuğu: 200 mikron. V, ventral, P, Pial."> Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol FBM nöronların göç incelemek için bir Transwell sistemde E11.5 fare hindbrains en wholemount kültür açıklar. Bu protokol Fare Beyin nörotoksinlerini ex vivo işleme ortamı, 24 saat bir süre için canlı ve göç tutulması sağlar. Bu yöntem, nöronal göç moleküler ve hücresel mekanizmaları tespit etmek isteyen araştırmacılar için çok sayıda deneysel avantajlara sahiptir. Geleneksel geçiş deneyleri kültür çanakları üzerinde matris içine küçük sinir doku parçaları eksplant ve eksojen uyaranlara yanıt olarak tek tek nöronların gözlem olanak ise, transwell tahlilinde önemli bir avantajı, ana organı ortamı içinde göç nöronlar işlemek için uygunluğu ve bu nedenle daha fazla fizyolojik bağlam. Önemli olarak, maddeler, hali hazırda administe ile ilişkili muhtemel yan etkilere engellemeyi, nöronal göç üzerindeki etkisini test etmek için ex vivo arka beyin eksplantlar uygulanabilirhamile bir fare bu maddeleri halka. Son olarak, ex vivo modeli, aynı zamanda, işlevi ve bloklama yapmayan antikorların olarak plasenta engeli, çapraz olmayan maddelerin test edilebilir. Bu sebeplerden dolayı avantajları, ex vivo kültür arka beyin akvaryum su içinde veya özel kullanımını gerektirir embriyonik beyinlerinin utero elektroporasyon, 'de suda çözünür küçük moleküller ile tedavi edilebilir zebra balığı embriyolar, kullanarak alternatif ve tamamlayıcı bir yöntem temin etmektedir Ekipman ve burada açıklanan kültürü tekniği daha usta daha zordur. Burada tarif edilen protokol bir başka avantajı, bu nedenle nöronal göç bir fare modeli civciv embriyo işlemek için geliştirilen bir standart embriyolojik yöntemin uygulanmasını sağlayan, yeniden birleştirici proteini veya diğer reaktifler batırılmış boncuk implante olan amenability olduğunu. Özel olarak, ex vivo kültür modeli genetik olarak farelerin hindbrains tatbik edilebilir arızalıgibi büyüme faktörü reseptörleri ya da yönlendirme gibi nöronal göç karıştığı spesifik molekülleri, in göstermeyen primer ve ligandlara yanıt kayıp olmadığını test etmek için boncuk implantlar ile birlikte. , Farmakolojik manipülasyonlara karşı ek olarak, ex vivo kültür protokolü de ilginç genlerin ekspresyonunu idare edebilir ifade vektörlerini elektroporasyonu için adapte edilebilir, elektroporasyon için uygun yöntemler, daha önce 22,23 tarif edilmiştir. Rosa26Yfp 21; Bu protokol, aynı zamanda, floresanla işaretlenmiş FBM nöronlar, örneğin Isl1-Cre içeren, transjenik farelerden alınan arka beyin eksplantlarında zaman atlamalı mikroskobu ile nöron göç görselleştirmek için uyarlanabilir. Bu büyük embriyonik aşamada hindbrains kullanımını gerektirecektir ve en fazla 48 saat boyunca kültür gerekebilir, ancak son olarak, bu protokol, aynı zamanda, bu tür alt zeytin oluşturdukları gibi arka beyin içinde göç nöron diğer türleri, çalışma için kullanılabilir, nöronal canlılığı bağlı olarak Kritik adımlar ve sorun giderme Bu protokolün başarısı için, embriyolar FBM nöron göçü sadece başladı E11.25, yakın günlük E11.5, erken toplanan çok önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni birleşme farelerin doğal değişkenlik için bu gelişme aşamasında embriyolar yakalamak ve buna göre farklı deneyler arasında FBM göç uzanan bazı değişkenlik olabilir, her zaman mümkün değildir. Deney Şekil 3E de görülebileceği gibi, atanan zaman çerçevesi içinde, yaklaşık 3 saat tamamlanmaması durumunda FBM göç değişkenlik de gözlenebilir. E11.25 fare embriyoları Beyin dokusu hassastır. Kesme ve eksplant prosedür boyunca, bu FBM nöronların bulunduğu r4-R6 arasındaki alanlarda arka beyin doku yarılmaması önemlidir. Nedeniyle Diss hassas doğasıhindbrains kültürün içine yerleştirilir hangi hız sonucu etkiler ection süreç, çünkü, prosedür kıymetli numuneler veya reaktifler kullanılır özellikle önce, uygulama bir kaç usta çalışır sürebilir. Son olarak, kültür sırasında arka beyin dokusunun katlanır (Şekil 3F bakınız), normal FBM göçünü önler, çünkü arka beyin doku kültürü uçta açık bir kitap konfigürasyonda yerleştirilir önemlidir.
Disclosures
Yazarların hiçbiri çıkarlarını veya çatışan çıkarları rekabet var.
Acknowledgments
MT Bir Doktora Öğrenciliği [ref tarafından desteklenmektedir. Yeni Araştırmacı Ödülü [ref tarafından 092839/Z/10/Z] ve CR. 095623/Z/11/Z] Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., et al. The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. Biol, D. ev. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -L., Heisenberg, C. -P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
