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Immunology and Infection

एचआईवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और इंटिग्रेस inhibitors की तेजी से जांच

Published: April 9, 2014 doi: 10.3791/51400
Automatic Translation
1, 1
1HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute

Summary

यहाँ हम सेलुलर cytotoxicity का वर्णन है और यौगिकों के तेजी से और सही जांच के लिए अनुमति देते हैं कि एक दौर संक्रामकता assays उनके सेलुलर cytotoxicity (सीसी 50) निर्धारित करने के लिए और गुम्मट और दवा एचआईवी -1 प्रतिरोधी के खिलाफ आईसी 50 मूल्यों.

Abstract

विरोधी एचआईवी दवाओं की एक संख्या अनुमोदित किया गया है, विषाक्तता और दवा प्रतिरोध के साथ समस्या अभी भी वहाँ हैं. यह कम से कम विषाक्तता के साथ आम दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 उपभेदों द्वारा संक्रमण को बाधित कर सकते हैं कि नए यौगिकों की पहचान करने के लिए एक आवश्यकता को दर्शाता है. यहाँ हम तेजी से सेलुलर cytotoxicity और WT और उत्परिवर्ती वायरल उपभेदों के खिलाफ एक यौगिक की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल परख का वर्णन.

वांछित लक्ष्य सेल लाइन एक 96 अच्छी तरह से थाली में वरीयता दी गई है और एक 24 घंटे ऊष्मायन के बाद, परीक्षण किया जाना यौगिकों के क्रमानुसार dilutions जोड़ रहे हैं. आगे कोई जोड़तोड़ सेलुलर cytotoxicity assays के लिए आवश्यक हैं; विरोधी के लिए एचआईवी luciferase कोशिकाओं को जोड़ा है व्यक्त करता है कि एक गुम्मट या दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 वेक्टर या तो की एक पूर्व निर्धारित राशि assays. Cytotoxicity एक एटीपी निर्भर luminescence परख और संक्रामकता पर यौगिकों के प्रभाव का उपयोग करके मापा जाता है lucife की राशि का निर्धारण से मापा जाता हैउपस्थिति या ख्यात inhibitors के अभाव में चुनना.

इस स्क्रीनिंग परख पूरा करने के लिए 4 दिन लगते हैं और कई यौगिकों समानांतर में जांच की जा सकती है. यौगिकों तीन प्रतियों में जांच कर रहे हैं और डेटा लक्ष्य यौगिकों के अभाव में संक्रामकता / एटीपी स्तर के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. इस तकनीक को संभावित विरोधी एचआईवी यौगिकों की प्रभावकारिता और विषाक्तता का एक त्वरित और सटीक मापन प्रदान करता है.

Introduction

एचआईवी -1 वायरल जीवन चक्र में कई आवश्यक कदम को लक्षित दवाओं की उपलब्धता बहुत एचआईवी -1 संक्रमण के उपचार, और लंबे समय तक जीवित रहने में सुधार हुआ है कि संयोजन ड्रग थेरेपी (अत्यधिक सक्रिय एंटी रेट्रोवायरल थेरेपी कहा जाता है, या एचएएआरटी) के लिए प्रेरित किया रोगियों की. आम तौर पर दो न्यूक्लीओसाइड रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) inhibitors और एक protease अवरोध या एक गैर न्यूक्लीओसाइड आरटी अवरोध करनेवाला या तो के संयोजन का उपयोग करता है जो एचएएआरटी,, अब जीवन भर हालत 1-5 में एक घातक बीमारी परिवर्तित किया गया है. हालांकि, वायरल प्रतिकृति के निरंतर दमन में HAART के कई सफलताओं के बावजूद, यह सीमाएँ हैं. HAART एचआईवी उन्मूलन नहीं करता है, तो रोगियों को ठीक नहीं कर रहे हैं और चिकित्सा के जीवन लंबा है. दवा विषाक्तता के साथ और दवा प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के साथ समस्याएं हैं. प्रतिरोध एचआईवी इंटिग्रेस (IN) को लक्षित कि नव स्वीकृत दवाओं सहित अनुमोदित विरोधी एचआईवी दवाओं, सब के लिए पैदा कर सकते हैं. ड्रग प्रतिरोध की संभावना beca उठतावायरल प्रतिकृति (3 एक्स 10 -5 म्यूटेशन / आधार / प्रतिकृति चक्र की त्रुटि दर) के दौरान होने वाले सहज परिवर्तन का उपयोग 6. म्यूटेशन एंटी रेट्रोवायरल दवाओं के लक्ष्य के लिए कोडिंग जीन में उत्पन्न होती हैं, तो ये परिवर्तन के एक छोटे सबसेट दवाओं को वायरल तनाव की संवेदनशीलता में कमी करने के लिए नेतृत्व करेंगे. दवा प्रतिरोध के विकास से बचने के लिए दवा सांद्रता पूरी तरह से एचआईवी प्रतिकृति को दबाने कि स्तरों पर बनाए रखा जाना चाहिए. चिकित्सकीय आहार के लिए गरीब पालन समस्या exacerbates, और प्रतिरोध 7-9 के तेजी से विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दवा सांद्रता के कारण भिन्न अवशोषण, चयापचय, वितरण, और उत्सर्जन के स्तर को रोगियों में भिन्न हो सकते हैं, उच्च दवा सांद्रता विषाक्तता 10 हो सकती है. चिकित्सा रोगी के जीवन के लिए जारी है के बाद से, विरोधी रेट्रोवायरल की दीर्घकालिक विषाक्तता के बारे में गंभीर सुरक्षा चिंताएं हैं. सामान्यतः एचएएआरटी में इस्तेमाल किया विरोधी रेट्रोवायरल प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है एकएन डी दुष्प्रभाव जीवन 11-15 की धमकी दे रहा है जहां घटनाओं किया गया है. रोगियों प्रतिरोध और विषाक्तता के विकास के साथ मुठभेड़ की समस्याओं को प्रभावी ढंग से कम या कोई दीर्घकालिक विषाक्तता के साथ वायरस के आम दवा प्रतिरोधी उपभेदों की प्रतिकृति ब्लॉक कि नई दवाओं को विकसित करने की जरूरत को कायम करना.

इस प्रकार, जल्दी वायरल जीवन चक्र में आवश्यक कदम है कि ब्लॉक यौगिकों के लिए स्क्रीन कर सकते हैं कि एक परख के लिए एक की जरूरत है. यहाँ हम एक यौगिकों और तेजी से और कुशलता से WT और दवा प्रतिरोधी एचआईवी उपभेदों दोनों की प्रतिकृति ब्लॉक करने की क्षमता के cytotoxicity का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल परख का वर्णन. हम उपयोग परख रोगियों 16-18 से अलग वायरस में दवा प्रतिरोध के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया था कि एक परख करने के लिए इसी तरह की है.

परख एचआईवी रिवर्स प्रतिलेखन ब्लॉक कर सकते हैं कि यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए संशोधन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, हम descr जाएगाIBE inhibitors में मूल्यांकन करने के लिए परख का उपयोग कर. में सेलुलर जीनोम 19 में वायरल डीएनए सम्मिलित करता है एक आवश्यक वायरल एंजाइम है. Inhibitors में आशाजनक की एक संख्या विकसित किया जा रहा है, जिनमें से कुछ वर्तमान में, केवल Isentress 20, 21 (भी raltegravir या RAL के रूप में जाना जाता है) नैदानिक ​​परीक्षणों के दौर से गुजर रहे हैं और हाल ही में, Elvitegravir (EVG) 22 और Dolutegravir (DTG) 23 कर दिया गया है एफडीए द्वारा मंजूरी दे दी. इन यौगिकों एचआईवी बी और सेल संस्कृति में गैर बी उपप्रकार दोनों के खिलाफ और रोगियों 24, 25 में सक्रिय हैं. हालांकि, RAL साथ उपचार Y143R, N155H, और G140S/Q148H 24, 26-31 सहित म्यूटेंट, में दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 के लिए चुनता है. N155H और G140S/Q148H भी इन प्रतिरोध म्यूटेशनों के खिलाफ प्रभावी रहे हैं कि किनारा स्थानांतरण अवरोधक (INSTIs) में दूसरी पीढ़ी के डिजाइन और विकसित करने की जरूरत पर जोर दिया जो EVG की प्रभावकारिता, कम.

Protocol

मास्टर स्टॉक्स की 1. तैयारी

  1. DMSO में परीक्षण किया जाना यौगिकों के मास्टर शेयरों बनाओ. 20 मिमी की एक मानक एकाग्रता में शेयरों की तैयारी.
    नोट: 10 मिमी से ऊपर किसी भी एकाग्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख मान्य करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि यौगिकों RAL, EVG, और DTG शामिल हैं.
  2. सुनिश्चित यौगिकों 15 सेकंड के लिए समाधान के लिए कई बार vortexing और 1 घंटे के लिए आरटी पर incubating द्वारा DMSO में भंग कर रहे हैं. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिमी स्टॉक समाधान स्टोर.

यौगिक स्क्रीनिंग के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें की 2. तैयारी

  1. परीक्षण किया जाना सेल लाइन (जैसे अस्पताल या TZM बीएल) चुनें, और (मीडिया में (4000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 4 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व में उन कोशिकाओं के 100 μl बीज जैसे Dulbecco संशोधित ईगल या DMEM मध्यम 5% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम, 5% नवजात बछड़ा सीरम, और एक प्रकार की दवा (50 इकाइयों / एमएल) के साथ साथ strept के साथ पूरकomycin).

वायरस स्टॉक्स के 3. पीढ़ी

32-34 (चित्रा 1, चरण 1 में दिखाया गया है) 293 कोशिकाओं transfecting द्वारा VSV-G-छद्म एचआईवी का उत्पादन.

  1. पूर्व अभिकर्मक के लिए दिन पर, 1.5 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर 100 मिमी व्यास बर्तन पर 293 कोशिकाओं थाली.
  2. कैल्शियम फॉस्फेट विधि 35 का उपयोग करते हुए और 4 VSV (pHCMV जी) की ग्राम - अभिकर्मक के दिन, 16 जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती एचआईवी (ΔLUC pNLNgoMIVR) की माइक्रोग्राम से 293 कोशिकाओं transfect.
  3. कैल्शियम फॉस्फेट वेग के बाद लगभग 6 घंटा फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ दो बार 293 कोशिकाओं को धोने और 48 घंटे के लिए ताजा मीडिया के साथ सेते हैं, कहा जाता है. [DMEM 5% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम, 5% नवजात बछड़ा सीरम, और एक प्रकार की दवा (50 इकाइयों / एमएल) के साथ साथ स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक].
  4. 100 मिमी व्यास से मीडिया को दूर करके supernatants वायरस युक्त फसलबर्तन, आरटी पर 30 मिनट के लिए टर्बो DNase साथ supernatants का इलाज, एक 45 माइक्रोन ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के माध्यम से supernatants फिल्टर, 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर कम गति centrifugation द्वारा supernatants स्पष्ट और संक्रमण assays में तैयार करने के लिए मीडिया में supernatants पतला . -80 डिग्री सेल्सियस पर, aliquots में जम वायरल supernatants स्टोर
    नोट: सतह पर तैरनेवाला में पी 24 की राशि एक एचआईवी -1 पी 24 एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख किट का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है. पी 24 एकाग्रता नमूने में वायरस की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वायरस के लगभग 500 एनजी पूर्व संक्रमण के लिए दिन पर 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / पकवान की एक घनत्व में 60 मिमी व्यास व्यंजन पर चढ़ाया अस्पताल कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं काटा जाता है centrifugation द्वारा एकत्र, धोया, और पीबीएस के 100 μl में resuspended. Luminescence रिपोर्टर जीन परख अभिकर्मक के बराबर राशि जोड़ें और वर्गों 5.4.1 में वर्णित के रूप में luciferase गतिविधि को मापने और5.4.2. कदम 4.6 में चर्चा के रूप में इस से, वायरस का एक उपयुक्त कमजोर पड़ने बनाया जा सकता है.

4. 96 अच्छी तरह प्लेटें में स्क्रीनिंग यौगिक

तीन प्रतियों में प्रत्येक परिसर स्क्रीन और परिणाम औसत.

नोट: वायरल प्रतिकृति पर प्रत्येक परिसर के प्रभाव किसी भी परिसर के अभाव में प्राप्त प्रतिकृति के स्तर को सामान्य से ठीक किया है.

  1. जांच होने की अनुभवजन्य एकाग्रता सीमा निर्धारित करते हैं.
    नोट: आमतौर पर, 11 धारावाहिक dilutions के साथ स्क्रीन स्तंभ और 7 धारावाहिक dilutions के साथ स्क्रीन से थाली स्तंभ परिसर जोड़कर बना रहे हैं पंक्ति द्वारा यौगिक जोड़कर बनाया जाता है. कुओं के सेट में एक तीन प्रतियों कोई यौगिक नियंत्रण के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, एक स्तंभ या एक पंक्ति नकारात्मक / पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए रिक्त रहना चाहिए. वायरस जोड़ा जाता है, तो अंत में, यह एक सेलुलर cytotoxicity या संक्रामकता परख है कि क्या हुक्म चलाना होगा.
  2. तैयार करना20 मिमी शेयर समाधान से धारावाहिक dilutions. (1 टेबल में दिखाया गया है) सांद्रता परीक्षण किया जाना सांद्रता के अनुभव से निर्धारित सीमा के आधार पर चुना जाता है. अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन होने जा रहा है यानी अगर, एक 1 मिमी काम कर स्टॉक कर, 10x वांछित अंतिम एकाग्रता में मीडिया में dilutions तैयार.
    नोट: 50 S 5-10 माइक्रोन से ऊपर आईसी के साथ यौगिकों दवा के विकास के लिए आम तौर पर अच्छा उम्मीदवार नहीं हैं. प्रारंभिक assays में हम केवल गुम्मट वेक्टर के खिलाफ यौगिकों का परीक्षण. प्रभावी ढंग से गुम्मट वेक्टर बाधित वादा किया है कि यौगिकों तो दवा प्रतिरोधी म्यूटेंट के एक पैनल के खिलाफ जांच की जाती है.
  3. (चित्रा 1, चरण 2 में दिखाया गया है) इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह प्लेटें निकालें और तीन प्रतियों में वेल्स को परीक्षण किया जाना यौगिकों के धारावाहिक dilutions जोड़ें.
    नोट: अच्छी तरह से जोड़ा मात्रा अंतिम एकाग्रता के 1/10 मात्रा होनी चाहिए. इस प्रकार, 22 μl / अच्छी तरह से (अंतिम मात्रा पी जोड़ost वायरस अलावा संक्रामकता assays के लिए 220 μl) है. Cytotoxicity assays के लिए, 11 μl / अच्छी तरह से (अंतिम मात्रा 110 μl / अच्छी तरह से है) को जोड़ने.
  4. इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह प्लेटें लौटें. एक सेलुलर cytotoxicity स्क्रीन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह प्लेटें 48 घंटा सेते हैं और आगे कोई जोड़तोड़ प्रोटोकॉल 4 में जरूरत है: प्रोटोकॉल 5 के लिए आगे बढ़ना संक्रामकता assays के लिए, प्रोटोकॉल 4 में निर्देशों का पालन जारी है..
  5. संक्रामकता assays ही. विश्लेषण किया जा यौगिकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे ऊष्मायन की एक न्यूनतम के बाद इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें.
    नोट: इस परिसर एचआईवी वेक्टर साथ पूर्व संक्रमण के लिए कोशिकाओं द्वारा उठाया जा करने के लिए अनुमति देता है.
  6. वायरस 33 के एक शेयर के कमजोर पड़ने की तैयारी, 34 (आमतौर पर लगभग 1:3) अनुपचारित कोशिकाओं में 0.2-1.5 सापेक्ष luciferase इकाइयों (RLUs) के बीच एक luciferase संकेत उत्पादन होगा. एक पूरी थाली Dilu के लगभग 10 मिलीलीटर ले जाएगाटेड वायरस. एक 8 या 12 मल्टीचैनल pipettor का उपयोग, कुओं में से प्रत्येक के लिए वायरस के 100 μl जोड़ें. नकारात्मक / पृष्ठभूमि नियंत्रण वेल्स को वायरस न जोड़ें. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें.
    नोट: वायरस के एक 1:03 शेयर कमजोर पड़ने पर तैरनेवाला में वायरल एकाग्रता लगभग 500 1.0 मिलीलीटर में एनजी दिखा रहा है कि एक पी 24 परख के आधार पर 0.2 -1.5 RLUs के बीच एक luciferase संकेत उत्पादन होगा कि ठेठ कमजोर पड़ने है.

5. तैयारी और 96 अच्छी तरह प्लेटें में cytotoxicity और संक्रामकता का मापन

  1. कुओं से मीडिया aspirate (मीडिया में फिनोल लाल luciferase संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं). अंत में संलग्न एक 200 μl विंदुक टिप के साथ एक गिलास विंदुक का प्रयोग करें. मीडिया के शीर्ष पर शुरू और धीरे - धीरे अच्छी तरह से नीचे कोने की ओर नीचे काम करते हैं. अच्छी तरह से नीचे पर बहुत अधिक समय खर्च करते हैं, या कोशिकाओं को अच्छी तरह से हटाया जा सकता है.
  2. पीबीएस की जोड़ें 100 μl 0.5 मीटर के साथ पूरकप्रत्येक अच्छी तरह से एम 2 MgCl. यह कोशिकाओं को बाहर सूखी नहीं है कि इतनी मीडिया निकाले जाने के बाद तुरंत किया जाना चाहिए.
  3. केवल cytotoxicity assays के लिए, आपूर्ति lyophilized अभिकर्मक की प्रत्येक शीशी Luminescence एटीपी परख का पता लगाने से सब्सट्रेट बफर के 5 एमएल जोड़ें. एक शीशी एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से Luminescence एटीपी परख का पता लगाने से सेल lysis बफर के 50 μl जोड़ें. एक कॉम्पैक्ट thermomixer का उपयोग कर 5 मिनट के लिए आरटी पर 700 rpm पर 96 अच्छी तरह से थाली हिलाएँ.
    2. नकारात्मक नियंत्रण / पृष्ठभूमि कुओं को छोड़कर सभी कुओं को पुनर्गठित Luminescence एटीपी परख का पता लगाने अभिकर्मक के 50 μl जोड़ें. एक कॉम्पैक्ट thermomixer का उपयोग कर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 700 rpm पर हिला. संकेत विकास के लिए समय की अनुमति के लिए 20 मिनट के लिए आरटी पर प्लेटें सेते हैं.
    3. Microplate luminometer का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली पढ़ें.
      नोट: SoftMax प्रो microplate luminometer कार्यक्रम खुला. यकीन luminometer LUMI उपाय पर सेट है5 रीडिंग / अच्छी तरह की संवेदनशीलता पर nescence.
  4. केवल संक्रामकता assays के लिए, आपूर्ति lyophilized अभिकर्मक की प्रत्येक शीशी Luminescence रिपोर्टर जीन परख से सब्सट्रेट बफर के 10 एमएल जोड़ें. एक शीशी प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से पुनर्गठन Luminescence रिपोर्टर जीन परख अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें. संकेत विकास के लिए समय की अनुमति के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    2. खंड 5.3.3 में प्रदर्शन के रूप में एक microplate luminometer का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली पढ़ें.

यौगिकों के लिए सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों की 6. निर्धारण

  1. एक एक्सेल स्प्रेडशीट में microplate luminometer से luciferase डेटा स्थानांतरण.
    1. जवाब दोनों तीन प्रतियों और पृष्ठभूमि / नियंत्रण संकेत डेटा में luciferase डेटा. पूरी एकाग्रता रेंज के लिए औसत तीन प्रतियों संकेत से औसत पृष्ठभूमि / नियंत्रण संकेत घटाना.
      2. <ली> पृष्ठभूमि में यह प्रतिशत निषेध निर्धारित करने के लिए किसी भी परिसर के अभाव में, cytotoxicity या संक्रामकता है, चाहे गतिविधि के खिलाफ एकाग्रता श्रेणियों के लिए औसत संकेत को सही मानक के अनुसार.
      नोट: प्रतिशत निषेध 100 से गुणा दवा के अभाव में luciferase गतिविधि से विभाजित दवा की उपस्थिति में luciferase गतिविधि के रूप में परिभाषित किया गया है.
  2. सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए Kaleidagraph सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग
    1. Empirically निर्धारित एकाग्रता रेंज और Kaleidagraph में luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध दोनों स्थानांतरण.
    2. एक्स अक्ष पर एकाग्रता श्रृंखला और वाई अक्ष पर luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध के साथ डेटा प्लॉट.

Representative Results

परख (चित्रा 1, चरण 1 और 2) सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था, तो luciferase मूल्यों तालिका 2 में प्रस्तुत आंकड़ों सदृश चाहिए एकाग्रता रेंज भर में स्कैन करें.; एक संभावित शक्तिशाली यौगिक बाएं से दाएं luciferase गतिविधि बढ़ रही खोलेगा, और नियंत्रण उच्चतम luciferase गतिविधि नहीं होनी चाहिए. Luciferase गतिविधि एकाग्रता रेंज भर में 0.1 सापेक्ष luciferase इकाइयों (RLUs) से अधिक नहीं है, यह आमतौर पर मिश्रित कोशिकाओं को मार डाला है कि इंगित करता है. Luciferase डेटा से अधिक है या सब धारावाहिक dilutions भर में 2.0 RLUs के बराबर है, तो यौगिकों का परीक्षण सांद्रता में एचआईवी -1 संक्रमण को बाधित करने में सक्षम नहीं थे.

Kaleidagraph (3 टेबल, भाग एक) में luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध बनाम यौगिकों की एकाग्रता की साजिश रचने, रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रदर्शन करने के बाद, टी करने के लिए इसी तरह के परिणाम का उत्पादन होगा तालिका 3, भाग बी में दिखाया नली

चित्रा 1
एचआईवी -1 वायरल स्टॉक और सेलुलर cytotoxicity और एकल दौर संक्रामकता assays के सेटअप के चित्रा 1. तैयारी. चरण 1 में, 293T कोशिकाओं pNL4.3ΔEnv.LUC और VSV जी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं और वायरस 34 निर्माण करने के लिए 48 घंटे के लिए incubated . यह संक्रामकता assays में प्रयोग किया जाता है जब तक वायरस (aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर) काटा और संग्रहीत किया जाता है. चरण 2 के लिए, अस्पताल कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 24 घंटे के लिए incubated. कोशिकाओं तो 3 घंटे के लिए परीक्षण किया जाना यौगिकों के धारावाहिक dilutions के साथ preincubated और फिर वायरस (गुम्मट या दवा प्रतिरोधी या तो) से संक्रमित हैं. एक 48 घंटा ऊष्मायन के बाद, luciferase गतिविधि मापा जाता है.

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तालिका 1. धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रोटोटाइप स्क्रीनिंग ड्रग. एक और अधिक कठोर स्क्रीनिंग आम तौर पर 10 माइक्रोन से शुरू और 0.0005 माइक्रोन पर समाप्त जो 11 धारावाहिक dilutions शामिल है. धारावाहिक dilutions 10x तैयार कर रहे हैं; कोशिकाओं के 100 μl और अच्छी तरह से प्रत्येक में वायरस के 100 μl) कर रहे हैं. इस मात्रा और इन गणनाओं के बाद कम, धारावाहिक dilutions एक पूरे 96 अच्छी तरह से थाली की 3 पंक्तियों के लिए पर्याप्त होगा. cytotoxicity assays इसी तैयार कर रहे हैं; हालांकि 11 धारावाहिक dilutions 250 माइक्रोन से शुरू और 0.05 माइक्रोन पर खत्म होता है. Dilutions की केवल 11 μl कोशिकाओं के 100 μl होते हैं कि थाली में वेल्स को जोड़ रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 2
तालिका 2. Luciferase संकेत डेटा readout और luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध का निर्धारण. डेटा तालिका एक सफल परिसर के लिए luciferase डेटा की एक विशिष्ट सेट से पता चलता है. टेबल भी luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध और सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त गणना से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 3
तालिका 3. रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण डेटा तालिका. भाग ए. Kaleidagraph में luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध बनाम इस्तेमाल किया एकाग्रता सीमा रेखांकन उपयुक्त निषेध घटता उत्पादन होगा. पार्ट बी, निषेध घटता 3 पैरामीट्रिक द्वारा परिभाषित कर रहे हैंsigmoidal समारोह और रेखीय प्रतिगमन द्वारा डेटा के लिए फिट 18 का विश्लेषण करती है. इस डेटा तालिका तो 50%, जैसे आईसी 50 और सीसी 50 से वायरस एकीकरण और सेलुलर cytotoxicity को बाधित करने के लिए आवश्यक दवा सांद्रता की गणना करने के लिए माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

हम cytotoxicity के लिए और गुम्मट और दवा एचआईवी -1 प्रतिरोधी दोनों की प्रतिकृति को बाधित करने की क्षमता के लिए स्क्रीन यौगिकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक त्वरित, कुशल, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परख का वर्णन. जल्दी यौगिकों की पहचान और उनकी प्रभावकारिता और cytotoxicity का परीक्षण करने की क्षमता एचआईवी -1 के खिलाफ नए और बेहतर दवाओं के विकास में महत्वपूर्ण है. नेतृत्व यौगिकों की पहचान हो जाने के बाद, नेतृत्व परिसर के अनुरूप उत्पादन किया है और एक ही परख का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. परख अपेक्षाकृत सरल है. उपयोगकर्ता सबसे आम समस्याओं (विषाक्त यौगिकों, वेक्टर स्टॉक के साथ समस्याओं) का निदान करने की अनुमति है कि दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. कोई गयी परिसर के साथ कुओं की तीन प्रतियों सेट का उपयोग वायरल संक्रमण हो गई है कि पता चलता है. cytotoxicity एक स्वतंत्र परख में मापा जाता है तथ्य यह है कि वायरल प्रतिकृति पर एक विशेष प्रभाव के रूप में cytotoxicity के कारण luciferase में कमी बदल बचा जाता है.

महत्वपूर्ण कदमकोशिकाओं समान रूप से कुओं में से प्रत्येक के लिए वायरस का एक ही राशि जोड़ने के लिए, और luciferase गतिविधि को मापने, कुओं परीक्षण किया जाना यौगिकों की उचित सांद्रता है कि, कुओं में वितरित कर रहे हैं इतना है कि प्रोटोकॉल में प्लेटें तैयारी कर रहे हैं सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों का निर्धारण.

परख, सुरक्षित मात्रात्मक, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. वेक्टर प्रतिकृति दोषपूर्ण है क्योंकि परख सुरक्षित है. यह सही है और आसानी से assayed किया जा सकता है जो luciferase व्यक्त करता है कि एक दौर वेक्टर, पर आधारित है क्योंकि परख मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. एक बहु दौर वायरस नकल परख में, मापा आईसी 50 वायरल जीवन चक्र की संख्या पर निर्भर करता है; assays के गुम्मट और काफी अलग प्रतिकृति क्षमता हो सकता है कि दवा प्रतिरोधी वायरस दोनों को शामिल करते हैं तो यह एक विशेष समस्या है.

कई एंजाइमी assays कर सकते हैं कि वहाँ पहले सूचित किया गया हैमें inhibitors के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जा. एकीकृत डीएनए को मापने के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी को शामिल assays अधिक श्रम गहन और 36, 37 महंगा दोनों, शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन (ओं) की आवश्यकता होती है, और सामान्य रूप में, कर रहे हैं. यह अन्य वायरल एंजाइमों (आर टी और प्रोटीज) पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के लिए enzymatic assays का उपयोग करने के लिए संभव है, प्रत्येक एंजाइम का अपना परख प्रणाली की आवश्यकता है. एक दौर वेक्टर परख, वर्णित के रूप में, आरटी inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए, संशोधन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसा ही एक परख protease inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, एक protease अवरोध परख में, यौगिकों वैक्टर का उत्पादन किया जाता कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए. एक संबंधित परख, विभिन्न कोशिकाओं और वैक्टर का उपयोग, भी लिफाफा (लि) और एचआईवी प्रवेश संलयन inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्त में, परख स्वचालित रोबोट dispensers के साथ, एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, परख WT और एम के खिलाफ यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैutant एचआईवी. हालांकि, इस तथ्य परख डेटा की व्याख्या में एक सीमा तक वायरल जीवन चक्र अंक के विभिन्न चरणों में कार्य करता है कि एचआईवी प्रतिकृति के एक अवरोध का पता लगा सकते. अपने आप से परख जीवन चक्र में कदम एक यौगिक द्वारा अवरुद्ध है जो परिभाषित नहीं करता है. इस सवाल उठता है, यह इसके अलावा assays 38 के समय का उपयोग करके हल, और शुद्ध पुनः संयोजक वायरल प्रोटीन के खिलाफ यौगिक परीक्षण के द्वारा किया जा सकता है.

दुर्भाग्य से, विरोधी एचआईवी दवाओं की सफलता के बावजूद, प्रतिरोध और विषाक्तता दोनों के साथ समस्या अभी भी वहाँ हैं. एक प्रभावी विरोधी एचआईवी टीके के अभाव में मौजूदा दवा प्रतिरोधी म्यूटेंट के खिलाफ प्रभावी हो जाएगा, लेकिन यह भी वायरस के प्रसार को कम कर सकते हैं कि रोगनिरोधी दवाओं को विकसित करने के लिए कि नई चिकित्सकीय दवाओं के विकास के लिए न केवल एक की जरूरत है. विरोधी एचआईवी दवाओं के रोगनिरोधी उपयोग असंक्रमित लोगों का उपचार incudes हैं, इस दृष्टिकोण एल हैं कि दवाओं के विकास पर एक विशेष बोझ जगह होगीittle या कोई दीर्घकालिक विषाक्तता.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध NCI के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMSO Sigma D2650
DMEM Corning Cellgro 10-017
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System Perkin Elmer 6016941
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6016751
Dulbecco's PBS Gibco-Life Technologies-Invitrogen 14190-136
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices
KaleidaGraph Synergy Software
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate Thomas Scientific 12-566-26
Eppendorf Thermomixer Compact Sigma Aldrich T1442-1EA
Turbo DNase Ambion-Life Technologies-Invitrogen AM2238
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM Millipore SLAHA033SS
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit Perkin Elmer NEK050B001KT
HOS cells ATCC CRL-1543
TZM-bl cells NIH AIDS Reagent Program 8129
pNL4.3ΔEnv.LUC NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
VSV-G NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
SoftMax Pro Molecular Devices 0200-310

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इम्यूनोलॉजी अंक 86 एचआईवी cytotoxicity संक्रामकता luciferase दवा प्रतिरोध इंटिग्रेस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
एचआईवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और इंटिग्रेस inhibitors की तेजी से जांच
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Smith, S. J., Hughes, S. H. Rapid… More

Smith, S. J., Hughes, S. H. Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors. J. Vis. Exp. (86), e51400, doi:10.3791/51400 (2014).

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