Summary
ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。
Abstract
抗HIV薬の番号が承認されているが、毒性および薬剤耐性の問題が依然として存在する。これは、最小限の毒性で共通の薬剤耐性HIV-1株による感染を阻害することができる新しい化合物を同定する必要性を示している。ここでは、急速にWT及び突然変異体ウイルス株に対する化合物の細胞傷害性および有効性を決定するために使用できる効率的なアッセイを記載している。
所望の標的細胞株を96ウェルプレートに播種され、24時間のインキュベーション後、試験すべき化合物の逐次希釈液を添加する。これ以上の操作は、細胞性細胞傷害アッセイのために必要ありません。抗HIVために、ルシフェラーゼを発現するWTまたは薬物耐性HIV-1ベクターを細胞に添加されるか、所定量のアッセイ。細胞毒性は、ATP依存ルミネッセンスアッセイを用いて測定され、感染性に対する化合物の影響はlucifeの量を決定することによって測定される存在または推定阻害剤の非存在下で、RASE。
このスクリーニングアッセイの完了には4日かかり、多数の化合物を並行してスクリーニングすることができる。化合物は三連でスクリーニングされ、データは、標的化合物の非存在下での感染力/ ATPレベルに対して正規化される。この技術は、潜在的な抗HIV化合物の有効性および毒性の迅速かつ正確な測定を提供する。
Introduction
HIV-1ウイルスの生活環のいくつかの重要なステップを標的とする薬物の利用可能性が大幅にHIV-1感染の治療、および長期生存を改善した（高活性抗レトロウイルス療法、またはHAARTと呼ばれる）併用薬物療法につながっている患者の。典型的には2つのヌクレオシド系逆転写酵素（RT）阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシドRT阻害剤のいずれかの組み合わせを使用してHAARTは、現在、生涯条件1-5に致命的な疾患を変換した。しかし、ウイルス複製の持続抑制におけるHAARTの多くの成功にもかかわらず、それには限界がある。 HAARTは、HIVを根絶しないため、患者は治癒しないと治療が人生長いです。薬物毒性を持つと薬剤耐性株の出現には問題がある。抵抗は、HIVインテグラーゼ（IN）を対象に新たに承認された薬を含む承認された抗HIV薬、のすべてに発生する可能性があります。薬剤耐性はおそらくBECAを生じウイルス複製（3×10 -5の変異/塩基/複製サイクルの誤り率）6中に生じる自然突然変異の使用。変異が抗レトロウイルス薬のターゲットをコードする遺伝子で発生した場合、これらの変異の小さなサブセットは、薬剤へのウイルス株の感受性の減少につながる。薬剤耐性の発生を回避するために、薬物濃度は、完全にHIVの複製を抑制するレベルに維持されなければならない。治療計画への密着不良が問題を悪化させ、抵抗7-9の急速な発展につながることができます。薬物濃度が原因で、異なる吸収、代謝、分布、および排泄レベルに患者で異なりますが、高い薬物濃度は、毒性が10につながることができます。治療は、患者の生活のために続けているため、抗レトロウイルスの長期毒性について深刻な安全上の懸念がある。一般にHAARTで使用される抗レトロウイルスが有害作用を有することができるND副作用は人生は11から15を脅かしてきた発生率があった。患者が抵抗性と毒性の開発で発生する問題を効果的にほとんど、あるいは全くの長期的な毒性を持つウイルスの一般的な薬剤耐性株の複製を阻止する新薬を開発する必要性の根底にある。
これにより、迅速にウイルスの生活環に必須の手順を遮断する化合物をスクリーニングすることができるアッセイが必要とされている。ここでは、化合物および迅速かつ効率的にWTおよび薬剤耐性HIV株の両方の複製をブロックする能力の細胞毒性を評価するために使用することができる効率的なアッセイを記載している。我々が使用するアッセイは、患者16〜18から分離されたウイルスに薬剤耐性をスクリーニングするために開発されたアッセイに似ています。
アッセイは、HIV逆転写を遮断することができる化合物をスクリーニングするために改変することなく使用することができるが、我々はDESCRうIBE阻害IN評価するアッセイを使用して。 INは、細胞ゲノムへのウイルスDNA 19を挿入必須ウイルス酵素である。阻害剤で有望なの数が開発されていますが、そのうちのいくつかは現在、アイセントレス20、21（これもラルテグラビルやRALとも呼ばれます）の臨床試験を受けているし、最近では、Elvitegravirは（EVG）22とDolutegravir（DTG）23があったFDAが承認した。これらの化合物は、25 HIVおよびB細胞培養物中の患者24における非Bサブタイプの両方に対して活性である。ただし、RALを用いた治療は、薬剤耐性HIV-1変異体では、Y143R、N155H、およびG140S/Q148H 24、26〜31を含むために選択されます。 N155HとG140S/Q148Hはまた、これらの耐性変異に対して有効である鎖転移阻害剤（INSTIs）の第二世代を設計し、開発する必要性を強調しているEVGの有効性を減少させる。
Protocol
マスター株式の1。準備
- DMSO中でテストされる化合物のマスターストックを作る。 20 mMの標準濃度で在庫を準備します。
注：10mMの上記の任意の濃度を用いることができる。このアッセイを確認するための陽性対照として使用することができる化合物は、RAL、EVGおよびDTGが挙げられる。 - 確保化合物は、15秒間溶液を複数回ボルテックスし、室温で1時間インキュベートすることによりDMSOに溶解する。使用するまで-20℃の暗所で20 mMのストック溶液を保管してください。
化合物スクリーニングのための96ウェルプレートの2。準備
- 試験される細胞株（ 例えば、HOS又はTZM-blを）を選択し、（培地中で（4,000細胞/ウェル）を4×10 4細胞/ mlの密度でそれらの細胞を100μlのシード例えば、ダルベッコ改変イーグル又はDMEM培地5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、ペニシリン（50単位/ ml）を補充したプラスストレプトomycin）。
ウイルスストックの3。生成
（ 図1に示すように、ステップ1）、32-34、293細胞をトランスフェクトすることにより、VSV-G偽型HIVを産生する。
- トランスフェクションの前の日に、1.5×10 6細胞の密度で直径100mmの皿上にプレートした293細胞。
- リン酸カルシウム法35を使用し、VSV（pHCMV-G）の4μgの-トランスフェクションの日に、野生型または変異型のHIV（ΔLUCpNLNgoMIVR）の16μgの293細胞をトランスフェクト。
- 約リン酸カルシウム沈殿後6時間が追加され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回、293細胞を洗浄し、48時間新鮮な培地でインキュベートする。 [DMEM、5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、およびペニシリン（50単位/ ml）およびストレプトマイシン（50μg/ ml）を補充した]。
- 直径100mmから培地を除去して、上清を含有するウイルスを回収する皿、RTで30分間ターボDNaseで上清を治療し、感染アッセイにおいて調製に培地中の上清を希釈、45μmの孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタ処理、10分間3,000 rpmでの低速遠心分離により上清を明らかにする。 -80℃で、一定分量で、凍結したウイルス上清を保存する
注：上清中のp24の量は、HIV-1のp24酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて決定される。 p24の濃度は、試料中のウイルスの量を制御するために使用される。ウイルスの約500 ngの感染前の日に1.5×10 5細胞/皿の密度で直径60mmの皿上にプレートHOS細胞に添加される。インキュベーションの48時間後、細胞を収穫し、遠心分離により回収し、洗浄し、100μlのPBSに再懸濁した。発光レポーター遺伝子アッセイ試薬の等量を追加し、セクション5.4.1に記載したようにルシフェラーゼ活性を測定し5.4.2。ステップ4.6で説明したようにこのことから、ウイルスの適切な希釈を行うことができる。
96ウェルプレートに4。物のスクリーニング
三重に各化合物を選別し、結果を平均する。
注：ウイルス複製の各化合物の効果を、任意の化合物の非存在下で得られた複製のレベルに正規化することによって補正される。
- スクリーニングされる経験的な濃度範囲を決定する。
注：典型的には、11連続希釈を有するスクリーンは、カラム7連続希釈によってプレート画面カラムに化合物を添加することにより製造される、行によって化合物を添加することにより製造される。井戸のセット一連の化合物なしの制御のために予約しておく必要があります。また、1列または1行には、負/バックグラウンドコントロールとして動作するように空白のままにする必要があります。ウイルスが追加された場合に最後に、それは細胞の細胞傷害性または感染性アッセイであるか否かを決定するであろう。 - 準備する20 mM保存液から段階希釈。 （ 表1に示されるように）濃度が試験される濃度は経験的に決定された範囲に応じて選択される。最終濃度が100μMであることを行っている場合は、 すなわち 、1 mMのワーキングストックを作る、10倍の所望の最終濃度で培地中に希釈液を調製する。
注：50秒5〜10μM以上のICを有する化合物は通常、医薬品開発のための良い候補ではない。最初の検定では、唯一のWTベクターに対する化合物を試験する。効果的に、WTベクトルを阻害有望な化合物は、その後、薬剤耐性変異のパネルに対してテストされます。 - インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、三連のウェルに試験されるべき化合物の連続希釈物を加える（ 図1に示すように、ステップ2）。
注意：ウェルに加え、ボリュームは最終濃度の1/10の体積にする必要があります。このように、22μL/ウェル（最終容量Pを追加OSTウイルスのほかには、感染性アッセイのために220μL）です。細胞毒性アッセイのために、11μL/ウェルを（最終容量は110μL/ウェルである）を追加します。 - インキュベーターに96ウェルプレートを返す。性細胞傷害画面の場合は、37℃で96ウェルプレートを48時間インキュベートし、それ以上の操作はプロトコル4で必要とされていません。プロトコル5に進んで感染性アッセイのために、プロトコル4の指示に従って進んでください。
- 感染性試験のみ。解析対象となる化合物を用いた37℃で3時間培養した後、最低インキュベーターからプレートを取り外します。
注：これは、化合物がHIVベクターで感染の前に細胞に取り込まれることを可能にする。 - ウイルス33のストック希釈液を調製、34（通常は約1:3）、未処理細胞で0.2から1.5の相対ルシフェラーゼ量（RLU）との間のルシフェラーゼシグナルを生成すること。プレート全体はDILU、約10ミリリットルがかかりますテッドウイルス。 8または12マルチチャンネルピペッターのいずれかを使用して、各ウェルに100μlのウイルスを追加します。ネガティブ/背景コントロールウェルにウイルスを追加しないでください。 48時間、37℃のインキュベーターにプレートを返します。
注意：ウイルスの1時03分株式の希釈上清中のウイルス濃度は1.0ミリリットル中に約500 NGであることを示すP24アッセイに基づく0.2 -1.5のRLUの間のルシフェラーゼシグナルを生成し、典型的な希釈である。
5。準備と96ウェルプレートに細胞毒性と感染性の測定
- 井戸から培地を吸引除去する（メディアにおけるフェノールレッド、ルシフェラーゼ信号に干渉することができます）。端に取り付けられた200μlのピペットチップでガラスピペットを使用してください。メディアのトップでスタートし、徐々に井戸の底の角に向かって働いています。井戸の底にあまりにも多くの時間を費やすことはありませんか、細胞がうまくから削除することができます。
- 100μlのPBSを追加する0.5メートルで補充各ウェルに、MのMgCl 2。これは、細胞が乾燥しないように培地を除去した直後に行われる必要がある。
- 唯一の細胞毒性アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光ATP検出アッセイから基板緩衝液5mlを加える。 Oneバイアルを96ウェルプレートに十分である。
- 発光ATP検出アッセイからの各ウェルに細胞溶解緩衝液50μlを追加します。コンパクトサーモミキサーを用いて室温で5分間700rpmで96ウェルプレートを振る。
- ネガティブコントロール/バックグラウンドウェルを除く全てのウェルに再構成された発光ATP検出アッセイ試薬50μlを加える。コンパクトサーモミキサーを用いて5分間室温で700 rpmで振とうする。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でプレートをインキュベートする。
- マイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。
注意：ソフトマックスプロマイクロプレートルミノメータープログラムを開きます。必ずルミノメーターがルミを測定するように設定されていることを確認5回/ウェルの感度でnescence。
- 唯一の感染性アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光レポーター遺伝子アッセイから基質緩衝液10ミリリットルを追加。 Oneバイアルを各96ウェルプレートに十分である。
- 各ウェルに再構成された発光レポーター遺伝子アッセイ試薬を100μlを加える。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でインキュベートする。
- セクション5.3.3で実行されるようなマイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。
化合物について、CC 50およびIC 50値の6。決定
- Excelスプレッドシートにマイクロプレートルミノメーターからのルシフェラーゼデータを転送します。
- 平均と背景の両方の三重/制御信号データ中のルシフェラーゼのデータ。全濃度範囲の平均三重の信号から平均バックグラウンド/制御信号を差し引く。 <李は>背景は、それが阻害パーセントを決定するために任意の化合物の非存在下で、細胞毒性または感染性であるかどうか、活動に対する濃度範囲の平均信号を補正する標準化する。
注：パーセント阻害は、100を乗じた薬物の非存在下でのルシフェラーゼ活性で割った薬剤の存在下でのルシフェラーゼ活性として定義される。
- 経験的に決定された濃度範囲およびカレイダグラフにルシフェラーゼ活性の阻害率の両方を転送します。
- x軸とy軸上のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント上の濃度範囲でデータをプロット。
Representative Results
アッセイ（ 図1、ステップ1と2）が正常に実行された場合、ルシフェラーゼ値を表2に示したデータ似る必要な濃度範囲にわたってスキャンし;潜在的に強力な化合物は、左から右にルシフェラーゼ活性を増加させることが明らかになり、制御が最も高いルシフェラーゼ活性を有するべきである。ルシフェラーゼ活性は、濃度範囲にわたって0.1相対ルシフェラーゼ単位（RLU値）を超えない場合、これは通常、化合物は細胞を死滅させていることを示している。ルシフェラーゼデータは以上全ての連続希釈を横切る2.0のRLUに等しい場合、化合物は、試験した濃度でHIV-1感染を阻害することができなかった。
カレイダグラフ（ 表3、パートA）中のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント対化合物の濃度をプロットし、線形回帰分析を実行した後、トンのに同様の結果を生成する 表3に示すホース、パートB.
図1 HIV-1ウイルスストックおよび細胞傷害性およびシングルラウンド感染性アッセイのセットアップの調製ステップ1で、293T細胞がpNL4.3ΔEnv.LUCとVSV-Gでトランスフェクトするとウイルス34を生成するために48時間培養。それは感染性アッセイで使用されるまでウイルス（アリコートで-80℃で凍結）を採取し、格納されている。ステップ2では、HOS細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートした。次いで、細胞を3時間試験されるべき化合物の連続希釈物と共にプレインキュベートし、次いでウイルス（WTまたは薬剤耐性のいずれか）に感染している。 48時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ活性を測定する。
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表1。シリアル希釈プロトタイプをスクリーニング医薬品。より厳格なスクリーニングは、通常10μMで開始し、0.0005μMで終了11段階希釈を必要とする。連続希釈10倍を用意している。細胞100μl、各ウェル中のウイルスの100μL）があります。このボリュームで、これらの計算に続いて、段階希釈は、全体の96ウェルプレートの3行には十分でしょう。細胞毒性アッセイは、同様に調製される;しかし11段階希釈は、250μMで開始し、0.05μMで終了。希釈液のわずか11μLの細胞100μlを含んでいるプレートのウェルに添加されています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
表2。ルシフェラーゼ信号データの読み出し、ルシフェラーゼ活性の阻害率の決定。データテーブルは、成功した化合物について、ルシフェラーゼのデータの代表的なセットを示しています。表には、ルシフェラーゼ活性の阻害率とCC 50およびIC 50値を決定するために必要な追加の計算を示しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
表3。線形回帰分析データ表 。パートA。カレイダグラフにおけるルシフェラーゼ活性の阻害パーセントに対して使用される濃度範囲をグラフ化すると、適切な阻害曲線を生成する。パートBは 、阻害曲線をパラメトリック3によって定義されるシグモイド関数と線形回帰によってデータへのフィットが18を分析します。このデータテーブルは、その後、 例えば IC 50およびCC 50を 50％のウイルスの統合と細胞傷害性を阻害するのに必要な薬物濃度を計算するためには、Microsoft Excelと組み合わせて使用します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Discussion
我々は、細胞毒性およびWTおよび薬剤耐性HIV-1の両方の複製を阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用することができ、迅速、効率的、かつ再現可能なアッセイを記載している。迅速な化合物を同定し、それらの有効性及び細胞毒性を試験する能力は、HIV-1に対する新規かつ改良された薬物の開発に重要である。リード化合物が同定されると、リード化合物の類似体が生成され、同じアッセイを用いて試験することができる。このアッセイは、比較的簡単である。ユーザーは最も一般的な問題（毒性化合物、ベクターストックに関する問題）を診断することを可能に正と負の両方のコントロールがあります。添加していない化合物を三連のウェルのセットの使用は、ウイルス感染が発生したことを示している。細胞毒性は独立したアッセイで測定されているという事実は、ウイルス複製の特定の効果として、細胞毒性に起因するルシフェラーゼの減少を誤解避けることができます。
重要なステップ細胞が均一にウェルのそれぞれに同じ量のウイルスを加え、にルシフェラーゼ活性を測定し、ウェルを試験されるべき化合物の適切な濃度を有することを、ウェル中に分配されるようにプロトコルでプレートを準備しているCC 50およびIC 50値を決定します。
アッセイは、安全で、定量的、かつ再現性がある。ベクターが複製欠陥があるので、このアッセイは安全です。それが正確かつ簡便にアッセイすることができるルシフェラーゼを発現する単一ラウンドベクターに基づいているので、このアッセイは、定量的および再現可能である。マルチラウンドのウイルス複製アッセイにおいて、測定されたIC 50は、ウイルスのライフサイクルの数に依存する;アッセイは、WTと有意に異なる複製能力を有することができる薬剤耐性ウイルスの両方を含むとき、これは特に問題である。
いくつかの酵素アッセイはそれができ、以前にも報告されているIN阻害剤をスクリーニングするために使用される。統合されたDNAを測定するために、リアルタイムPCR技術を伴うアッセイは、より労働集約的であり、36、37高価で、精製された組換えタンパク質（複数可）を必要とし、一般的である。それは、他のウイルス酵素（RTおよびプロテアーゼ）に対する化合物の影響を測定する酵素アッセイを使用することが可能であるが、各酵素は、独自のアッセイシステムを必要とする。一周ベクターアッセイは、記載されるように、RT阻害剤をスクリーニングするために、修正することなく、使用することができる。同様のアッセイは、プロテアーゼインヒビターをスクリーニングするために使用することができる;しかしながら、プロテアーゼ阻害アッセイにおいて、化合物は、ベクターを製造するために使用される細胞に添加されなければならない。関連アッセイは、異なる細胞およびベクターを用いて、エンベロープ（ENV）及びHIV侵入融合阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。最後に、このアッセイは、自動化されたロボットのディスペンサーで、大規模に使用することができる。従って、アッセイは、WTおよびmに対する化合物の大きなライブラリーをスクリーニングするために使用することができるutant HIV。しかしながら、実際のアッセイでは、データの解釈に制限はウイルスのライフサイクルポイントの異なる段階で作用するHIV複製の阻害剤を検出することができる。単体でアッセイは、ライフサイクルのステップは化合物によりブロックされているかを定義していません。この疑問が生じた場合には、添加アッセイの38時間を使用することによって解決され、精製された組換えウイルスタンパク質に対して化合物を試験することにより得ることができる。
残念ながら、抗HIV薬の成功にもかかわらず、抵抗および毒性の両方に問題が残っています。有効な抗HIVワクチンの非存在下で、既存の薬物耐性変異体に対して有効であるだけでなく、ウイルスの拡散を低減することができる予防的な薬剤を開発するための新しい治療薬を開発するだけでなく、必要とされている。抗HIV薬の予防的使用は、感染していない人々の治療をincusの複数形の場合、このアプローチはリットルを有する薬物の開発に特別な負担を配置するittleあるいは全く長期の毒性。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、NCIの学内研究プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
| ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
| Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
| Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Aldrich | T1442-1EA | |
| Turbo DNase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
| Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
| Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
| pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
| VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
| SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |
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